Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính chống ung thư của các hợp chất indenoisoquinolin

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án đưa ra mục tiêu là thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B khi đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của mạch nối propyl còn vị trí thứ 3 là các dị vòng với hy vọng sẽ làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư. Sau đây là bản tóm tắt luận án.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính chống ung thư của các hợp chất indenoisoquinolin

A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Indenisoquinolin là lớp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo cơ chế ức chế topoisomerase I, một số dẫn xuất như Indotecan (5) và Indimitecan (6) đã được đưa vào nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II cho thấy: các hợp chất này có hoạt tính cao hơn so với thuốc chống ung thư hệ camptothecin, không gây hiệu ứng phụ, đặc biệt bền và không bị thủy phân vì không có vòng lacton [11,12,15,22,33] nên trong thời gian gần đây có rất nhiều công trình nghiên cứu về lớp chất này [10,18,19,27]. Những nghiên cứu gần đây về lớp chất indenoisoquinolin đã chỉ ra rằng nhóm thế ở vòng B tại vị trí nguyên tử Nitơ (N-6) là các nhóm aminopropyl, morpholinopropyl, imdazolopropyl cho khả năng gây độc tế bào rất tốt, trong đó có 2 thuốc đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II là Indotecan (5) và Indimitecan (6) [6,8,15,22,42]. Bên cạnh đó các chất chứa hợp phần của aminopropanol cũng được biết đến là các lớp chất cho nhiều hoạt tính sinh học lí thú như hoạt tính chống ung thư, chống sốt rét, kháng khuẩn, kháng nấm [74-77]. Trên cơ sở đó, luận án đã thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B khi đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của mạch nối propyl còn vị trí thứ 3 là các dị vòng với hy vọng sẽ làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư. Đồng thời luận án cũng thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới chứa nhóm thế giàu điện tử ở vòng B, với ý tưởng làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư thông qua các liên kết yếu của indenoisoquinolin với DNA và Top1 tại vị trí phân cắt của topoisomerase I [22,28,42-45,68]. Các indenoisoquinolin mục tiêu tổng hợp 2. Đối tượng và nhiệm vụ của luận án 2.1. Đối tượng nghiên cứu của luận án Tổng hợp các indenoisoquinolin mới chứa nhóm thế giàu điện tử ở vòng B, với ý tưởng làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư thông qua các liên kết yếu của indenoisoquinolin với DNA và Top1 tại vị trí phân cắt của topoisomerase I. 1
Tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B khi đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của mạch nối propyl còn vị trí thứ 3 là các nhóm thế chứa dị tố N, O, S với hy vọng sẽ làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư. Đánh giá hoạt tính chống ung thư của các hợp chất indenoisoquinolin tổng hợp được qua đó đưa ra những định hướng nghiên cứu tiếp theo. 2.2. Nhiệm vụ của luận án 2.2.1. Tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) 2.2.2. Tổng hợp các indenoisoquinolin trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) với các amin bậc 1 - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 thông qua phản ứng giữa hợp chất 59 với các arylamin. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 thông qua phản ứng giữa hợp chất 59 với các amin dị vòng thơm. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 thông qua phản ứng giữa hợp chất 59 với các amin bậc 1 có gốc hữu cơ mạch hở. - Tổng hợp các indenoisoquinolin 170 trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion với các α-amino axít. 2.2.3. Tổng hợp các indenoisoquinolin đi từ 6-allyl-5H-indeno[1,2- c]isoquinoline-5,11(6H)-đion. - Tổng hợp các hợp chất indenoisoquinolin 171 và 172. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 173 thông qua phản ứng giữa hợp chất 171 với các dị vòng no morpholin, piperidin, pyrrolidin. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 173 thông qua phản ứng giữa hợp chất 171 với 2-xyanoguaniđin và natri azua. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 173 thông qua phản ứng giữa hợp chất 171 với piperazin và các dẫn xuất piperazin. - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 174 thông qua phản ứng giữa hợp chất 171 với benzoimidazolthiol và dẫn xuất benzoimidazolthiol. 2.2.4. Tổng hợp các indenoisoquinolin đi từ 6-(2,3-đihydroxypropyl)- 5H-indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. - Tổng hợp chất 6-(2,3-đihydroxypropyl)-5H-indeno[1,2-c]isoquinoline- 5,11(6H)-đion (175). - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 176 thông qua phản ứng giữa hợp chất 175 với Metansunfonyl clorua, 4-Toluensunfonyl clorua - Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 177 thông qua phản ứng giữa hợp chất 175 với anhiđrit isobutyric, anhiđrit axetic. 2
2.2.5. Xác định hoạt tính gây độc tế bào của các hemiasterlin - Các indenoisoquinolin được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư thực nghiệm, tế bào ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma), tế bào ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma). 3. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã đã áp dụng các lý thuyết hóa học hữu cơ nâng cao để giải thích cơ chế của phản ứng tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen-5,11- đion và phản ứng tổng hợp indenoisoquinolin 169, 170. - Luận án đã thiết kế và tổng hợp thành công 32 hợp chất indenoisoquinolin mới, bao gồm: + 14 dẫn chất mới đi từ nguyên liệu là indeno[1,2-c]isochromen-5,11- đion. + 14 dẫn chất mới đi từ nguyên liệu là 6-allyl-5H-indeno[1,2- c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. + 4 dẫn chất mới đi từ nguyên liệu là 6-(2,3-đihydroxypropyl)-5H- indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. - Luận án đã quy kết được độ chuyển dịch của các proton và cacbon khung indenoisoquinolin trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và 13C-NMR. - Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 36 hợp chất indenoisoquinolin trên 2 dòng tế bào ung thư biểu mô (Kb) và ung thư gan (Hep G2), trong đó có 23 hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư khảo sát, có 12 hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh với giá trị IC50 < 5 µM. - Đã tổng hợp được 3 hợp chất indenoisoquinolin có giá trị IC50 tương đương chất chuẩn đối chứng Ellipticine: 169l IC50 = 1,82 µM (KB), 1,41 µM (Hep-G2), 173c IC50 = 1,67 µM (KB), 1,15 µM (Hep-G2), 173h IC50 = 1,51 µM (KB), 1,19 µM (Hep-G2). - Đã tổng hợp được 2 hợp chất indenoisoquinolin có giá trị IC50 nhỏ hơn chất chuẩn tham chiếu Ellipticine: 173a IC50 = 0,82 µM (KB), 0,47 µM (Hep-G2) 173i IC50 = 0,82 µM (KB), 0,69 µM (Hep-G2). 4. Bố cục của luận án Luận án có 155 trang bao gồm: Mở đầu: 3 trang Chương 1: Tổng quan 42 trang Chương 2: Thực nghiệm 51 trang Chương 3: Kết quả và thảo luận 58 trang 3
Kết luận: 1 trang Phần tài liệu tham khảo có 81 tài liệu về lĩnh vực liên quan của luận án, được cập nhật dến năm 2015. Phần phụ lục gồm 65 trang gồm các loại phổ của các chất tổng hợp được và dữ liệu X-ray tinh thể của hợp chất 171, 172 5. Phương pháp nghiên cứu Các chất được tổng hợp theo các phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại đã biết, có cải tiến và vận dụng thích hợp vào các trường hợp cụ thể. Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng phương pháp sắc kí cột và kết tinh lại. Cấu trúc của sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ như: IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, MS và X-ray crystal. B-NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Tổng quan gồm 42 trang, tổng kết tài liệu về tình hình nghiên cứu các phương pháp tổng hợp và hoạt tính chống ung thư của indenoisoquinolin được các tác giả trong và ngoài nước thực hiện. Chương 2. THỰC NGHIỆM Thực nghiệm gồm 51 trang, trình bày chi tiết về các phương pháp nghiên cứu, quy trình tổng hợp, tinh chế, các tính chất vật lý của các sản phẩm nhận được như: điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng và dữ liệu chi tiết các phổ MS, IR, 1HNMR, 13C NMR, HSQC, HMBC và X-ray crystal. 1. Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen- 5,11-đion (59) 2. Tổng hợp các indenoisoquinolin trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion với các amin bậc 1 3. Tổng hợp các indenoisoquinolin đi từ 6-allyl-5H-indeno[1,2- c]isoquinoline-5,11(6H)-đion. 4. Tổng hợp các indenoisoquinolin đi từ 6-(2,3-đihydroxypropyl)-5H- indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. 5. Xác định hoạt tính gây độc tế bào của các indenoisoquinolin. 4
O O O O H 4,0 ®.l NaOMe 0,079 ®.l p-TsOH + O OH MeOH/EtOAc (2:1), O Toluen, , 6h O O O 65°C, 6h O OH 59 56 57 0 C H 58 0 1,1 ®.l RNH2, OO nhiÖt ®é phßng, F ,6 C CH2Cl2 169a R = 4-metoxybenzyl DM CH 24h 169m R = methyl (11H)-yl)undecanoat 169b R = 3-metoxybenzyl 169n R = 3-carboxypropyl N R1 169c R = benzyl H2 169d R = 4-brombenzyl 169p R = 10-aminodecyl ®.l 169f R = 6-metoxypyridin-3-yl 170a R1 = hydro 1,3 170b R1 = isopropyl 169g R = pyridin-2-ylmetyl O O 170c R1 = Bezyl 169h R = furan-2-ylmetyl 170d R1 = 4-hydroxylbenzyl 169i R = prop-2-yn-1-yl 169j R = allyl 170e R1 = 3,4-dihydroxylbenzyl 169k R = 2-metoxyetyl H 169l R = 8-(N-Boc-amino)-3,6-dioxaoctanyl N C COOH N 169e R = 3- (N-Boc-N-metylamino)phenyl R1 R O O 170 169 O O 173a X= Morpholin-1-yl O 173b X= 4-metylpiperidin-1-yl 173c X= piperidin-1-yl OH 173d X= pyrrolidin-1-yl OH 173e X= 2-cyanoguanidyl N N X 173f X= azido N OCOR 173g X= 4-Boc-piperazin-1-yl O O 173h X= 4-methylpiperazin-1-yl O 177a R = isopropyl 173i X= piperazin-1-yl 177 177b R = Metyl 169j 173 173j X= 4-tosylpiperazin-1-yl (X = NR 1R2) 2,0 ®.l Br2 1,5 ®.l R1R2NH 1,2 ®.l (RCO)2O, CH2Cl2/H2O (50:1), 0- 3,0 ®.l Et3N 2,0 ®.l K2CO3 5 C, 12h CH2Cl2, rt, 2h axeton (DMF), 65°C, 12h O O O 3,0 ®.l K2CO3 CH3CN/H2O (40:1) 60° C,18h OH Br + OH N OH N Br N Br O O O 175 172 171 1,5 ®.l RSH 1,5 ®.l RSO 2Cl 2,0 ®.l K2CO3 CH2Cl2, 0°C, 4h axeton, 70°C, 12h O O OH OH N SR N OSO 2R 174a R = 1H-benzo[d]imidazol-2-yl O O 176a R = metyl 174b R = 5-metoxy-1H-benzo[d]imidazol-2-yl 176 176b R = 4-metylphenyl 174 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B. 5
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chiến lược tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B Indenisoquinolin là lớp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo cơ chế ức chế topoisomerase I, một số dẫn xuất như Indotecan (5) và Indimitecan (6) đã được đưa vào nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II cho thấy: các hợp chất này có hoạt tính cao hơn so với thuốc chống ung thư hệ camptothecin, không gây hiệu ứng phụ, đặc biệt bền và không bị thủy phân vì không có vòng lacton [11,12,15,22,33] nên trong thời gian gần đây có rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp về lớp chất này [10,18,19,27]. Trong đó, phương pháp tổng hợp indenoisoquinolin thông qua phản ứng của indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (16) với các amin bậc 1 thường được các nhà khoa học sử dụng vì chỉ qua ít bước phản ứng đồng thời thuận lợi trong việc tạo ra nhiều dẫn xuất khác nhau của indenoisoquinolin [1,2,4,12,13,15,28-33]. Với mục tiêu là tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B, có khả năng tạo ra nhiều tương tác giữa indenoisoquinolin với DNA, Protein và các cặp bazơ cơ sở tại vị trí phân cắt của topoisomerase I qua đó nâng cao khả năng ức chế và gây độc tế bào ung thư [22,28,42,44,45,68], luận án đã sử dụng phương pháp tổng hợp khung indenoisoquinolin thông qua phản ứng của indeno[1,2- c]isochromen-5,11-đion (16) với các amin bậc 1 đi từ nguyên liệu đầu tiên là phthalide và 2-cacboxybenzanđehit. Các amin bậc 1 (RNH2) được sử dụng để tổng hợp indenoisiquinolin ở đây là các amin có chứa gốc R là các vòng thơm, dị vòng thơm, các axít amin với hy vọng các chất tổng hợp được sẽ tạo ra nhiều tương tác trong phức hợp Top1-DNA- indenoisoquinolin. Đồng thời luận án cũng thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin thông qua phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11- đion (16) với các amin có gốc R chứa các trung tâm phản ứng quen thuộc như anken, ankin, axít cacboxylic, amin để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo nhằm tạo ra nhiều dẫn xuất indenoisoquinolin mới có hoạt tính sinh học lý thú. Trong các indenoisoquinolin mới có trung tâm phản ứng quen thuộc tổng hợp được, luận án đã chọn 6-allyl-5H-indeno[1,2-c]isoquinolin- 5,11(6H)-đion (169i) để thực hiện các phản ứng tổng hợp tiếp theo vì nhóm chức anken có thể thực hiện được nhiều phản ứng hóa học thuận lợi, đồng thời nhóm thế allyl ở vòng B của indenoisoquinolin còn đảm bảo mục tiêu của luận án là các nhóm thế đưa vào cách nguyên tử Nitơ của vòng indenoisoquinolin 3 nguyên tử cacbon. 6
Trên cơ sở đó, cùng kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy các nhóm thế ở vòng B tại vị trí nguyên tử Nitơ (N-6) là các nhóm aminopropyl, morpholinopropyl, imdazolopropyl cho khả năng gây độc tế bào rất tốt, trong đó có 2 hợp chất đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II là Indotecan (5) và Indimitecan (6) [6,8,15,22,42,44]. Do đó, luận án tiếp tục thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới, bằng cách đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của nhóm propyl còn vị trí thứ 3 là các dị vòng Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin, Piperazin, benzimidazolthio với hy vọng làm tăng khả năng tương tác của các nhóm thế ở vòng B của indenoisoquinolin với DNA và Top1 tại vị trí phân cắt của topoisomerase I. Ngoài ra, với mục tiêu là tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau chứa các dị tố cách nguyên tử N ở vòng indenoisoquinolin 3 nguyên tử cacbon luận án cũng đã thiết kế tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin mới từ 6-(2,3-đihydroxypropyl)-5H-indeno[1,2- c]isoquinolin-5,11(6H)-đion (175) với hy vọng các chất tổng hợp được sẽ cho nhiều hoạt tính sinh học lý thú. 3.2. Tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) Bước chìa khóa để tổng hợp indenoisoquinolin theo phương pháp mà chúng tôi lựa chọn đó là tổng hợp được Indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) các phản ứng tổng hợp được tóm tắt ở sơ đồ 3.2. Sơ đồ 3.2.1. Tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) Đầu tiên, là thực hiện phản ứng ngưng tụ giữa phthalide (57) và 2- cacboxybenzanđehit (56) trong sự có mặt của NaOMe, dung môi MeOH/EtOAc, tại nhiệt độ 65oC, trong 6h nhận được hợp chất trung gian 58. Hợp chất 58 được phản ứng với TsOH nhận được hợp chất lacton 59 với hiệu suất phản ứng đạt 58%. Hợp chất 59 thu được là chất rắn có màu vàng cam, có nhiệt độ nóng chảy là 258-259 oC. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 59, xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 8 proton của indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion ở vùng trường thấp từ 7,26-8,38 ppm. Tín hiệu doublet cộng hưởng tại 8,37 ppm với hằng số tương tác J = 8,0 Hz là đặc trưng của proton H-1. Tín hiệu doublet- doublet với hằng số tương tác J = 1,0 và J = 8,0 Hz tại 8,29 ppm là đặc trưng cộng hưởng của proton H-4. Một tín hiệu doublet khác cộng tưởng tại 7,59 ppm với hằng số tương tác J = 7,0 Hz là được quy kết cho proton 7
H-7. Ba tín hiệu cộng hưởng doublet-triplet của 3 proton bao gồm: proton ở vị trí H-2 cộng hưởng tại 7,80 ppm với hằng số tương tác J = 8,0 Hz, proton ở vị trí H-3 cộng hưởng tại 7,52 ppm với hằng số tương tác J = 8,0 Hz, proton ở vị trí H-9 cộng hưởng tại 7,41 ppm với hằng số tương tác J = 7,0 Hz. Hai proton còn lại của nhân indenoisoquinolin là H-8 và H-10 có tín hiệu cộng hưởng chồng lấp trong khoảng 7,45-7,48 ppm. Hình 3.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 59 Ngoài ra cấu trúc của hợp chất 59 còn được khẳng định bởi phổ cộng hưởng từ 13C-NMR, trên phổ xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 16 nguyên tử cacbon bao gồm tín hiệu của nhóm cacbonyl (C-11) tại δC 189,96 ppm, nhóm cacbonyl của vòng lacton tại δC 170,59 ppm (C-5). Tín hiệu tại δC 160,81 ppm (C-15) được quy kết cho cacbon thuộc vòng indeno nối với oxi vòng lacton, cùng 13 tín hiệu khác của vòng indeno[1,2- c]isochromen-5,11-đion Hình 3.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 59 8
Từ các dữ liệu phổ trên cùng các dữ liệu tham khảo [2,32,78] cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 59. Cơ chế hình thành sản phẩm 59 được giải thích như sơ đồ 3.2.2. Sơ đồ 3.2.2. Cơ chế tổng hợp indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) 3.3. Tổng hợp các indenoisoquinolin trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion với các amin bậc 1. Sau khi hợp chất indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) được tổng hợp, cho tiến hành phản ứng với các amin bậc 1 (RNH2) khác nhau thu được các indenoisoquinolin 169, 170. Cơ chế của phản ứng được giải thích như sau: Sơ đồ 3.3.1. Cơ chế hình thành các hợp chất indenoisoquinolin 169, 170 Các amin bậc 1 (R-NH2) được sử dụng để tổng hợp các indenoisoquinolin 169, 170 ở đây là các amin có chứa gốc R là các vòng thơm, dị vòng thơm, các axít amin với hy vọng các chất indenoisoquinolin mới tổng hợp được sẽ tạo ra nhiều liên kết hydro, liên kết Van-der-Waals, liên kết cộng hóa trị với DNA, Top1 và protein tại vị trí phân cắt của topoisomerase I [22,28,42,44,45,68]. Đồng thời hợp chất 59 cũng được thực hiện phản ứng cùng các amin với gốc R có chứa các trung tâm phản ứng quen thuộc như anken, ankin, axít cacboxylic, amin nhằm thực hiện các phản ứng hóa học tiếp theo để tạo ra nhiều dẫn xuất indenoisoquinolin mới có hoạt tính sinh học lý thú. 9
3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 với R là nhóm Aryl Các hợp chất có vòng benzen, có mật độ electron phân bố đồng đều thường có mối tương hỗ giữa các electron với các phân tử sát bên, đó chính là lực liên kết Van-der-Waals. Với ý tưởng làm tăng khả năng tương tác của indenoisoquinolin với DNA, Top1, Protein tại vị trí phân cắt thông qua các lực liên kết yếu như liên kết Van-der-Waals, luận án đã thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới với các nhóm thế ở vòng B chứa vòng benzen. Từ hợp chất 59, cho tiến hành phản ứng với các amin bậc 1 (R- NH2) có R là các gốc aryl như 4-metoxybenzylamin, 3- metoxybenzylamin, benzylamin, 4-bromobenzylamin, tert-butyl (3- aminophenyl)(metyl)carbamat thu được các hợp chất 169a, 169b, 169c, 169d, 169e có màu đỏ cam với hiệu suất từ 81% đến 90%. Cấu trúc của các hợp chất được chứng minh bằng phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR. Sơ đồ 3.3.2. Sơ đồ tổng hợp indenoisoquinolin 169a-e với R là nhóm Aryl Như vậy luận án đã tổng hợp được 5 dẫn xuất của indenoisoquinolin với các nhóm thế ở vòng B chứa vòng benzen 169a, 169b, 169c, 169d, 169e. Các chất này sẽ được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư ung thư biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư gan (Hep G2). 3.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 với R là các dị vòng thơm. Tiếp tục với mục tiêu tổng hợp indenoisoquinolin mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B chứa các dị tố N, O cách nguyên tử N ở vòng B của indenoisoquinolin 2 đến 3 nguyên tử cacbon luận án đã tiếp tục thực hiện phản ứng giữa hợp chất 59 với các amin bậc 1 (R-NH2) có R là các gốc dị vòng thơm như 5-amino-2-metoxypyridin, pyridin-2-ylmetanamin và furan-2-ylmetanamin thu được các hợp chất 169f , 169g, 169h với hiệu suất tương ứng là 83%, 86%, 83%. Cấu trúc của các hợp chất được chứng minh bằng phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR. Sơ đồ 3.3.3. Sơ đồ tổng hợp indenoisoquinolin 169f-h với R các dị vòng thơm. 10
Như vậy luận án đã tổng hợp được 3 dẫn xuất của indenoisoquinolin với các nhóm thế ở vòng B chứa các dị tố N, O cách nguyên tử N ở vòng B của indenoisoquinolin 2 đến 3 nguyên tử cacbon đó là hợp chất 169f-h. Các chất này sẽ được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư ung thư biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư gan (Hep G2). 3.3.3. Tổng hợp các dẫn xuất indenoisoquinolin 169 với R là gốc hữu mạch hở. Với mục tiêu tổng hợp được các indenoisoquinolin mới có có nhóm thế khác nhau ở vòng B chứa các trung tâm phản ứng quen thuộc như anken, ankin, axít cacboxylic, amin nhằm tạo ra nhiều dẫn xuất indenoisoquinolin mới có hoạt tính sinh học lý thú, phản ứng giữa hợp chất indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion (59) với các amin có gốc R là gốc hữu cơ mạch hở tiếp tục được thực hiện. Hợp chất 59 được phản ứng lần lượt với 3-aminoprop-1-in, 3-aminoprop-1-en, 2-metoxyetylamin, tert- butyl 2-(2-ethoxyethoxy)Etylcarbamat, metyl 11-aminoundecanoat, 4- aminobutanoic axít, 1,10-Điaminodecane thu được các hợp chất 169i , 169j, 169k, 169l , 169m, 169n, 169p với hiệu suất tương ứng là 81%, 92%, 96%, 86%, 82%, 81%, 80%. Sơ đồ 3.3.4. Sơ đồ tổng hợp indenoisoquinolin 169i-p với R là gốc hữu cơ mạch hở. Hợp chất 169i được tổng hợp khi cho indeno[1,2-c]isochromen-5,11- đion (59) phản ứng với 1,1 đương lượng 3-aminopropin trong dung môi CH2Cl2 tại nhiệt độ phòng trong 22 giờ thu được sản phẩm là chất bột có màu cam, có nhiệt độ nóng chảy là 226-227 oC. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 169i, xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một proton tại δH 2,49 ppm (1H, s, H-3’), một tín hiệu của nhóm metylen nối với Nitơ và cacbon lai hóa sp của nối ba tại δH 5,28 ppm (2H, s, H-1’). Cùng đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 8 proton khung indenoisoquinolin: Tín hiệu doublet cộng hưởng tại 8,62 ppm với hằng số tương tác J = 8,0 Hz là đặc trưng của proton H-1. Tín hiệu doublet với hằng số tương tác J = 8,0 Hz tại 8,31 ppm là đặc trưng cộng hưởng của proton H-4. Cùng hai tín hiệu doublet cộng tưởng tại 7,77 ppm và 7,56 ppm được quy kết cho proton H-7 và H- 10. Hai tín hiệu cộng hưởng triplet của 2 proton bao gồm: proton ở vị trí H-2 cộng hưởng tại 7,70 ppm với hằng số tương tác J = 8,0 Hz, proton ở 11
vị trí H-9 cộng hưởng tại 7,38 ppm với hằng số tương tác J = 7,0 Hz. Hai proton còn lại của nhân indenoisoquinolin là H-8, H-3 có tín hiệu cộng hưởng chồng lấp trong khoảng 7,43-7,47 ppm. Hình 3.3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 169i Trên phổ 13C-NMR của hợp chất 169i xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 19 nguyên tử cacbon, bao gồm tín hiệu đặc trưng của khung indenoisoquinolin như nhóm cacbonyl (C-11) tại δC 189,99 ppm, nhóm cacbonyl của vòng lactam tại δC 162,20 ppm (C-5), tín hiệu của cacbon thuộc vòng indeno nối với nitơ vòng lactam tại δC 156,16 ppm (C-15). Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu đặc trưng của cacbon ankin nối ba đầu mạch tại δC 74,32 ppm (C-3’), xuất hiện tín hiệu của cacbon trong liên kết ba còn lại tại δC 78,03 ppm (C-2’), xuất hiện tín hiệu của cacbon nhóm metylen nối với Nitơ và cacbon lai hóa sp của nối ba cộng hưởng tại δC 33,94 ppm (C-1’) cùng các tín hiệu đặc trưng của khung indenoisoquinolin cho phép khẳng định cấu trúc của 169i. Hình 3.3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 169i 12
Trên phổ HMBC của hợp chất 169i cho thấy sự tương tác của cacbon nhóm cacbonyl vòng lactam C-5 (δC 162,20) với proton nhóm metylen mạnh nhánh H-1’ (δH 5,27) và một proton vòng thơm H-4 (δH 8,31). Điều này cho thấy việc quy kết proton H-4 ở độ chuyển dịch δH 8,31 hoàn toàn hợp lý, kết quả này cũng cho thấy sự phỏng đoán vị trí proton H-4 có độ chuyển dịch ở từ trường thấp nhất trong các proton khung indenoisoquinolin (δH 8,61) ở tài liệu số tham khảo số 78 và số 2 cần được xem xét lại. Ngoài ra trên phổ còn xuất hện tín hiệu tương tác của cacbon C-15 (δC 154,94) với proton H-1’ (δH 5,27) và proton H-7 (δH 7,77), sự tương tác của cacbon nhóm cacbonyl C-11 (δC 189,99) với proton H-10 (δH 7,56). Các kết quả phân tích trên cùng các tín hiệu đặc trưng trên phổ 1H- NMR cho phép khẳng định độ chuyển dịch của proton H-4 (δH 8,31), H-7 (δH 7,77) , H-10 (δH 7,56), H-1 (δH 8,56). Hình 3.3.3. Phổ HMBC giãn của hợp chất 169i Hình 3.3.4. Phổ HMBC giãn vùng cacbon thơm của hợp chất 169i Ngoài các tín hiệu kể trên, phân tích phổ giãn HMBC vùng cacbon vòng thơm còn thấy xuất hiện tín hiệu tương tác của proton H-1 (δH 8,56) với C-14 (δC 123,13) và C-3 (δC 127,02); tương tác của proton H-4 (δH 8,31) với C-13 (δC 131,99) và C-2 (δC 133,79); tương tác của proton H-7 13
(δH 7,77) với C-17 (δC 134,49) và C-9 (δC 130,82); tương tác của proton H- 10 (δH 7,56) với C-16 (δC 136,50) và C-8 (δC 133,04). Điều đó cho thấy các quy kết hoàn toàn phù hợp. Các kết quả phân tích trên, cùng các kết quả trên HSQC cho thấy các quy kết độ chuyển dịch proton và cacbon trên cấu trúc phân tử hợp chất 169i hoàn toàn chính xác và phù hợp. Hình 3.3.5. Phổ HSQC giãn của hợp chất 169i Tương tự cấu trúc của các hợp chất 169j, 169k, 169l , 169m, 169n, 169p cũng được chứng minh. Như vậy luận án đã tổng hợp được 7 dẫn xuất của indenoisoquinolin với các nhóm thế ở vòng B chứa vòng chứa các trung tâm phản ứng quen thuộc như anken, ankin, axít cacboxylic, amin 169i, 169j, 169k, 169l , 169m, 169n, 169p. Các chất này sẽ được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư gan (Hep G2). Hợp chất 169j được chọn để thực hiện các phản ứng tiếp theo nhằm tạo ra các indenoisoquinolin có nhóm thế propyl ở vòng B tương tự giống cấu trúc vòng B của 2 thuốc Indotecan (5) và Indimitecan (6) . 3.3.4. Tổng hợp các indenoisoquinolin 170 trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion với các α-amino axít. Adina Ryckebusch và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất của indenoisoquinolin với mạch nhánh được tổng hợp là các este và amit của các axít amin khác nhau có độ dài n từ 2 đến 3 cacbon và đã phát hiện dẫn chất amit với axít amin Arginin (n = 2) và glyxin (n = 2) có hoạt tính ức chế topoisomerase II cao nhất [32]. Trên cơ sở đó luận án cũng đã tổng hợp các dẫn xuất của indenoisoquinolin 170 thông qua phản ứng giữa hợp chất 59 với các amin bậc 1 là các α-amino axít như: Glyxin, L-Valin, L-Phenyl alanin, L-Tyrosin, 3,4-đihydroxyphenylalanin thu được các hợp chất 170a, 170b, 170c, 170d, 170e với hiệu suất tương ứng là 88%, 86%, 85%, 81%, 81%. Cấu trúc của các hợp chất được chứng minh bằng phổ IR, 1 H-NMR, 13C-NMR. 14
Sơ đồ 3.3.5. Sơ đồ tổng hợp indenoisoquinolin 170a-e trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen-5,11-đion với các α-amino axít. Như vậy luận án đã tổng hợp được 5 dẫn xuất mới của indenoisoquinolin trên cơ sở của phản ứng giữa indeno[1,2-c]isochromen- 5,11-đion với các α-amino axít, hợp chất 170a-e. Các chất này sẽ được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư gan (Hep G2), đồng thời ở mạch nhánh vẫn còn nhóm chức cacboxyl đó cũng là cơ sở cho các hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm tạo ra các dẫn xuất khác nhau của indenoisoquinolin với hy vọng tìm ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú. 3.4. Tổng hợp các indenoisoquinolin đi từ 6-allyl-5H-indeno[1,2- c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. Như đã phân tích ở trên với ý tưởng thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới có nhóm propyl ở vòng B đồng thời đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của nhóm propyl, luận án tiếp tục tổng hợp các indenoisoquinolin mới khi cho 6-allyl-5H-indeno[1,2-c]isoquinolin- 5,11(6H)-đion (169i) phản ứng với brom, sản phẩm thu được tiếp tục cho phản ứng với các hợp chất dị vòng Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin, Piperazin, benzimidazolthio thu được các indenoisoquinolin 173, 174 như sơ đồ: 0 C 70 O H e, K R 3S on 3 t u i iv 2C ce eq equ A v 5 1. 2 Sơ đồ 3.4.1. Các indenoisoquinolin được tổng hợp đi từ 6-allyl-5H- indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion. 3.4.1. Tổng hợp các indenoisoquinolin 171, 172 Hợp chất 6-allyl-5H-indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion (169j) được thực hiện phản ứng với 2 đương lượng Br2, trong dung môi 15
CH2Cl2/H2O (50/1) ở nhiệt độ 0 oC - 5 oC. Sau 12 giờ thu được 2 hợp chất 6-(3-bromo-2-hydroxypropyl)-5H-indeno[1,2-c]isoquinolin-5,11(6H)-đion (171) và hợp chất 6-(2,3-đibrompropyl)-5H-indeno[1,2-c]isoquinolin- 5,11(6H)-đion (172) với hiệu suất tương ứng là 77% và 10%. Hợp chất 172 tổng hợp được dưới dạng tinh thể có màu đỏ tím, có nhiệt độ nóng chảy là 150-151 oC. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 172 xuất hiện đầy đủ tín của 8 proton khung indenoisoquinolin ở vùng trường thấp và 5 proton mạch nhánh ở vùng trường cao hơn. Tín hiệu cộng hưởng của một proton với hằng số tương tác lớn tại δH 5,16 ppm ( 1H, dd, J = 6,0; 14,0 Hz) được quy kết cho proton Ha-1’ của nhóm metylen mạch nhánh gắn với nhân indenoisoquinolin, hai tín hiệu doublet doublet cộng hưởng tại δH 4,00 ppm (1H, dd, J = 4,5; 11,0 Hz) và δH 3,91 ppm (1H, dd, J = 6,0; 11,0 Hz) với hằng số tương tác lớn được quy kết cho proton Ha-3’ và Hb-3’, tín hiệu của hai proton Hb-1’và H-2’ cộng hưởng chồng lấp tại δH 4,91-4,81 (2H, m). Tín hiệu cộng hưởng của 8 proton khung indenoisoquinolin cũng được thấy rõ trên phổ tại các độ chuyển dịch: δH 8,75 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), δH 8,34 ppm (1H, dd, J = 0,5; 8,0 Hz, H-4), δH 7,76 ppm (1H, dt, J = 1,0; 8,0 Hz, H-2), δH 7,72 ppm (1H, d, J = 7,5 Hz, H-7), δH 7,66 ppm (1H, d, J = 1,0; 7,0 Hz, H-10), δH 7,50 ppm (1H, dt, J = 1,0, 8,0 Hz, H-3), δH 7,48 ppm (1H, dt, J = 1,0, 7,5 Hz, H-8), δH 7,42 ppm (1H, t, J = 7,0 Hz, H-9). Hình 3.4.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 172 Phổ 13C-NMR của hợp chất 172 xuất hiện đẩy đủ tín hiệu cộng hưởng của 19 nguyên tử cacbon. Trong đó tín hiệu của nhóm cacbonyl xeton (C- 11) cộng hưởng tại 190,46 ppm. Nhóm cacbonyl amit (C-5) cộng hưởng tại 163,68 ppm. Tín hiệu tại cộng hưởng của cacbon tại δC 49,21 ppm được quy kết cho cacbon của nhóm (Br)CH (C-2’), tín hiệu của cacbon nhóm 16
CH2 nối với nhân indenoisoquinolin cộng hưởng tại δC 48,08 ppm (C-1’) cùng tín hiệu cộng hưởng tại δC 34,81 ppm (C-3’) được quy kết cho cacbon của nhóm (Br)CH2. Qua các dữ kiện vừa phân tích cùng các dữ liệu phổ chi tiết ở trên cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 172. Ngoài ra cấu trúc của hợp chất 172 còn được khẳng định bởi phương pháp nhiễu xạ tia X tinh thể (X-ray crystal). Các số liệu ghi, chụp (data collection) cùng các dữ liệu tính toán và tối ưu hóa (data solution & refinement) đã chỉ ra rằng hợp chất 172 có công thức phân tử là C19H13Br2NO2 , khối lượng phân tử là 447.12, trong phân tử có hai nguyên tử brôm xuất hiện với độ dài liên kết Br(2) - C(2) là 1,954 0A, Br(1) - C(1) là 1,945 0A đặc trưng cho liên kết C-Br dẫn xuất halogen, cùng các góc liên kết C(3) -C(2)-Br(2) là 105,90, C(1) - C(2)-Br(2) là 110,060 , C(1) - C(2)-C(3) là 113,70, C(2) - C(1)-Br(1) cho thấy Cacbon C(1) , C(2) , C(3) đều là Cacbon lai hóa sp3. Từ các các dữ liệu phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, X-ray đơn tinh thể cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 172. Hình 3.4.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 172 Hình 3.4.3. Mô hình cấu trúc phân tử của hợp chất 172 theo phương pháp X-ray đơn tinh thể 17
Tương tự cấu trúc của hợp chất 171 cũng được khẳng định dựa trên kết quả từ các dữ liệu phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, X-ray crystal. Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất 171, ngoài các tín hiệu đặc trưng của 8 proton vòng indenoisoquinolin giống hợp chất 172 còn xuất hiện tín hiệu đầy đủ của 5 proton mạch nhánh bao gồm hai tín hiệu của 2 proton nhóm metylen mạch nhánh gắn với nhân indenoisoquinolin cộng hưởng với hằng số tương tác lớn tại δH 4.70 (1H, dd, J = 4,5, 14,5 Hz, Ha-1’) và 4.60 (1H, dd, J = 8.0, 14.5 Hz, Hb-1’), một tín hiệu cộng hưởng của proton H-2’ cộng hưởng tại δH 4.36-4.39 (1H, m) cùng hai tín hiệu proton H-3’ cộng hưởng tại δH 3,67 (2H, dd, J = 5,5; 7,5 Hz, 2H-3’). Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của hợp chất 171 còn xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 19 cacbon bao gồm 16 tín hiệu cộng hưởng của vòng indenoisoquinolin tương tự hợp chất 172 và tín hiệu của 3 cacbon mạch nhánh cộng hưởng tại δC 68,5 ppm (C-2’); δC 49,2 ppm (C-1’); δC 36,3 ppm (C-3’). Hình 3.4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 171 Cấu trúc của hợp chất 171 một lần nữa được khẳng định bởi các dữ liệu X-ray crystal. Các số liệu ghi chụp, tính toán và tối ưu hóa cho thấy hợp chất 171 có công thức phân tử là C19H14BrNO3, khối lượng phân tử là 384.22, trong phân tử chỉ có một nguyên tử brôm xuất hiện thêm một nguyên tử Oxi với độ dài liên kết O(2) - C(2) là 1,426 0A đặc trưng cho liên kết C-O ancol cùng các góc liên kết O(2) - C(2)-C(3) là 108,570, O(2) - C(2)- C(1) là 113,420 và các dữ liệu tương tự khác giống hợp chất 172 cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 171. 18
Hình 3.4.5. Mô hình cấu trúc phân tử của hợp chất 171 theo phương pháp X-ray đơn tinh thể 3.4.2. Tổng hợp các indenoisoquinolin 173 chứa các nhóm thế dị vòng no. Những nghiên cứu của Mark Cushman và cộng sự cho thấy các nhóm thế ở vòng B tại vị trí nguyên tử Nitơ (N-6) là các nhóm aminopropyl, morpholinopropyl, imdazolopropyl cho khả năng gây độc tế bào rất tốt, trong đó có 2 hợp chất đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II là Indotecan (5) và Indimitecan (6) [6,8,15,22,42,44]. Trên cơ sở đó luận án là đã thiết kế tổng hợp các indenoisoquinolin mới, khi đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của nhóm propyl còn vị trí thứ 3 là các dị vòng no Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin. Với hy vọng nhóm hydroxyl đưa vào sẽ tăng khả năng tương tác của các nhóm thế ở vòng B của Indenoisoquinolin với DNA và Top1 tại vị trí phân cắt của topoisomerase I. Các dẫn xuất indenoisoquinolin 173 chứa các dị vòng no được tổng khi cho hợp chất 171 phản ứng với với 1,5 đương lượng các amin vòng no như Morpholin, 4-MetylPiperidin, Piperidin, Pyrrolidin trong dung môi axeton ở nhiệt độ 65 oC cùng 2 đương lượng chất xúc tác K2CO3 thu được các hợp chất 173a , 173b, 173c, 173d với hiệu suất tương ứng là 73 %, 78 %, 76%, 68 %. Cấu trúc của các hợp chất được chứng minh bằng phổ IR, 1H-NMR, 13 C-NMR. O O 1.5 ®.l XH 173a X= Morpholin-1-yl OH 2 ®.l K2CO3 OH 173b X= 4-metylpiperidin-1-yl 173c X= piperidin-1-yl N Br N X axeton, 65o C 173d X= pyrrolidin-1-yl O 171 O 173a-d 19
Sơ đồ 3.4.2. Tổng hợp các indenoisoquinolin 173 chứa các nhóm thế dị vòng no. Hợp chất 173a tổng hợp được là chất rắn có màu vàng chanh, có nhiệt độ nóng chảy 227-228 oC. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 173a xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng của 21 proton bao gồm 8 proton vòng indenoisoquinolin, 8 proton vòng Morpholin và 5 proton mạch nối. Tín hiệu của 5 proton mạch nối giữa nhân indenoisoquinolin và vòng Morpholin bao gồm hai tín hiệu cộng hưởng của 2 proton Ha-1’ và Hb-1’ của nhóm metylen gắn với nhân indenoisoquinolin cộng hưởng tại δH 4,75 ppm ( 1H, dd, J = 5,0; 14,5 Hz) và δH 4,51 ppm (1H, dd, J = 6,5, 14,5 Hz), một tín hiệu cộng hưởng của proton H-2’ cộng hưởng tại δH 4,20 ppm (1H, m) cùng tín hiệu của hai proton H-3’ cộng hưởng tại δH 2,51-2,49 ppm (2H, m, 2H-3’). Tín hiệu của 8 proton vòng Morpholin cộng hưởng chồng lấp tại hai độ chuyển dịch khác nhau bao gồm 4 proton H-2”, H-4” cộng hưởng tại δH 3.79-3.68 ppm (4H, m) và 4 proton H-1”, H-3” cộng hưởng tại δH 2.67-2.60 ppm (4H, m). Tín hiệu cộng hưởng của 8 proton khung indenoisoquinolin cũng được thấy rõ trên phổ tại các độ chuyển dịch: δH 8,71 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1); δH 8,31 ppm (1H, d, J = 8,0 Hz, H-4); δH 7,93 ppm (1H, d, J = 7.5 Hz, H-7); δH 7,72 ppm (1H, td, J = 1,0; 7,0 Hz, H-2); δH 7,60 ppm (1H, d, J = 7,0 Hz, H-10); δH 7,43-7,47 ppm (2H, m, H- 3, H-8); δH 7,37 ppm (1H, t, J = 7,5 Hz, H-9). Hình 3.4.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất 173a 20