Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao; Tách chiết và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt tính cao đã được phân lập;

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ CHỨA DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường Mã số: 9.52.03.20 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hà Nội, 2018
Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Người hướng dẫn khoa học 2: Phản biện 1:……………………….. Phản biện 2:……………………….. Phản biện 3:………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi…. giờ……ngày……..tháng………năm ……. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ; - Thư viện Quốc gia Việt Nam.
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất trong đó có các chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người tạo nên ngày càng tăng, gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe con người và môi trường. Ở các nước đang phát triển như Việt Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công nghiệp, y dược và các ngành sản xuất khác không có khả năng kiểm soát đã gây nên những hậu quả nghiêm trọng với môi trường và con người. Ngoài ra chất diệt cỏ chứa dioxin tồn lưu từ chiến tranh sau hơn 40 năm và các chất dioxin hình thành trong quá trình phát triển công nghiệp hiện vẫn đang tiếp tục gây nhiều hậu quả nghiêm trọng cho môi trường sinh thái và con người ở Việt Nam. Việt Nam là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học nằm trong top 10 của thế giới, đặc biệt là đa dạng vi sinh vật. Có nhiều loài vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác nhau. Hai họ oxidoreductive và peroxidase bao gồm các loại enzyme có nhiều ứng dụng mang hiệu quả cao trong các lĩnh vực kinh tế và bảo vệ sức khỏe con người. Trong đó laccase không chỉ có hoạt tính cao mà còn có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy tự do với sự hỗ trợ của chất gắn kết hay hệ chất gắn kết (mediator) cho nên laccase được quan tâm nhiều hơn cả. Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên là “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” đã được tiến hành.
2 2. Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase- like từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa; Đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn nhằm định hướng áp dụng trong hoạt động quốc phòng. 3. Nội dung thực hiện Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao; Tách chiết và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt tính cao đã được phân lập; Nghiên cứu các đặc tính hóa-lý, hóa - sinh cơ bản của laccase, laccase-like đã được tinh sạch; Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like; Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4- D, 2,4,5-T tinh khiết và có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa bởi laccase, đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase; Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase; CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 1.1.1. Giới thiệu chung về laccase
3 Laccase đã được quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm với các nội dung: nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử và cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu về gene, protein và đặc điểm hóa - lý của laccase. Qua đó cho thấy laccase là đối tượng đã được nghiên cứu khá chi tiết. Đến thời điểm hiện nay, có ít công trình sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi sinh tổng hợp laccase trong xử lý ô nhiễm môi trường nói chung và thuốc nhuộm, các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy nói riêng, vì việc lựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccase có khả năng cao không đơn giản và nghiên cứu đòi hỏi nhiều công sức. Đây là cơ hội cho các nghiên cứu nhằm tìm kiếm con đường để tạo nên công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường nói chung và công nghệ xử lý nước thải dệt nhuộm và môi trường ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin nói riêng. Kết quả các nghiên cứu về khả năng của laccase cần tiếp tục thực hiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa dạng của chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase nói chung và trên phương diện địa lý, hệ sinh thái khác nhau nói riêng. 1.1.2. Giới thiệu về laccase-like Trong quá trình sinh trưởng của mình, các chủng nấm ngoài khả năng sinh tổng hợp các enzyme có bản chất protein thì chúng còn có khả năng khác nữa là sinh tổng hợp một số tác nhân sinh học có khối lượng phân tử thấp, tên gọi các chất này phụ thuộc vào nguồn gốc nó được sinh ra. Các tác nhân này có khả năng oxy hóa giống laccase nhưng đặc điểm hóa-lý thì rất khác. Các hợp chất này không có cấu tạo protein mà chỉ là các đoạn peptides có hoạt tính oxy hóa cao.
4 Một số nghiên cứu ở Việt Nam đã phát hiện ra chất có hoạt tính sinh học như trên được sinh tổng hợp từ các chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, tuy nhiên nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu đặc tính hóa-lý cũng như khả năng ứng dụng của chúng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy các hợp chất hữu cơ mạch vòng hầu như là rất ít công bố. Vì vậy, để phân biệt với những tên gọi và thuật ngữ của các nghiên cứu trước đây và thuận tiện trong việc gọi tên trong nghiên cứu của Luận án, hoạt chất này sẽ được gọi là laccase-like. 1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và các công nghệ xử lý Phần này nêu đặc điểm của nước thải dệt nhuộm, các công nghệ hiện nay đang được sử dụng để xử lý nước thải dệt nhuộm. Trong đó tập trung tổng quan các nghiên cứu về ứng dụng của laccase, vi sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý loại màu các loại thuốc nhuộm. 1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý Phần này nêu hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại các "điểm nóng" tại Việt Nam, nhấn mạnh hiện trạng ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa. Tổng hợp các công nghệ đã được thống kê trên thế giới và Việt Nam trong xử lý môi trường ô nhiễm dioxin. Tập trung tổng hợp các nghiên cứu sử dụng enzyme ngoại bào nói chung và laccase nói riêng trong xử lý các hợp chất hữu cơ và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chủng vi sinh vật
5 Các chủng nấm đảm được thu thập và phân lập ở độ cao trên 600m từ rừng Quốc gia Ba Vì và tại khu vực Ba Trại xung quanh khu vực chân núi Ba Vì thành phố Hà Nội; Các chủng xạ khuẩn được thu thập từ lô xử lý sinh học đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu vực XĐ-1 sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Các chủng xạ khuẩn được thu thập từ đất ô nhiễm khu vực ô nhiễm mới Tây - Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Chủng nấm đảm FBD154 được phân lập từ khu vực rừng Quốc gia Bidoup-Núi Bà, Lâm Đồng và nấm sợi FNBLa1 được phân lập từ rơm mục ở Ninh Bình trong bộ sưu tập giống của nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học. 2.1.2. Đối tượng thử nghiệm Các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết tiêu chuẩn phân tích (PA) của Sigma và đồng loại độc 2,3,7,8-TCDD; Đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin được thu thập từ 2 khu vực của sân bay Biên Hoà, có độ độc trung bình khoảng 20.000 ngTEQ/kg; Một số thuốc nhuộm tổng hợp thuộc 2 nhóm azo và anthraquinone; Các loại thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được thu thập từ Nhà máy X20/Tổng Cục Hậu cần. 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu Môi trường Gause M; Dịch chiết khoai tây (DCKT); Môi trường PDA/B; Môi trường Czapeck; Môi trường PDB-DT; Môi trường MEG; Môi trường Vis; Môi trường TSH1; 2.2. Phương pháp nghiên cứu Do thực hiện nhiều thực nghiệm để xác định đặc tính, khả năng của laccase, laccae-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccae-like trong loại màu thuốc nhuộm và phân
6 hủy chất diệt cỏ/dioxin nên sơ đồ thực nghiệm được mô tả bằng sơ đồ ở Hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu 2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 2.2.2. Phân loại vi sinh vật 2.2.3. Phương pháp hóa – sinh 2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm 2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 2.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsolf excel/Microsoft office 10 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao Đã thu thập được 45 mẫu nấm đảm có trong tự nhiên và trong đất có gỗ mục tại khu vực lấy mẫu. Sau 4 ngày nuôi cấy, 22 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, mịn và tạo vòng nâu
7 đỏ trên môi trường có chứa chất chỉ thị guaiacol. Hoạt tính laccase in situ được xác định ngay sau khi mẫu nấm được đưa về phòng thí nghiệm đã được tiến hành. Kết quả thu được chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Kết quả cho thấy có khoảng 16 mẫu nấm thu thập được ở rừng Quốc gia Ba Vì sinh tổng hợp laccase. Dựa vào kết quả đo hoạt tính laccase in situ và khả năng sinh trưởng. Dựa vào kết quả đo hoạt tính laccase in situ và khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, chủng FBV40 đã được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, đặc tính enzyme, khả năng loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin. Như vậy xét trên đặc điểm mẫu, hình thái khuẩn lạc, bào tử và trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 (đã được đăng ký trình tự trên GenBank với mã số MG243365) được xét vào chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40. Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40
8 3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like Từ nguồn đất ô nhiễm, 8 chủng xạ khuẩn đã được phân lập trong đó có 2 chủng là (XKBHN1, XKBHN2) từ đất khu vực Tây - Nam và 6 chủng là XKBiR1, XKBiR2, XKBiR3, XKBiR4, XKBiR929 và XKBiR930 từ đất nguyên thủy (trước khi xử lý khu vực Z1) ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa. Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA, chủng XKBHN1, XKBiR929 được xếp vào chi Streptomyces và được đặt tên Streptomyces sp. XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929. Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 3.1.3.2. Sinh trưởng của XKBHN1 và XKBiR929 trong môi trường chứa chất hữu cơ có clo và các hydrocacbon có vòng thơm (PAHs) Sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 30ºC, lắc ở 120 vòng/phút, hai chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng
9 mạnh trên môi trường có chứa các chất ô nhiễm DCĐ; 2,4,5-T; 2,4-D; DBF và PAHs. Chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase- like với hoạt tính cao nhất là 867 U/l trong môi trường Gauss M chứa 200 ppm PAHs sau 15 ngày nuôi. Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến khả năng sinh tổng hợp laccase-like, cũng như khả năng phân hủy chuyển hóa của laccase-like từ các đại diện thuộc chi Streptomyces trên môi trường chứa các chất ô nhiễm như đã được sử dụng trong nghiên cứu này. 3.2. Tinh sạch và các đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase- like tinh sạch 3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 Điện di đồ cho ta thấy enzyme được tinh sạch có chất lượng tốt, hình thành các băng đơn đồng nhất, kết quả chỉ ra rằng có hai băng protein thu được ở kích thước 55 kDa và 60 kDa và gọi là Lac1 và Lac2. Khối lượng của hai isozyme laccase của chủng nấm thu được là phù hợp với khoảng khối lượng đã được công bố về laccase và kết quả nghiên cứu của luận án cũng đã bổ sung thêm thông tin vào bộ sưu tập isozyme laccase của chủng nấm thuộc chi Rigidoporus. 3.2.2. Tinh sạch laccase-like từ xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929 Khi xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel polyacrylamide 15-20% (SDS-PAGE) để kiểm tra độ tinh sạch của enzyme. Điện di đồ không thấy xuất hiện “protein” được tinh sạch. Có thể nhận định trọng lượng phân tử của laccase-like này nhỏ hơn 10kDa. Cũng như đã đề cập ở trên, laccase-like là sản phẩm được tạo ra bởi các chủng xạ khuẩn không phải là protein Vì, sau khi đun sôi dịch nuôi cấy vài giờ vẫn quan sát
10 thấy khả năng oxy hóa ABTS sang màu xanh. Đây có thể là chất trao đổi có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ vòng thơm, để khẳng định điều này sẽ cần rất nhiều nghiên cứu chi tiết tiếp theo để tìm hiểu rõ hơn về bản chất hóa học và hoạt động xúc tác của chất được sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn XKBiR929. 3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch 3.2.3.1. Đặc tính hóa-lý của laccase tinh sạch a) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền của laccase Kết quả thu được cho thấy, ở pH 3 thì cả Lac1 và Lac2 đều đạt hoạt tính cao nhất. Lac1 mất hoàn toàn mất hoạt tính ở giá trị pH bằng 1, 7, 8, và 9, trong khi đó đối với Lac2 là ở pH 1 và 8. Về độ bền hoạt tính của laccase tinh sạch, đối với Lac1 ở pH 5 hoạt tính còn lại trên 50% và ở giá trị pH 3, 4 hoạt tính còn lại tương ứng lần lượt là 21 và 29% sau 5 h. Trong khi đó, đối với Lac2 ở pH 6 hoạt tính còn lại trên 92% và ở pH 3, 4, 9 hoạt tính còn lại tương ứng lần lượt là 54, 55 và 78% sau 3 h. Như vậy, đã thấy có sự khác nhau của pH môi trường lên hoạt tính laccase của 2 isozyme từ chủng FBV40, đặc biệt là ảnh hưởng tới độ bền. b) Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của Lac 1, Lac 2 từ chủng FBV40 đã được thực hiện trong khoảng từ 35 đến 70oC thời gian khảo sát đến 140 phút đối với Lac 1. Nhiệt độ từ 30 đến 90oC và độ bền nhiệt đã được khảo sát từ 35 đến 70oC với thời gian kéo dài đến 180 phút đối với Lac 2. Kết quả thu được, cả Lac1 và Lac2 đạt hoạt tính cao nhất ở 60°C.
11 Trong khoảng nhiệt độ từ 65 đến 70°C Lac1 giảm hoạt tính tương ứng lần lượt từ 15 đến 23%. Lac2 giảm hoạt tính từ 20, 32 và 75% khi nhiệt độ tương ứng là 70, 80 và 90°C. Hoạt tính Lac1 bền nhất ở 35oC khi vẫn còn 18% so với hoạt tính ban đầu sau 140 phút, trong khi đó hoạt tính Lac2 đạt 92% và 90% ở ở 30oC và 40oC sau 180 phút. c) Cơ chất đặc hiệu Lac1, Lac2 đều có thể oxy hóa các cơ chất đặc hiệu của laccase như ABTS, syringaldazine (Syrin), 2, 6-DMP và guaiacol (Gua). Hoạt tính Lac1 với các cơ chất 2,6-DMP, guaiancol và syringaldazine so với ABTS lần lượt là 76,5%, 0,54% và 0,13%, tương ứng với Lac 2 là 74%, 0,3% và 0,2%. d) Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại Ảnh hưởng của một số chất ức chế protein điển lên hoạt tính của Lac1, Lac 2 đã được nghiên cứu. Kết quả được tổng hợp như sau: Chất ức Nhận xét mức độ bị ức chế chế Lac 1 Lac 2 Bị ức chế hoàn toàn ở bất Bị ức chế hoàn toàn ở SDS kỳ nồng độ nào bất kỳ nồng độ nào 10 mM bị ức chế hoàn 10 mM hoạt tính bị ức toàn; 5 mM hoạt tính bị chế 92%, 5 mM hoạt EDTA ức chế 65,5% và 2 mM tính bị ức chế 58,4% hoạt tính bị ức chế và 2 mM hoạt tính bị 28,5% ức chế 31,6% 10 mM bị ức chế hoàn toàn; 5 mM hoạt tính bị Cl- - ức chế 72%; 2 mM hoạt tính bị ức chế 9,4% 5 mM và 10 mM hoạt tính L-cystein - bị ức chế hoàn toàn; 2
12 mM hoạt tính bị ức chế 54,5% 10 mM hoạt tính bị ức chế 48%; 5 mM hoạt Arginin - tính bị ức chế 36,5; 2 mM hoạt tính bị ức chế 28,5%. Chú thích: "-" không thử nghiệm Ảnh hưởng của các ion kim loại như sau: Nhận xét mức độ ảnh hưởng ion Lac 1 Lac 2 Làm tăng 109% hoạt tính ở Làm tăng 112% đến nồng độ 2 mM 184,6% hoạt tính ở Cu2+ nồng độ tương ứng từ 1,0 đến 5 mM Ức chế hoạt tính ở tất Ức chế hoạt tính ở tất cả các cả các nồng độ và dao nồng độ và dao động trong động trong khoảng Mg2+ khoảng 21,5 đến 78,95% 11,6% đến 27% tương tương ứng từ 0,5 mM đến ứng với từ 0,5 mM 5,0 mM đến 5,0 mM Ở 1,0 mM làm tăng 100,6% Ức chế hoạt tính ở tất hoạt tính, ở các nồng độ còn cả các nồng độ và Ni2+ lại đều ức chế và dao động dao động từ 12,8% từ 5,3% đến 44,4% tương đến 30% với nồng độ ứng 0,5 mM đến 5 mM từ 0,5 mM đến 5 mM Ức chế hoạt tính ở tất Ức chế hoạt tính ở tất cả các cả các nồng độ và dao nồng độ và dao động từ Mn2+ động từ 11,6% đến 21,1% đến 35% với nồng độ 18,9% với nồng độ từ từ 0,5 đến 5,0 mM 0,5 đến 5,0 mM Gây ức chế hoạt tính ở Ức chế hoạt tính ở tất cả các tất cả các nồng độ và nồng độ và dao động từ Co2+ dao động từ 14,5% đến 15,5% đến 35,2% với nồng 32,3% với nồng độ từ độ từ 0,5 đến 5,0 mM 0,5 mM đến 5 mM
13 Ức chế hoạt tính ở tất Ức chế hoạt tính ở tất cả các cả các nồng độ và dao nồng độ và dao động từ động từ 95,9% đến Fe2+ 71,6% đến 93,3% với nồng 100% với nồng độ độ từ 0,5 mM đến 5 mM tương ứng từ 0,5 mM đến 5 mM Ức chế hoạt tính ở tất Làm tăng 107% và 128% cả các nồng độ và dao Ca2+ hoạt tính ở nồng độ 0,5 và 2 động từ 16,2% đến mM 23,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến 5 mM Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy, ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính laccase sinh tổng hợp bởi chủng FBV40 là tương đồng với các nghiên cứu đã được công bố quốc tế, tuy nhiên có sự khác biệt về mức độ ức chế giữa Lac1 và Lac2. 3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch Km và Vmax của Lac1 là 0,3 µM và 200.000 µM/phút. Trong khi đó với Lac2 là 0,4 µM và Vmax là 10.000 µM/phút. 3.2.3.2. Đặc tính hóa-lý của laccase thô Nghiên cứu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường lên hoạt tính laccase thô đã được thực hiện. Bảng 3.10. Tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô/FBV40 Các yếu tố ảnh Sự thay đổi hoạt tính laccase hưởng Ảnh hưởng của pH pH 3 Hoạt tính cao nhất pH 2 Mất hoạt tính pH 4 Hoạt tính còn lại trên 65% sau 120 phút Ảnh hưởng của nhiệt độ 30 đến 40oC Hoạt tính cao nhất Bị ức chế lần lượt là 15% sau 160 phút ở 50oC, 60 đến 70oC 50oC và 79% sau 40 phút ở 60oC và đến 98% sau 20 phút ở 70oC
14 Các yếu tố ảnh Sự thay đổi hoạt tính laccase hưởng Sau 160 phút hoạt tính gần như không bị 30oC và 40oC ức chế Động học xúc tác Km 0,5 µM Vmax 25.000 µM/phút Ảnh hưởng của chất ức chế Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM SDS bị ức chế 79% Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM L-lysis ức chế 86% Với 5 mM bị ức chế là 92% và 2 mM bị EDTA ức chế 10% Ảnh hưởng của các ion kim loại Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Co2+ dao động từ 44,7% đến 79,5% với nồng độ từ 2 đến 10 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Mn2+ dao động từ 47,3% đến 80,2% với nồng độ từ 2 đến 10 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và K+ dao động từ 41,7% đến 80,7% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Na+ dao động từ 75,5% đến 94% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Mg2+ dao động từ 13,4% đến 79,1% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Ca2+ dao động từ 41,5% đến 68,5% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Fe2+ dao động từ 97% đến 97,9% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ni2+ Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và
15 Các yếu tố ảnh Sự thay đổi hoạt tính laccase hưởng dao động từ 2,7% đến 88,3% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và Cu2+ dao động từ 48,1% đến 76,2% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Kết quả thu được cho thấy, có sự tương đồng về khả năng nhưng có sự khác biệt lớn ở mức độ ảnh hưởng của cùng một yếu tố lên hoạt tính laccase thô và laccase tinh sạch của chủng FBV40. Kết quả nghiên cứu cho thấy, để ứng dụng laccase tinh sạch hay laccase thô trong xử lý ô nhiễm môi trường cần phải nghiên cứu tổng thể và chi tiết để xác định các yếu tố và mức độ ảnh hưởng để qua đó nâng cao hiệu quả ứng dụng của chúng. 3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase-like tinh sạch Laccase-like tinh sạch có hoạt tính cao nhất ở pH 1, giảm nhanh hoạt tính và gần như không xác định được ở pH 3. Hoạt tính của laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 hầu như không giảm khi được đun sôi trong thời gian tới 3 giờ. Thậm chí, khi chưng cất trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 800C và áp suất 0,8 atm, hoạt tính laccase-like của chủng này vẫn không thay đổi. Như vậy, laccase-like tạo ra từ chủng XKBiR929 rất bền nhiệt. Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất lên khả năng oxy hóa của laccase-like, tính toán được giá trị động học của nó với giá trị Vmax là 142.857 µM/phút và Km là 0,43 µM. Khi so sánh với giá trị động học của laccase chủng nấm FBV40 thì thấy vận tốc phản ứng của laccase-like chỉ thấp hơn Lac1 (200.000 µM/phút) và cao hơn gấp khoảng 14 lần Lac2 (10.000 µM/phút) và hơn 5 lấn laccase thô (25.000 µM/phút). Với giá trị Vmax và Km
16 như vây cho thấy khả năng oxy rất cao của laccase-like đặc biệt là ở giá trị pH rất thấp. Đây là một đặc tính rất đáng lưu ý của hoạt chất này mà luận án này đã tìm thấy ở xạ khuẩn. Chất ức chế hoạt tính laccase-like mạnh nhất là L-lys, ở nồng độ 10 mM hoạt tính laccase-like còn lại 14%, tiếp đến là EDTA hoạt tính còn lại 66,7% và SDS có ảnh hưởng ít nhất với hoạt tính laccase-like còn lại là 83,6%. Trong số các cation kim loại thử nghiệm với hoạt tính laccase-like, cation Fe2+ gây ra sự ức chế hoạt tính mạnh ở tất cả các nồng độ khảo sát. So với ảnh hưởng của các ion kim loại đối với laccase của chủng FBV40 cho thấy đây là một đặc tính hết sức đặc biệt của laccase-like từ chủng XKBiR929. Kết quả thu được của luận án liên quan đến đặc tính của laccasee-like được xạ khuẩn tạo ra, đây là những kết quả đầu tiên thu được khi khảo sát đặc tính cơ bản của protein và cho thấy những đặc điểm nổi bật của laccase-like. 3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô Laccase chủng FBV40 có khả năng rất cao trong loại các màu gốc azo là NY1 và NY7 cũng như màu có gốc anthraquinon như NY5 ngay cả khi có mặt và không có mặt chất gắn kết. Kết quả này là những kết quả đầu tiên về khả năng loại màu NY1, NY5 và NY7 của nấm thuộc chi Rigidoporus được phân lập từ rừng tự nhiên ở Việt Nam. 3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô a) Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính Laccase thô chủng FBV40 cho thấy khả năng loại được các màu hoạt tính thương mại được sử dụng để nhuộm vài may quân
17 trang cho quân đội. Khả năng loại màu tốt nhất đối với thuốc nhuộm MN.FBN là 92,17% với thuốc nhuộm NN.SG là 91,84% sau 3,5 h . b) Lựa chọn thuốc nhuộm hoạt tính bị loại màu cao nhất So sánh khả năng loại màu của laccase thô chủng FBV40 với thuốc nhuộm MN.FBN cao nhất đạt 92,67%, với thuốc nhuộm NN.SG là 91,84%. Tốc độ loại màu MN.FBN đạt trên 85% trong khi với thuốc nhuộm NN.SG chỉ đạt hiệu suất trên 17% sau 0,25 h. Đặc biệt khi không có CGK thì laccase giảm hoạt tính 62,9% khi loại màu thuốc nhuộm MN.FBN và 91,4% đối với NN.SG sau 3,3 và 4h. Chính vì vậy thuốc nhuộm MN.FBN được lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo. c) Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN. FBN bằng laccase thô với sự có mặt của D-glucose Sau 138 h, với nồng độ 50 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN, laccase thô chủng FBV40 đã loại màu được 99% và 97,6% với sự có mặt của 0,1g và 0,05g D-glucose. 3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 Sau 24h, khi có mặt ViO 500 µM, Lac 1 của chủng FBV40 đã loại được 91% màu thuốc nhuộm MN.FBN với nồng độ ban đầu là 50 mg/L. Kết quả rõ ràng cho thấy vai trò và khả năng rất cụ thể của laccase chủng FBV40 trong loại màu thuốc nhuộm nói chung và các màu hoạt tính thương mại của Nhà máy X20/Tổng cục Hậu cần nói riêng. 3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase- like tinh sạch Ở pH 1, laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 khi có mặt chất gắn kết ViO đã loại được 76,3% màu MN.FBN sau
18 23h, nhưng chỉ sau 5 h laccase-like đã loại được 75,8% với nồng độ thuốc nhuộm ban đầu là 100 mg/L. Khi sử dụng CGK khác là HBT, khả năng loại màu sau 23h đạt 54,7% và sau 5h đạt 54,0%. Vai trò của CGK ViO đối với laccase-like chủng XKBiR929 trong loại màu thuốc nhuộm là không lớn (chỉ tăng hiệu suất thêm được 22%), với CGK HBT chỉ làm tăng hiệu suất loại màu không đáng kể. Kết quả nghiên cứu đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng laccase-like trong xử lý loại các hợp chất hữu cơ khác trong điều kiện pH thấp. 3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi chủng FBV40 3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải may quân trang Chủng FBV40 có hiệu suất loại màu đối với thuốc nhuộm MN.FBN cao nhất trên 99% sau 7 ngày nuôi cấy. Đối với màu thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES hiệu suất loại màu thuốc nhuộm đạt thấp chỉ xác định được từ 6 đến 8%. Quan sát quả thể nấm sinh trưởng trong dung dịch màu thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES thấy có sự hấp phụ màu lên quả thể nấm, ngược lại đối với màu thuốc nhuộm MN.FBN không thấy sự hấp phụ trên. Từ hiện tượng trên có thể nhận định chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng cơ chế phân hủy, chuyển hóa. 3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau Sau 1 đến 3 ngày nuôi cấy chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có nồng độ 100 mg/L đạt từ 52,7 % đến 97,3 %, trong khi ở nồng độ thuốc nhuộm 50 và 200 mg/L thì hiệu suất loại màu đạt tương ứng từ 49,8 % đến 94,3% và 35,2 % đến 97,1 %. Như vậy, chủng nấm FBV40 có khả năng loại màu cao nhất trong môi trường có nồng độ thuốc nhuộm 100 mg/l.