Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là phân lập, tuyển chọn và ác định được khả năng ứng dụng vi sinh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza trong xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ, tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm sò và ây dựng được qui trình sản xuất, sử dụng chế phẩm sinh học từ vi sinh vật tuyển chọn để xử lý có hiệu quả mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm sò.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------------------- NGUYỄN BẢO CHÂU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ MÙN CƯA LÀM CƠ CHẤT NUÔI TRỒNG MỘC NHĨ VÀ TÁI SỬ DỤNG BÃ THẢI ĐỂ TRỒNG NẤM SÒ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Văn Toản 2. TS. Phạm Bích Hiên Phản biện 1: ................................................................ Phản biện 2 ................................................................. Phản biện 2 ................................................................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam vào hồi giờ ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Thư viện Trường THPT chuyên Lương Văn Tuỵ, tỉnh Ninh Bình
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Nấm ăn là thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao, chứa nhiều loại vitamin và các axit amin thiết yếu. Với đặc điểm hoại sinh, ở một số loài nấm có hệ enzyme phân giải ligno- xenluloza mạnh, có thể phân hủy được các cơ chất phức tạp tạo nguồn dinh dưỡng nuôi sợi nấm. Tuy nhiên, đa phần các loài nấm trồng không thể sử dụng được ngay nguồn nguyên liệu khó phân hủy mà phải sử dụng các cơ chất đã hoai mục hoặc có sự hỗ trợ phân giải cơ chất của vi sinh vật trước khi trồng nấm. Các nghiên cứu về nấm hiện nay chủ yếu tập trung vào giống nấm, biện pháp kỹ thuật trồng, thu hoạch, chế biến và bảo quản sau thu hoạch, mà chưa quan tâm nhiều tới công đoạn xử lý nguyên liệu đặc biệt là xử lý bằng công nghệ vi sinh vật. ử dụng vi inhvật t ng hợp n ym chuyển hóa hợp chất ligno – nlulo a làm tác nhân ử l m n cưa trồng mộc nhĩ có tác dụng tăng tốc độ chuyển hóa, r t ngắn thời gian ủ nguyên liệu, tạo nguồn dinh dưỡng th ch hợp cho nấm inh trưởng và phát triển, giảm tỉ lệ nhiễm bệnh qua đó giảm chi ph nhân công, chi ph đầu tư ây dựng nhà ưởng và gia tăng lợi nhuận cho người trồng nấm. Bã mùn cưa au trồng mộc nhĩ hiện nay thường bị đ bỏ như rác thải, trong khi đó bã m n cưa vẫn còn lượng xenluloza và hemi nlulo a tương đương với rơm rạ có thể ử dụng để trồng nấm ò, tuy nhiên trong bã m n cưa có phần ợi và gốc nấm mộc nhĩ còn lại au thu hoạch là nhân tố gây ức chế ự inh trưởng của các nấm khác, việc b ung V V phân giải lingo – xenluloza vào bã m n cưa au trồng mộc nhĩ, gi p khắc phục những nhược điểm trên đồng thời tận dụng được nguyên liệu một cách tối đa, giảm chi ph đ bỏ phế thải, tăng hiệu quả kinh tế và góp phần bảo vệ môi trường. Nhằm nâng cao hiệu quả ử dụng m n cưa trong ản uất nấm ăn, đáp ứng nhu cầu thực tế của người trồng nấm, đề tài luận án “Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò” được thực hiện tại Bộ môn inh học Môi trường - Viện Môi trường Nông nghiệp. 2. Mục tiêu của luận án Phân lập, tuyển chọn và ác định được khả năng ứng dụng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza trong ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ, tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò và ây dựng được qui trình sản xuất, sử dụng chế phẩm sinh học từ vi sinh vật tuyển chọn để ử l có hiệu quả m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò. 1
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Đề tài luận án đã cung cấp các luận cứ, cơ ở khoa học và thực tiễn cho việc ử dụng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – nlulo a trong ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò. Kết quả phân lập, tuyển chọn vi inh vật phân giải ligno – nlulo a đồng thời góp phần làm giàu nguồn g n vi inh vật nông nghiệp. ản phẩm của đề tài luận án là chủng ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 có khả năng t ng hợp n ym nlula a, lignin p ro ida a và mangan p ro ida a th c đẩy nhanh quá trình ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò. Đề tài luận án là công trình nghiên cứu t ng hợp đầu tiên tại Việt Nam về phân lập, tuyển chọn, ác định chủng vi inh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza và sản uất chế phẩm vi inh vật ử dụng trong ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò. Những đóng góp mới của luận án cụ thể như au:  Phân lập, tuyển chọn và ác định được chủng ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 thuộc nhóm an toàn sinh học cấp độ 1 có khả năng t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin peroxidaza và mangan p ro idaza thúc đẩy nhanh quá trình xử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò.  Xác định được các điều kiện tối ưu trong nhân inh khối chủng ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05.  Xây dựng được qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong ử l mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò.  Kết quả ử dụng chế phẩm vi inh vật trong ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái ử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm ò mở ra giải pháp mới cho việc ử dụng hiệu quả m n cưa trong ản uất nấm ăn, góp phần trong bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả ản uất nấm ăn từ mùn cưa. CHƯƠNG I. T NG UAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về mộc nhĩ và nấm sò 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Mộc nhĩ có tên khoa học là Aricularia spp, quả thể hình đĩa tròn (hình tai) đường k nh từ 2,0-15,0cm, có nhiều màu ắc và hình thái khác nhau. Theo Lowy (1951) (tr ch th o Vương Bá Triệt,(1994) và Trịnh Tam Kiệt (2001), mộc nhĩ thuộc: ngành – Mycota, lớp – Basidiomycetes, lớp phụ - Phragmobasidiomicetidae, bộ - Auriculariales, họ - Auriculariaceac, loài - Auricularia spp. Owr Việt Nam hiện nay mới tìm thấy 6 loài mộc nhĩ, trong đó 2
có 2 loài được trồng ph biến là Auricularia polytricha (Mont). Sacc. Và Auricularia auricula (L. Hook.) Und rw (Trịnh Tam Kiệt, 2001). Nấm ò có hơn 30 loài, c ng có tên khoa học chung là Pleurotus sp., thuộc chi Pleurotus, họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Agaricomycetes, ngành phụ Agaricomycotina, ngành Nấm đảm – Basidiomycota, giới Nấm – Fungi. Ở Việt Nam, nấm ò còn có tên gọi khác là nấm bào ngư (Đinh Xuân Linh và cộng ự, 2012). 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng Nấm ăn là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng rất cao. Th o Nuhu Alam t al., (2008) hàm lượng prot in của nấm ò tươi đạt trung bình 2,6 – 3,4% và chứa nhiều a it amin qu . Th o FAO (1972) mộc nhĩ là một trong các loại nấm ăn có vai trò quan trọng trong khẩu phần ăn ở châu Á. Thành phần dinh dưỡng của mộc nhĩ khô gồm prot in thô (7,9%), chất béo (1,2%), cacbonhydtrat (84,2%). 1.1.3. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của mộc nhĩ và nấm sò Nguồn dinh dưỡng cơ bản để nấm inh trưởng và phát triển gồm: Cacbon (C), Nitơ (N), chất khoáng và vitamin. Ở mộc nhĩ, ự inh trưởng diễn ra trong điều kiện cơ chất có tỷ lệ C/N nhỏ hơn 60/1, trong đó tốt nhất là 35/1; với nấm sò tỷ lệ thích hợp là từ 20/1 đến 25/1. Tỉ lệ C/N tốt nhất cho nấm sò vào khoảng 20 – 30/1 và không được quá tỷ lệ 50/1 (Lê Lý Thùy Trâm, 2007). Mộc nhĩ có thể inh trưởng ở nhiệt độ từ 15 0C đến 350C, trong đó nhiệt độ th ch hợp nhất để mộc nhĩ phát triển là từ 250C đến 320C. Nhiệt độ tối th ch cho ự inh trưởng của hệ ợi nấm ò trong khoảng 250C – 300C. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến năng uất mà còn ảnh hưởng đến hình thái quả thể, nhiệt độ cao cuống nấm dài, mũ nấm mỏng. Ngược lại, nhiệt độ thấp, nấm phát triển chậm, cuống nấm ngắn, mũ nấm dày, màu ắc quả thể đậm hơn (Trịnh Tam Kiệt, 2013). Với mộc nhĩ, độ ẩm của cơ chất th ch hợp ở khoảng 60-65%. Nếu khô quá hoặc ẩm quá đều không tốt. Trong khi đó, độ ẩm không kh của nơi nuôi trồng nên giữ ở mức 80%-90% (Nguyễn Lân H ng, 2000). Độ ẩm cơ chất th ch hợp để trồng nấm ò từ 60 – 65%, độ ẩm không kh trên 80% là th ch hợp cho ự phát triển hệ ợi và quả thể nấm (Đinh Xuân Linh và cộng ự, 2012). Thời kỳ ủ sợi, cần giữ mộc nhĩ ở chỗ tối. Trong giai đoạn hình thành quả thể, nâng dần độ chiếu áng để kích thích sự phát triển của quả thể mộc nhĩ. Khi mộc nhĩ phủ gần kín bề mặt, tiếp tục nâng mức áng lên ngưỡng như ở trong phòng có mở cửa (Nguyễn Lân Hùng, 2000). Đối với nấm ò, ánh áng ảnh hưởng không tốt đến sự inh trưởng của hệ sợi nấm, nhưng khi hình thành quả thể cần ánh sáng khuếch tán khoảng 100 – 200 lu (Đinh Xuân Linh và cộng sự, 2012). 3
1.1.4. Nghiên cứu và sản xuất nấm ăn trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.4.1. Nghiên cứu và sản xuất nấm ăn trên thế giới Trong nửa thế kỷ vừa qua đã chứng kiến ự tăng trưởng nhanh chóng của ngành ản uất nấm. Từ năm 1969 đến năm 2009, ản uất nấm trên thế giới đã tăng khoảng mười lần. T ng ản lượng nấm đã tăng từ 60.000 tấn với giá trị là 100 triệu nhân dân tệ (15 triệu U D) vào năm 1978 lên tới 25,7 triệu tấn với giá trị hơn 87 tỷ nhân dân tệ (13 tỷ U D) trong năm 2008 và đạt 149 tỷ nhân dân tệ (24 tỷ U D) trong năm 2011. Tỷ lệ ản uất nấm cung cấp cho toàn thế giới của Trung Quốc đã tăng từ 5,7% năm 1978 lên 80% năm 2008 (Wu et al, 2013). 1.1.4.2. Nghiên cứu và sản xuất nấm ăn ở Việt Nam Với kh hậu nhiệt đới, Việt Nam rất ph hợp cho ự phát triển đa dạng các loại nấm trồng. Tuy vậy, hiện nay nước ta mới chỉ đưa vào ản uất khoảng 16 loại nấm chính, trong đó các tỉnh ph a Nam chủ yếu trồng nấm rơm, mộc nhĩ; các tỉnh ph a Bắc trồng nấm hương, mộc nhĩ, nấm ò, nấm linh chi... Với ản lượng nấm hàng năm đạt khoảng 250.000 tấn, kim ngạch uất khẩu 25 - 30 triệu U D, trong đó: mộc nhĩ đạt 120.000 tấn, nấm rơm là 64.500 tấn, nấm ò khoảng 60.000 tấn, nấm mỡ 5.000 tấn, nấm linh chi 300 tấn, các loại nấm khác như nấm vân chi, nấm đầu khỉ, nấm kim châm, nấm ngọc châm với ố lương chỉ khoảng 700 tấn. (Nguyễn Như Hiến & Phạm Văn Dư, 2013) 1.2. Hợp chất ligno - xenluloza 1.2.1. Xenluloza X nlulo a là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật với tỷ lệ trong khoảng 30- 80% t nh th o khối lượng khô. X nlulo a là hợp chất phức tạp và bền vững không tan trong nước và trong nhiều dung môi hữu cơ, không bị các dung dịch a it và kiềm loãng tác dụng, chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với a it hoặc kiềm. X nlulo a tự nhiên khi bị thuỷ phân hoàn toàn ẽ cho ản phẩm cuối cùng là D-gluco a. Trong điều kiện bình thường một ố vi inh vật có thể thuỷ phân xenluloza thành xenlobio a, au đó dưới tác động của nlobio a thành glucoza (Beguin et al., 1992; Bruno et al., 1998). 1.2.2. Lignin Lignin là một trong ố các polym hữu cơ ph biến nhất ở thực vật, chỉ sau xenluloza. Hàm lượng lignin trong gỗ khoảng 20-40%. Lignin được tạo nên bởi các đơn phân tử p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapylalcohol. Lignin là hợp chất tự nhiên có cấu trúc phức tạp, đa dạng và rất khó bị phân hủy. Lignin có thể bị thủy phân bởi các tác nhân hóa học hoặc bởi các n ym như manganese peroxidaza, lignin peroxidaza cellobiosedehydrogenase (Lenihan et al., 2010). Khi nhiệt phân, lignin cho sản phẩm làm ethoxy phenol. 4
1.2.3. Hemi – xenluloza Hemi – xenluloza là polyme mạch thẳng, có nhánh với thành phần đơn phân đa dạng bao gồm năm loại phân tử đường ch nh và có thể bị ac tyl hóa (Kuhad et al., 1997). Phụ thuộc vào thành phần đơn phân chủ yếu cấu tạo nên khung đường, hemi – nlulo a được chia thành nhiều loại. Thực vật khác nhau, có thành phần hemi – xenluloza khác nhau. Các loại cây gỗ mềm và cây gỗ cứng có thành phần hemixenluloza lần lượt là ac tylated (galacto) glucomannan (haycòngọi là arabinoglucuronoxylan) và glucuronoxylan (Scheller et al, 2010). 1.3. Vi sinh vật phân giải ligno - xenluloza 1.3.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza Phân giải nlulo a là quá trình inh học được tạo ra và kiểm oát bởi các n ym nlula a có vai trò thủy phân cầu nối β-1,4 giữa hai phân tử gluco a. (Wil on, 2011). Hệ thống n ym phân giải nlulo a bao gồm ba enzyme ngoại bào là 1,4-β-endoglucanaza, 1,4-β- oglucana a và β- gluco ida a (β-D-gluco id , glucohydrola hoặc c llobia ). Vi inh vật phân giải nlulo a gồm cả vi khuẩn, ạ khuẩn và nấm mốc, trong đó vi khuẩn hiếu kh có khả năng t ng hợp n ym nhiều hơn vi khuẩn kị kh (Bay r et al., 2004). Vi nấm là inh vật có cơ chế inh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những ản phẩm bậc hai đặc biệt, được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy nlulo a ( hahriarinour et al., 2011). Xạ khuẩn (Actinomycetes) được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và ử l môi trường, trong đó Streptomyces ản inh nlula a được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất với một ố loài đáng ch là Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans (Kluepfel et al., 1986; Schrempf, 1995). 1.3.2. Vi sinh vật phân giải lignin Trong tự nhiên lignin bị phân hủy rất chậm và hủy chủ yếu do một ố vi nấm, đặc biệt là nấm mục trắng trong môi trường hiếu kh . Vi khuẩn cũng có khả năng phân hủy lignin. Các n ym phân hủy lignin bao gồm chủ yếu là lignin peroxidaza, manganese peroxidaza và laccaza (JinShui Yang et al., 2005). 1.3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải ligno - xenluloza của vi sinh vật * Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng đến ự tăng trưởng và tốc độ phân hủy của vi inh vật trong quá trình ủ nguyên liệu (Chen et al, 2011). Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá cao có thể làm vô hiệu quá trình hoạt động phân huỷ của một ố n ym do vi inh vật tiết ra để úc tác phản ứng phân huỷ chất hữu cơ(Atlas et al., 1981). Các đống ủ cần phải được đảo trộn sau khi thiết lập được nhiệt độ chính xác (Jenkins et al, 2003). Bach et al., (1984) cho rằng tốc độ phân huỷ 5
chất hữu cơ tối ưu trong khoảng 60–650C. Ở nhiệt độ cao trên700C vẫn có thể có một ố vi sinh vật ưa nhiệt hiếu khí hoạt động nhưng mật độ của ch ng thường thấp do lượng oxy trong đống ủ giảm ở nhiệt độ cao (BlainMetting,1995). * Độ ẩm: Độ ẩm có liên quan trực tiếp đến ự trao đ i kh của quá trình ủ (Blain M tting, 1995). Độ ẩm cao làm giảm ự trao đ i kh , dẫn đến thiếu o y, thoát nhiệt kém. Độ ẩm thấp có thể dẫn đến hạn chế ự phát triển của vi inh vật. Th o Lê Hoàng Việt (2004), độ ẩm của nguyên liệu từ 50 – 70% (trung bình là 60%) th ch hợp cho ủ compo t và nên giữ ẩm độ cho đến cuối giai đoạn nhiệt độ cao. Jenkins et al, (2003) cho rằng, độ ẩm tối ưu trong quá trình ủ nên là 50 - 60%. * Oxy: Vi inh vật hiếu kh cần o y cho quá trình inh trưởng, phát triển. Khi hoạt động của vi inh vật trong quá trỉnh ủ tăng lên, lượng o y tiêu thụ ẽ tăng lên và vì vậy phải được cung cấp bằng việc đảo trộn thường uyên (Ch n et al., 2011). Các đống ủ cần phải thông thoáng để cung cấp không kh từ bên ngoài (Cogger et al, 2009). Để đảm bảo không kh được lưu thông trong khối ủ cần thiết phải đảo trộn nguyên liệu đồng thời lựa chọn k ch cỡ khối ủ ph hợp (Jenkins et al, 2003). Willson et al., (1980) cho rằng hàm lượng o y trong không kh đống ủ đạt 5% là thoáng kh . Th o Lê Hoàng Việt (2004), hoạt động của vi inh vật tối ưu nhất trong đống ủ khi nồng độ o y đạt 15% - 20% . * Tỷ lệ C/N: Tỷ lệ C/N trong nguyên liệu tối ưu cho ự phát triển của vi inh vật phân huỷ trong quá trình ủ là 35-40, nếu tỉ lệ này nhỏ hơn 35 thì quá trình phân hủy diễn ra nhanh, nitơ mất đi thông qua ự bay hơi NH 3, nếu C/N trên 40 quá trình phân hủy ẽ chậm lại, nguyên liệu hữu cơ ẽ chậm hoai mục ( tratton, 1995). Mối tương quan giữa tỉ ố C/N và thời gian ủ như au: Tỷ lệ C/N = 20, thời gian ủ là 12 ngày; tỷ lệ C/N = 20 – 50, thời gian ủ là 14 ngày và tỷ lệ C/N = 78, thời gian ủ là 21 ngày. Khi tỷ lệ C/N nhỏ hơn 20, đạm ẽ bị mất do quá trình chuyển đ i thành NH3 và đặc biệt là trong điều kiện nhiệt độ, pH cao. * pH: Giá trị pH của môi trường có liên quan trực tiếp đến kết quả ủ. Môi trường chua hạn chế ự phát triển của vi khuẩn và ạ khuẩn. Th o Ch n et al, (2011) pH tối ưu cho các hoạt động của vi khuẩn dao động từ 6,0 - 7,5, đối với nấm là 5,5 - 8,0. 1.4. Nguyên liệu sử dụng trong sản xuất nấm ăn và tái sử dụng bã thải trồng nấm 1.4.1. Nguyên liệu sử dụng trong sản xuất nấm ăn Các loài nấm nấm mỡ, nấm ò, mộc nhĩ, nấm hương và nấm rơm có khả năng inh trưởng, phát triển trên các nguyên liệu giàu ligno – xenluloza (Rajarathnamet al., 1998; Philippousis, 2009), thông qua quá trình t ng hợp các loại n ym cần thiết để chuyển hóa ligno – nlulo a trong cơ chất và do đó có 6
khả năng phát triển khác nhau trên từng loại cơ chất có chứa ligno – xenluloza. (Chen et al., 2003; Baldrianet al, 2008). 1.4.2. Xử lý và sử dụng mùn cưa làm cơ chất trồng nấm Chất lượng và năng uất của nấm cũng như ự phát triển của nấm bị ảnh hưởng bởi thành phần dinh dưỡng và t nh chất vật l của cơ chất được ử dụng (Kueset al., 2000, Baldrianet al., 2008). ản uất cơ chất trồng nấm là một trong những công đoạn quan trọng nhất của việc trồng nấm (Di go et al., 2011, Cormicanet al., 1991; Dhar, 1994). Mục đ ch ch nh của việc ủ cơ chất là tạo nguồn dinh dưỡng ban đầu cho nấm phát triển,(Obodai et al, 2010). Do các loại nấm không phát triển được trên cơ chất tươi, đặc biệt là các loại nấm trồng, cơ chất phải được ủ trước khi cấy giống. Tại Việt Nam th o kinh nghiệm truyền thống, để trồng mộc nhĩ, m n cưa được phun nước tạo độ ẩm au đó chất đống, ủ tự nhiên từ 5 tháng cho đến 1 năm, giữa thời gian ủ có thể đảo trộn cơ chất 1-2 lần. Ở một ố địa phương người dân b ung vôi bột vào mùn cưa trước khi ủ th o tỷ lệ từ 3kg – 5kg /tấn nguyên liệu. Thời gian cần thiết cho quá trình ủ cơ chất phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như tỷ lệ C/N, độ ẩm, thời tiết, loại hình ủ, quản l nguyên liệu cho quá trình ủ ( a katch wan Agricultur , 2008). Tỷ lệ C/N thấp, tối ưu về độ ẩm và ự đảo trộn thường uyên của cơ chất làm tăng hoạt động của vi inh vật (Nutongkaewet al, 2014). 1.4.3. Tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấm sò Bã thải au trồng nấm còn chứa nhiều yếu tố dinh dưỡng có tiềm năng ử dụng cho các mục đ ch khác, kể cả cho việc tái ử dụng để trồng nấm (Rinkeret al, 2004, Jonathanet al, 2011). Royse, (1992), Chen (1998) và Zhang et al. (2013) khuyến cáo bã thải au khi trồng nấm hương Lentinula edodes có thể ử dụng trồng nấm Pleurotus sajor-caju, bã thải au khi trồng nấm linh chi Ganoderma lucidum có thể ử dụng trồng nấm đậu Coprinus conatus, nấm mỡ Agaricus bisporus hoặc nấm kim châm Flamulina velutipes. Theo Sripheuk,(2007), Ashrafi et al., (2014) bã thải au khi trồng nấm sò Pleurotus abalonus có thể trồng mộc nhĩ Auricularia polytricha, nấm ò Pleurotus ostreatus và Pleurotusflorida. Ở Việt Nam có rất t công trình nghiên cứu được công bố về nghiên cứu tái ử dụng bã thải trồng nấm nói chung và bã thải trồng mộc nhĩ nói riêng. Đến nay mới có một ố t công trình nghiên cứu ử dụng bã thải au trồng nấm làm phân bón hoặc giá thể trồng cây (Lương Bảo Uyên, 2008; Đào văn Thông và cộng ự, 2014; Nguyễn Thị Minh, 2016, Nguyễn Thị Liên, 2017). Tái ử dụng bã thải trồng nấm để trồng các loại nấm ăn khác đã được thăm dò và thử nghiệm tại một ố địa phương, ong cho đến thời điểm hiện nay chưa công trình nghiên cứu nào được công bố. 7
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu Mẫu phân lập vi inh vật được lấy trên địa bàn Hà Nội, Ninh Bình gồm 10 mẫu đất trồng, 10 mẫu m n cưa và 10 mẫu rơm rạ phân hủy. Giống Mộc nhĩ (Auricularia polytricha), nấm ò trắng (Pleurotus florida) do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật Mật độ vi sinh vật đươc ác định th o phương pháp nuôi cấy pha loãng trên môi trường thạch (Nguyễn Lân Dũng và c , 2011). Vi sinh vật phân giải nlulo a được phân lập, tuyển chọn trên cơ ở định t nh và định lượng hoạt tính phân giải xenluloza. Xạ khuẩn phân lập được phân loại trên cơ ở màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, sắc tố tan tiết ra môi trường theo Shirling và Gottlieb (1966) và hình dạng cuống sinh bào tử, bào theo khóa phân loại Bergey. Chủng ạ khuẩn phân lập được giải trình tự g n 16 ARN ribo om, so sánh mức độ tương đồng gen 16S rDNA với các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank theo phần mềm ClustalX 2.0.11 và ây dựng cây phả hệ để ác định vị tr phân loại. 2.2.2. Phương pháp h a sinh. Hoạt độ nlula a được ác định định tính thông qua vòng phân giải CMC trên môi trường đặc và định lượng thông qua hàm lượng gluco a tạo thành trong dịch nuôi cấy th o phương pháp đo độ hấp thụ ở bước óng 540 nm (Mill r, 1959). Hoạt độ lignin pero ida a và mangan p ro ida a được ác định theo Mercer et al., (1996 ) dựa trên mức độ oxy hóa O-Diani idin đo ở bước sóng 460 nm và mức độ o y hoá ph nol đỏ của n ym MnP đo ở bước sóng 610 nm. 2.2.3. Các phương pháp phân tích Hàm lượng cacbon t ng ố, nitơ t ng ố đường khử được phân t ch th o tay phân t ch đất, nước, phân bón và cây trồng (Viện Th nhưỡng nông hóa, 1999). 2.2.4. Tối ưu h a các điều kiện nuôi cấy Các điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, lượng kh cấp và tỷ lệ tiếp giống ban đầu được thực hiện th o phương pháp bề mặt đáp ứng (Montgom ry, Dougla .C, 2005), trong đó kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm được ử dụng để phân t ch hồi quy đa điểm bằng phần mềm D ign Expert Version 9.0.6.2. 8
2.2.5. Bố trí thí nghiệm Th nghiệm đánh giá ảnh hưởng của V V đến khả năng phân giải m n cưa gồm 2 công thức: 1. M n cưa ủ tự nhiên (đối chứng), 2. M n cưa ủ b ung inh khối V V, trong đó V V b ung với tỷ lệ 1 l t inh khối V V/01 tấn nguyên liệu. Thời gian ủ: 40 ngày; th o dõi nhiệt độ khối ủ th o thời gian, ác định khối lượng au ủ và tỉ lệ giảm trọng lượng khối ủ. Th nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất hydratcacbon trong m n cưa của chủng ạ khuẩn được bố tr với 3 công thức 1. m n cưa mới; 2. m n cưa ủ tự nhiên 40 ngày; 3. m n cưa ủ bằng inh khối V V au 40 ngày. Phân t ch thành phần hóa học, ác định lượng đường khử và tỉ lệ C/N trong m n cưa ủ bằng các phương pháp khác nhau. Thí nghiệm nghiên cứu khả năng ử dụng chủng xạ khuẩn trong xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ gồm 3 công thức: 1. M n cưa ủ tự nhiên 1 tháng; 2. M n cưa ủ 1 tháng bằng chế phẩm ạ khuẩn; 3. M n cưa ủ tự nhiên 4 tháng. Mộc nhĩ được nuôi trồng, chăm óc th o Đinh Xuân Linh và cộng sự (2012) và th o dõi đánh giá khả năng inh trưởng phát triển theo Trịnh Tam Kiệt (2012). Thí nghiệm nghiên cứu khả năng tái ử dụng bã thải trồng nấm sò, gồm 3 công thức: 1. ử dụng 100% rơm làm cơ chất (Đối chứng); 2. 100% bã thải trồng mộc nhĩ ử dụng trực tiếp làm cơ chất; 3. 100% bã thải trồng mộc nhĩ được ử l bằng V V ử dụng làm cơ chất. Mỗi th nghiệm được tiến hành với 90 bịch và lặp lại 3 lần. Bã thải trồng mộc nhĩ được ử l bằng cách b ung 0,02% chế phẩm vi inh vật, điều chỉnh độ ẩm của nguyên liệu đạt 55-60%, ủ trong thời gian 30 ngày. Nấm sò nuôi trồng, chăm óc th o Đinh Xuân Linh và cộng sự (2012) và th o dõi đánh giá khả năng inh trưởng phát triển theo Trịnh Tam Kiệt (2012). 2.2.6. Mô hình sử dụng chế phẩm xạ khuẩn trong sản xuất nấm ăn Mô hình trồng mộc nhĩ được tiến hành tại 3 địa điểm tại huyện Yên Khánh, Yên Mô và Hoa Lư, tỉnh Ninh Bình và bố tr gồm: 1. Mô hình trồng mộc nhĩ trên m n cưa ủ th o kỹ thuật truyền thống (đối chứng); 2. Mô hình hình trồng mộc nhĩ trên m n cưa ủ bằng chế phẩm ạ khuẩn. Mỗi mô hình được tiến hành với 1.000 bịch. Mộc nhĩ được trồng, chăm óc và thu hoạch theo quy trình chung tại địa phương. Theo dõi, o ánh thời gian inh trưởng, phát triển, ố bịch thối hỏng, năng uất và hiệu quả kinh tế, hiệu uất inh học của mô hình trồng mộc nhĩ trên m n cưa ủ bằng chế phẩm ạ khuẩnvới mô hình đối chứng. Mô hình tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ để trồng nấm ò được tiến hành tại 3 địa điểm thuộc các huyện Yên Khánh, Yên Mô và Hoa Lư tỉnh Ninh Bình, trong đó mỗi mô hình sử dụng 1000 bịch nấm sò trồng trên bã thải trồng mộc nhĩ ủ tự nhiên và ủ sử dụng chế phẩm vi sinh vật. Nấm ò được chăm óc và thu hoạch th o quy trình chung tại địa phương. Theo dõi, o ánh thời gian inh trưởng, phát triển, ố bịch thối hỏng, năng uất và hiệu quả kinh tế, hiệu uất inh 9
học của mô hình trồng nấm ò trên bã thải trồng mộc nhĩ ủ sử dụng chế phẩm vi sinh vật với mô hình trồng nấm ò trên bã thải trồng mộc nhĩ ủ tự nhiên. 2.2.7. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của nấm ăn Các đặc điểm inh trưởng phát triển, năng uất của mộc nhĩ, nấm ò được th o dõi, đánh giá th o Trịnh Tam Kiệt (2012). CHƯƠNG III. KẾT UẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuy n chọn vi sinh vật phân giải hợp chất ligno- xenluloza 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải hợp chất ligno - xenluloza Từ 30 mẫu đất trồng, m n cưa và rơm rạ phân hủy được thu thập trên địa bàn Hà Nội và tỉnh Ninh Bình đã phân lập, tuyển chọn được 10 chủng vi inh vật có khả năng phân giải CMC, trong đó ác định chủng ạ khuẩn k hiệu MC05 có đường k nh vòng phân giải CMC cao nhất, đạt 32,0 mm. Trong 10 chủng vi inh vật tuyển chọn có 2 chủng vi khuẩn và 4 chủng ạ khuẩn có khả năng phân giải lignin và chủng ạ khuẩn MC05 có hoạt t nh phân giải lignin cao nhất, đạt đường kính vòng phân giải 15mm. Kết quả đánh giá khả năng t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin p ro ida và manganese peroxidase của chủng xạ khuẩn MC05 ác định hoạt độ n ym lignin p ro ida (Lip) đạt 154,8 UI/l, manganese p ro ida (MnP) đạt 0,95UI/l và nlula a đạt 978,5 UI/l. 3.1.2. Khả năng sử dụng vi sinh vật phân giải hợp chất ligno - xenluloza trong xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ Khả năng chuyển hóa ligno - xenluloza của m n cưa được đánh giá thông qua ự gia tăng nhiệt độ khối ủ và mức độ giảm khối lượng cơ chất au quá trình ủ. Nhiệt độ m n cưa ủ tự nhiên tăng dần đều và đến ngày thứ 40 vẫn có u hướng tăng nh , trong khi m n cưa ủ có b ung inh khối ạ khuẩn tăng nhanh trong những ngày đầu, đạt cao nhất 670C vào ngày thứ 6, duy trì và giảm dần đến ngày thứ 40 bằng với nhiệt độ môi trường. M n cưa ủ b sung ạ khuẩn MC05 có mức giảm khối lượng cao nhất, giảm tới 35,5% khối lượng, trong khi khối lượng m n cưa ủ tự nhiên có mức giảm là 19%. Phân t ch thành phần hóa học của m n cưa au 40 ngày ủ (bảng 3.1) cho thấy quá trình ủ đã làm giảm hàm lượng nlulo a, lignin, giảm hàm lượng cacbon t ng ố, dẫn đến giảm tỉ lệ C/N của m n cưa ủ o với m n cưa mới. Mùn cưa ủ có b ung ạ khuẩn MC05 có hàm lượng đường khử cao hơn gấp 4 lần so với m n cưa mới và cao hơn gấp 2,5 lần o với m n cưa ủ tự nhiên không b sung ạ khuẩn MC05. Bảng 3.1. Hiệu quả chuyển hóa ligno - xenluloza của chủng MC05 Công thức thí Hàm lượng o với khối lượng m n cưa (%) Tỷ lệ C/N nghiệm Xenluloza Lignin Đường Cacbon Ni tơ 10
khử t ng ố t ng ố M n cưa mới 44,3 24,5 0,13 48,0 0,50 96,0 M n cưa ủ tự nhiên 38,5 21,7 0,20 42,2 0,55 76,7 M n cưa ủ b ung 35,5 18,0 0,52 33,0 0,58 56,9 ạ khuẩn Chủng MC05 có khả năng t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin p ro ida và mangan p ro ida , có tác dụng t ch cực trong chuyển hóa ligno - nlulo a của m n cưa, làm giảm tỷ lệ C/N của m n cưa từ 96/1 uống 56,9/1 và làm tăng hàm lượng đường khử từ 0,13% lên 0,52%. Th o Lê Duy Thắng và Trần Văn Minh (2001) mộc nhĩ phát triển tốt nhất trên cơ chất có tỷ lệ C/N là 35/1 và phát triển bình thường trên cơ chất có tỷ lệ C/N từ 40/1 đến 60/1. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy m n cưa được ủ b ung inh khối chủng ạ khuẩn MC05 có tỷ lệ C/N ph hợp cho inh trưởng, phát triển của mộc nhĩ. Đánh giá khả năng inh trưởng, phát triển của mộc nhĩ trên m n cưa không ủ hoặc ủ tự nhiên và m n cưa ủ sử dụng sinh khối xạ khuẩn xác định trên m n cưa không ủ, mộc nhĩ không hình thành hệ ợi. Trên mùn cưa ủ tự nhiên, hệ sợi hình thànhvà phát triển trong 02 tuần đầu sau khi cấy giống với tốc độ chậm, sợi mảnh, au đó hệ sợi nấm bị chết ở tuần thứ 3. Trên m n cưa ủ sử dụng inh khối chủng MC05, hệ sợi mộc nhĩ hình thành và phát triển với tốc độ lan tơ đạt trung bình 4,9mm/ngày. Hệ sợi mộc nhĩ lan k n bịch nấm sau cấy giống 6 tuần (bảng 3.2) Bảng 3.2. inh trưởng, phát triển của hệ sợi mộc nhĩ trên m n cưa ử dụng các phương pháp ủ khác nhau Tốc độ phát triển trung bình của hệ ợi mộc Công thức nhĩ(mm)/chiều dài bịch nấm 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần M n cưa không ủ - - - - - - M n cưa ủ tự nhiên 32,5 52,0 - - - M n cưa ủ b ung 38,5 74,8 135,8 175,5 196,5 207,5 chủng MC05 hi ch : -) hệ sợi không hoặc ngừng sinh trưởng Từ các kết quả nghiên cứu trên, đề tài ác định chủng MC05 có khả năng t ng hợp enzyme xenlulaza, lignin p ro ida a và mangan p ro ida a. Trong quá trình ủ m n cưa, chủng MC05 có tác dụng gia tăng nhanh nhiệt độ khối ủ, chuyển hóa tốt hơn hợp chất ligno - xenluloza, qua đó giảm được tỷ lệ C/N phù hợp đối với inh trưởng, phát triển của mộc nhĩ. Mộc nhĩ trồng trên m n cưa ủ 11
b sung sinh khối chủng MC05 inh trưởng phát triển tốt và tạo hệ sợi lan kín bịch nấm au cấy giống 6 tuần. 3.1.3. Định danh chủng MC05 3.1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh h a của chủng MC05 Nuôi cấy chủng MC05 trên các môi trường I P khác nhau, ác định khuẩn ty kh inh của chủng MC05 có màu vàng trên môi trường I P5, màu xám trên các môi trường I P1, I P2, I P3, màu trắng trên môi trường I P6 và I P7. Khuẩn ty cơ chất của chủng MC05 có màu ám trên môi trường I P2 và màu vàng trên các môi trường nuôi cấy khác. Chủng MC05 không tạo ắc tố tan hoặc melanin, không thay đ i màu ắc của môi trường nuôi cấy. Đánh giá một ố đặc điểm inh hóa của chủng MC05 ác định chủng MC05 có khả năng đồng hóa ca in, g latin, hypo anthin , anthin, L-tyro in và ylan và có khả năng ử dụng xanthine, xylan, L-Arabinose, meso-Inositol và mannitol làm nguồn hydratcacbon. Quan át cuống inh bào tử chủng MC05 trên k nh hiển vi điện tử ác định mặt bào tử nh n, ố lượng bào tử khoảng 30 - 50 bào tử/chuỗi o ánh đặc điểm của chi Streptomyces (Nomomura, 1974) với các kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm bảo tử và các phản ứng inh hoá nêu trên, có thể ác định ơ bộ chủng vi khuẩn phân lập MC05 thuộc chi Streptomyces. 3.1.3.2. iải trình tự gen chủng MC05 Kết quả giải trình tự gen 16S ARN rebosom cho thấy, chủng MC05 có độ tương đồng trên 98 % với các g n tương ứng của một số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong đó mức tương đồng cao nhất đạt 99% đối với Streptomyces thermocoprophilus. Từ kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa và giải trình tự gen, chủng xạ khuẩn MC05 được định danh là Streptomyces thermocoprophilus MC05. Theo hướng dẫn TRBA ố 466 ngày 28.5.2015 của của Cộng đồng Châu Âu, Streptomyces thermocoprophilus thuộc nhóm an toàn inh học cấp độ1, là các tác nhân inh học không gây bệnh cho người, động vật và thực vật, được phóng th ch không hạn chế vào môi trường tự nhiên ở điều kiện bình thường. 3.2. Nghiên cứu sản xuất chế ph m xạ khu n ủ m n cưa trồng mộc nhĩ. 3.2.1. Điều kiện nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 bằng kỹ thuật lên men chìm 3.2.1.1. Nhiệt độ Nuôi cấy chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 trong điều kiện pH môi trường và thời gian th ch hợp ở các nhiệt độ 25 đến 650C ác định inh khối chủng MC05 n định với mật độ trên 109 CFU/ml ở nhiệt độ từ 350C đến 550C. ự chênh lệch mật độ MC05 khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C, 400C, 450C, 12
500C và 550C là không đáng kể. Nhiệt độ th ch hợp cho inh trưởng phát triển của Streptomyces thermocoprophilus MC05 là 350C - 550C. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với các kết quả đã công bố của Tăng Thị Ch nh, (2001), Trần Đình Toại, (2008) và Nguyễn Thế Trang, (2015) về nhiệt độ th ch hợp cho một ố chủng ạ khuẩn phân giải nlulo a 3.2.1.2. pH Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến inh trưởng, phát triển của chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 cho thấy mật độ au 72 giờ nuôi cấy ở pH 7,0 đạt cao nhất là 109 CFU/ml, trong khi ở pH 4,0 và 9,0 mật độ chỉ đạt 107 CFU/ml. Chủng ạ khuẩn MC05 đạt mật độ tế bào > 109 CFU/ml khi nuôi cấy trong trong môi trường có pH từ 6,0 đến 8,0. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với công bố của Tăng Thị Ch nh (2001), Trần Đình Toại (2008) và Nguyễn Thế Trang (2015) về pH th ch hợp cho inh trưởng và hoạt t nh x lula a của ạ khuẩn. 3.2.1.3. Thời gian nhân sinh khối Nuôi cấy chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 trên môi trường có pH và nhiệt độ th ch hợp trong thời gian từ 0 đến 96 giờ ác định mật độ ạ khuẩn tăng dần từ 104 CFU/ml đến 109 CFU/ml trong thời gian từ 0 đến 72 giờ, trong đó mật độ đạt 109 CFU/ml au thời gian nuôi cấy 60 giờ và đạt cao nhất tại thời điểm 72 giờ, au đó giảm dần, đến thời điểm 96 giờ còn 108 CFU/ml. Kết quả nghiên cứu ác định thời gian nhân inh khối th ch hợp đối với Streptomyces thermocoprophilus MC05 là 72 - 84 giờ và tương đồng với các công bố của Đào Văn Thông và cộng ự, (2013), Nguyễn Thế Trang, (2015) về thời gian th ch hợp cho quá trình nhân inh khối đối với các chủng ạ khuẩn 3.2.1.4. Lưu lượng khí cấp Nghiên cứu ảnh hưởng của lưu lượng kh cấp đến inh trưởng, phát triển của ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 trong quá trình nhân inh khối cho thấy mật độ ạ khuẩn đạt 107 CFU/mltrong điều kiện lượng kh cấp là 0,4 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t, đạt 108 CFU/ml khi lượng kh cấp là 0,5 và 0,6 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t và đạt 109 CFU/ml với lượng cấp kh 0,7- 0,9 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t. Khi tiếp tục tăng lượng kh cấp lên mức 1,0 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t, mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 không những không tăng lên mà còn giảm uống còn 108 CFU/ml. Như vậy lượng kh cấp th ch hợp cho nhân inh khối chủng ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 là 0,7 – 0,9 dm3 không kh /dm3 môi trường/ph t. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với kết quả nghiên cứu của Phạm B ch Hiên và cộng ự (2011), Đào Văn Thông và cộng ự (2013) về lượng kh cấp ph hợp trong nhân inh khối ạ khuẩn. 3.2.1.5. Tỷ lệ tiếp giống ban đầu 13
Kết quả nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống ban đầu đến mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 ác định mật độ ạ khuẩn au 72 giờ nhân inh khối đạt trên 107 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống ban đầu 1,0% v/V và tăng lên trên 10 8 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống 2,0% và 3,0% v/V. Mật độ chủng ạ khuẩn đạt trên 109 CFU/ml với tỷ lệ tiếp giống ban đầu 4,0%v/V. Tỷ lệ tiếp giống ban đầu lớn hơn 6,0%v/V, không gia tăng mật độ ạ khuẩn ở mức có nghĩa. o ánh với các công bố của Phạm B ch Hiên và cộng ự (2011), Nguyễn Văn Hiếu và cộng ự (2012), Đào Văn Thông và cộng ự (2013) về tỷ lệ tiếp giống ban đầu trong nhân inh khối ạ khuẩn cho ản uất chế phẩm vi inh vật, kết quả nghiên cứu thu được hoàn toàn tương đồng và ác định tỷ lệ tiếp giống ban đầu th ch hợp cho nhân inh khối ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 là 4,0 – 6,0 % v/V 3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu cho nhân inh khối chủng ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 bằng kỹ thuật lên m n chìm ác định nhiệt độ lên men 42,00C; pH môi trường 7,0; thời gian lên m n 72 giờ; tỷ lệ giống cấy 6,0% và lưu lượng cấp kh 0,8 dm3 không kh /dm3 môi trường. Các giá trị nhận được của các thông ố kỹ thuật áp dụng trong quá trình nhân inh khối đối với chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 hoàn toàn ph hợp với các nghiên cứu về ạ khuẩn ứng dụng trong ản uất các chế phẩm vi inh vật ử l chất thải hữu cơ của Tăng Thị Ch nh (2001), Trần Đình Toại (2008), Phạm Thị B ch Hiên (2011), Nguyễn Văn Hiếu (2012), Đào Văn Thông (2013) và Nguyễn Thế Trang (2015). Thử nghiệm nhân sinh khối Streptomyces thermocoprophilus MC05 trong nồi lên men, dung tích 50 lít trình cho thấy sinh khối xạ khuẩn trong các điều kiện lên men chìm tối ưu nêu trên đạt mật độ 9,7 x 109CFU/ml môi trường. Kiểm tra hoạt tính sinh học của Streptomyces thermocoprophilus MC05 sau khi nhân sinh khối ác định xạ khuẩn nghiên cứu có đường kính vòng phân giải CMC đạt 31,5 mm và đường kính vòng phân giải lignin đạt 11,0 mm. Hoạt tính sinh học của Streptomyces thermocoprophilus MC05 sau lên men chìm ở điều kiện tối ưu hóa không ai khác có nghĩa o với chủng gốc. 3.2.3. Qui trình sản xuất chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kế thừa các kết quả nghiên cứu về ản uất chế phẩm vi inh vật từ ạ khuẩn của Viện Môi trường nông nghiệp (Đào Văn Thông và cộng ự, 2013) đề tài thử nghiệm ử dụng nguyên liệu tinh bột ắn và cám gạo th o tỷ lệ khối lượng 25:75 để nhân inh khối ạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 bằng kỹ thuật lên m n ốp với các thông ố kỹ thuật: độ ẩm nguyên liệu ban đầu 50- 55%, pH cơ chất 6,5-7,0, tỷ lệ tiếp giống ban đầu 5,0% và thời gian lên m n 72 giờ. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm ạ khuẩn cho thấy mật độ au ản uất đạt 5,5 109 CFU/g và sau 03 tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng 14
đạt 6,7 108 CFU/g đảm bảo qui định hiện hành về chế phẩm vi inh vật. Qui trình ản uất chế phẩm Streptomyces thermocoprophilus MC05 thể hiện trong hình 3.1. Chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 Nhân sinh khối cấp 1 Môi trường ause, thời gian nuôi 72 h, nhiệt độ 42oC, nhân nuôi trên máy lắc) Tinh bột ắn; cám gạo tỷ lệ 25:75, trộn đều Nhân sinh khối cấp 2 (Môi trường ause, nhiệt độ: 420C, lưu lượng khí cấp: 0,8 lít KK/lít MT, tỷ lệ Chất mang tiếp giống: 6%; thời gian nuôi Kích thước hạt: 0,1mm, pH=7,0; độ ẩm: 10 %) 72h)Lên men xốp Cơ chất: Tinh bột sắn/cám gạo; độ ẩm Khử tr ng ban đầu 50 -55%; tỷ lệ tiếp giống: 1210C trong 30 phút 5,0%; thời gian nuôi 72 h) Sấy khô Nhiệt độ 400C trong 24 giờ) Đóng gói Chế ph m xạ khu n Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 3.3. Sử dụng chế ph m xạ khu n ủ m n cưa làm c chất trồng mộc nhĩ 3.3.1. Điều kiện sử dụng chế phẩm xạ khuẩn ủ mùn cưa 3.3.1.1.Độ ẩm ban đầu của mùn cưa Kết quả ác định mật độ ạ khuẩn và mật độ vi inh vật t ng ố của m n cưa au 5 ngày ủ với độ ẩm khối ủ ban đầu 35- 60% cho thấy m n cưa với độ ẩm 50% và 55% có mật độ vi inh vật t ng ố >107CFU/g và mật độ ạ khuẩn >106CFU/g, trong khi các khối ủ có độ ẩm m n cưa ban đầu 60% có mật độ vi inh vật t ng ố
biệt khối ủ với m n cưa có độ ẩm ban đầu ≤ 40%, mật độ vi inh vật t ng ố chỉ đạt 103 CFU/g và mật độ ạ khuẩn đạt 102CFU/g. Từ kết quả thu được đề tài ác định độ ẩm ban đầu ph hợp cho ủ m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ là 50% - 55%. Kết quả nghiên cứu của đề tài ph hợp với các nghiên cứu và nhận định của J nkin et al, (2003), Lê Hoàng Việt (2004) về độ ẩm tối ưu trong quá trình ủ compost. 3.3.1.2. Dinh dưỡng bổ sung Kế thừa kết quả thử nghiệm lựa chọn các tỉ lệ dinh dưỡng b sung vào đống ủ, đề tài lựa chọn tỉ lệ b sung dinh dưỡng vào m n cưa trước khi ủ là 0,2% ure, 0,3% lân super Lâm Thao và 0,1 % rỉ đường. Kết quả khảo sát biến thiên mật độ vi sinh vật t ng số và mật độ xạ khuẩn của khối ủ trong thời gian 5 ngày cho thấy m n cưa được b ung dinh dưỡng luôn có mật độ vi sinh vật t ng số và xạ khuẩn cao hơn hẳn so với m n cưa ủ không được b ung dinh dưỡng. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với các công bố trước đây của Tăng Thị Chính (2001), Trần Đình Toại (2008), Phạm Thị B ch Hiên (2011) và Đào Văn Thông (2013) cho rằng các dinh dưỡng b ung có tác dụng gia tăng inh trưởng, phát triển của các vi inh vật trong khối ủ, bao gồm cả vi sinh vật có nguồn gốc từ chế phẩm xạ khuẩn. 3.3.1.3. Liều lượng chế phẩm Kết quả nghiên cứu liều lượng chế phẩm phù hợp cho quá trình ủ mùn xác định với liệu lượng chế phẩm bằng 0,1% nguyên liệu ủ, mật độ vi sinh vật t ng ố trong khối ủ đạt 106 CFU/g và mật độ ạ khuẩn đạt 104 CFU/gr. Khi sử dụng liều lượng chế phẩm bằng 0,3%, mật độ vi sinh vật t ng ố trong khối ủ đạt 107 CFU/g và mật độ ạ khuẩn đạt 106 CFU/g. Các khối ủ sử dụng liều lượng chế phẩm bằng 0,5% và 0,7% nguyên liệu ủ có ự biến động không rõ rệt về mật độ vi sinh vật t ng ố và mật độ ạ khuẩn o với khối ủ sử dụng liều lượng chế phẩm bằng 0,3% nguyên liệu ủ. Liều lượng chế phẩm xạ khuẩn phù hợp sử dụng cho ủ m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ là 0,3 - 0,5 %. 3.3.2. Chất lượng mùn cưa ủ bổ sung chế phẩm xạ khuẩn Chất lượng m n cưa ủ có b ung chế phẩm ạ khuẩn được đánh giá thông qua biến thiên nhiệt độ trong quá trình ủ và tỷ lệ C/N của m n cưa au khi ủ. Kết quả th o dõi nhiệt độ m n cưa ủ tự nhiên và m n cưa ủ b ung chế phẩm ạ khuẩn cho thấy khối ủ th nghiệm đạt nhiệt độ cao nhất au 8 ngày, giảm dần và bằng nhiệt độ môi trường au 30 ngày, trong khi nhiệt độ m n cưa ủ tự nhiên ở 30 ngày đầu luôn tăng và cao hơn nhiệt độ của môi trường. Phân tích hàm lượng đường khử, hàm lượng nitơ t ng ố và tỷ lệ C/N của m n cưa ủ b ung chế phẩm ạ khuẩn au 30 ngày (bảng 3.3) cho thấy m n cưa ủ b ung ạ khuẩn có hàm lượng đường khử và nitơ t ng ố cao hơn m n cưa ủ tự nhiên trong 4 tháng và cao hơn nhiều lần o với m n cưa ủ tự nhiên au 1 tháng. o ánh tỷ lệ C/N giữa các công thức ủ cho thấy m n cưa ủ b ung chế 16
phẩm có tỷ lệ C/N đạt 46,8/1, thấp hơn tỷ lệ C/N của m n cưa ủ tự nhiên trong 4 tháng là 49,5. Bảng 3.3. Thành phần của m n cưa ủ bằng các kỹ thuật khác nhau Hàm lượng Hàm lượng nitơ M n cưa và kỹ thuật ủ Tỷ lệ C/N đường khử (%) t ng ố (%) M n cưa mới, không ủ 0,13 0,50 96,0 M n cưa ủ tự nhiên 1 tháng 0,19 0,55 78,5 M n cưa ủ 1 tháng ử dụng chế 0,87 0,64 46,8 phẩm ạ khuẩn M n cưa ủ tự nhiên 4 tháng 0,67 0,63 49,5 3.3.3. Quy trình sử dụng chế phẩm xạ khuẩn ủ mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ Trên cơ ở các kết quả nghiên cứu về điều kiện ử dụng chế phẩm ạ khuẩn ủ m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ, đề tài xây dựng quy trình ủ mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tóm tắt trong ơ đồ hình 3.2. Hình 3.2. Quy trình ử l m n cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ ử dụng chế phẩm ạ khuẩn 17
3.3.4. Sinh trưởng, phát triển của mộc nhĩ trên mùn cưa ủ bổ sung chế phẩm xạ khuẩn Theo Nguyễn Hữu Đống và cộng ự (2003) ự phát triển của hệ ợi nấm được thể hiện thông qua các chỉ tiêu tốc độ lan ợi, độ dày của ợi, màu ắc của ợi nấm và hướng phát triển của ợi nấm. Kết quả th o dõi phát triển mộc nhĩ trồng trên m n cưa ủ bằng các kỹ thuật khác nhau (bảng 3.4) ác định au cấy giống 5 tuần, mộc nhĩ có hệ ợi màu trắng, mật độ ợi nấm dày, tốc độ lan ợi nhanh đạt trung bình 6,9mm/ngày và mọc k n bịch nấm au 32 ngày, nhanh hơn 4 ngày so với mộc nhĩ trồng trên m n cưa ủ tự nhiên 4 tháng. Mầm quả thể mộc nhĩ trên m n cưa ủ bằng chế phẩm ạ khuẩn uất hiện 4 ngày au khi rạch bịch, trong khi mầm quả thể mộc nhĩ trên m n cưa ủ tự nhiên 4 tháng uất hiện au 5 ngày. Tỷ lệ bịch hỏng khi sử dụng m n cưa ủ b sung chế phẩm xạ khuẩn 1 tháng là 6,7%, trong khi sử dụng m n cưa ủ tự nhiên 4 tháng tỷ lệ bịch hỏng là 10,0% và m n cưa ủ tự nhiên một tháng là 100%. Đường k nh tai nấm trồng trên m n cưa ủ b ung chế phẩm ạ khuẩn ở các thời điểm th o dõi khác nhau đều cao đường k nh tai nấm trồng trên m n cưa ủ 4 tháng th o kỹ thuật truyền thống và tại thời điểm 6 tuần au khi rạch bịch đạt 123,7mm o với 121,5 mm. (Bảng 3.5). Bảng 3.15. Tốc độ phát triển hệ ợi mộc nhĩ trên m n cưa ủ bằng các kỹ thuật khác nhau Chiều dài ợi mộc nhĩ trung bình (mm) sau khi Loại m n cưa cấy giống 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần M n cưa ủ tự nhiên 1 tháng 32,0 51,5 - - - M n cưa ủ 1 tháng ử dụng 48,2 110,9 183,4 232,7 242,6 chế phẩm ạ khuẩn M n cưa ủ tự nhiên 4 tháng 45,6 108,9 177,8 231,5 239,7 CV (%) 2,3 2,2 1,5 1,1 0,7 LSD (5%) 2,21 4,57 4,13 3,73 2,54 Mộc nhĩ trên m n cưa ủ th o kỹ thuật truyền thống và mộc nhĩ trên mùn cưa ủ ử dụng chế phẩm ạ khuẩn cho thu hoạch 2 đợt vào các thời điểm 78 ngày, 136 ngày au khi trồng trên m n cưa ủ ử dụng chế phẩm ạ khuẩn và 90 ngày, 151 ngày au khi trồng đối với m n cưa ủ th o kỹ thuật truyền thống. Như vậy việc ử dụng ạ khuẩn để ủ m n cưa gi p r t ngắn thời gian inh trưởng, phát triển của mộc nhĩ ở cả hai lứa từ 12 đến 15 ngày o với việc kỹ thuật ủ m n cưa truyền thống. 18