Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật Metagenomics; nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3 hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Khánh Hoàng Việt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Trƣơng Nam Hải Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Đỗ Thị Huyền Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ..., ngày … tháng … năm 2020. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực tiễn vô cùng to lớn đối với loài người thông qua các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như là y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô nhiễm môi trường. Do đó, các nghiên cứu về sự đa dạng các trình tự từ vi sinh vật nhằm phát hiện những gen mới để khai thác và ứng dụng chúng vào phục vụ cuộc sống luôn là chủ đề quan trọng được các nhà sinh học đặc biệt quan tâm. Mặc dù vậy, các phát hiện gần đây cho thấy phần lớn (khoảng 99%) các loài vi sinh vật trong môi trường là chưa nuôi cấy được. Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương pháp nuôi cấy thông thường sẽ không thể khai thác được toàn bộ nguồn gen có tiềm năng của vi sinh vật. Trong giai đoạn gần đây, thông qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự toàn bộ hệ gen của tất cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, các gen từ vi sinh vật, kể cả vi sinh vật không nuôi cấy đã được nghiên cứu, đánh giá một cách tổng thể. Tại nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung như hiện nay, các phụ phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose chiếm phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như các hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết
2 để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ nguyên liệu hóa thạch. Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm. Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển hình như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose. Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) đã giải mã DNA đa hệ gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh Ninh Bình và Thanh Hóa. Kết quả từ 8,6 Gb dữ liệu, đề tài đã khai
3 thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới việc đánh giá đa dạng các trình tự cellulase có cấu trúc module, tìm ra cấu trúc module đặc thù mới cho nghiên cứu vai trò của module đến hoạt tính của enzyme. Do đó, chúng tôi đã thực hiện Luận án: “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật Metagenomics; - Nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3 hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase. 3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu chính sau: 1. Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase và các cellulase có cấu trúc module được mã hóa từ các khung đọc mở (ORF) trong dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật dạ cỏ dê tại Việt Nam. 2. Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình cho nghiên cứu biểu hiện và xác định vai trò của vùng chưa biết chức năng. 3. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được lựa chọn (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module (Fn3, XFn3, Egc, Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO.
4 4. Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến khả năng phân giải cellulose của enzyme. 5. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module. 4. Những đóng góp mới của luận án 1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig. Trong số các cellulase hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu. 2. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3, Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC. 3. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4. Enzyme ổn định và bền ở nhiệt độ dưới 60oC trong 90 phút. Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml. Hoạt tính enzyme tăng 2 lần khi sử dụng 40 mM Mn2+ và giảm khi bổ sung các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+), và 6 loại hóa chất (SDS, urea, 2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100).
5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cellulose Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các đơn phân β-D-glucose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Sử dụng nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo như cellulose trong một số ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, sản xuất các nhiên liệu sinh học, hóa chất tinh khiết đang được xem là xu hướng phát triển bền vững cả về mặt kinh tế và môi trường. 1.2. Cellulase Cellulase là nhóm enzyme quan trọng, có khả năng cắt mối liên kết -1,4-glycoside trong phân tử cellulose tạo thành sản cuối cùng có giá trị là glucose. Cellulase thường được chia thành ba loại chính (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase) với cơ chế phân cắt khác nhau. Cấu trúc của cellulase có thể chỉ gồm module xúc tác hoặc bao gồm module xúc tác liên kết với module bổ sung như CBM hoặc module chưa rõ chức năng (FN3, Ig). 1.3. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen Metagenomics là thuật ngữ bao gồm các kỹ thuật sinh học phân tử, tin - sinh học cho phép nghiên cứu đa hệ gen của tất cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường mà không thông qua nuôi cấy. Metagenomics đã được chứng minh là phương pháp hiệu quả để khai thác các enzyme, hoạt chất sinh học mới cho nhiều ứng dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ khai thác các cellulase mới, đặc biệt là cellulase có cấu trúc module (FN3, Ig) từ bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase. Bộ dữ liệu này được phân tích từ 164.644 ORF đã được lắp ráp từ 8,46 Gb dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê Việt Nam.
6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc  Đối tượng nghiên cứu: Bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase từ dữ liệu DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê.  Các chủng vi sinh vật, plasmid của hãng Invitrogen (Mỹ), mồi PCR được đặt tổng hợp tại GenScript (Mỹ); hóa chất của Bio- Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật Biến nạp DNA plasmid vào E. coli (Froger et al., 2007); tách chiết DNA plasmid từ E. coli và điện di trên gel agarose (Sambrook et al., 2001); tinh chế DNA từ gel agarose sử dụng bộ kit DNA Qiagene – QIAquick Gel Extraction Kit; tối ưu mã bộ ba dựa trên phần mềm trực tuyến của Genscript (Rare Codon Analysis Tool). 2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein Tinh chế protein bằng cột sắc kí ái lực Ni-NTA (Invitrogen) và xác định độ sạch bằng Quantity One (Bio-Rad); định lượng protein bằng Bradford (Bradford, 1976); xác định hoạt tính endoglucanase trên cơ chất CMC (Miller, 1959) và trên giấy lọc theo phương pháp của Camassola và cộng sự (2012) với một số cải biển nhỏ; xác định hoạt tính cellulase trên đĩa thạch agar-CMC (Teather et al., 1982) và dựa vào phân tích zymogram (Champasri et al., 2015); đánh giá tác động của enzyme lên bề mặt giấy lọc bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét SEM (Kataeva et al., 2002). 2.2.3. Các phương pháp tin sinh học Nghiên cứu Pfam của các trình tự dựa trên CSDL PFAM (http://pfam.janelia.org/search) và vùng bảo thủ sử dụng BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.); dự đoán cấu trúc bậc ba của enzyme sử dụng phần mềm trực tuyến Phyre2 và Swiss model; khả năng chịu kiềm/acid sử dụng phần mềm AcalPred và khả năng chịu nhiệt của enzyme sử dụng phần mềm TBI. 2.2.4. Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê, Microsoft Excel để tính toán và trình bày kết quả dưới dạng ±SE (Standard Error).
7 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase suy diễn từ 816 khung đọc mở 3.1.1. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase Từ 816 ORF mã hóa cellulase đã được chú giải chức năng thuộc 11 họ GH khác nhau (Bảng 3.1). Trong đó, họ GH3 (400 ORF) và GH5 (192 ORF) được xác định là họ GH phổ biến nhất chiếm tỷ lệ lần lượt là 49% và 23,5%. Các trình tự hoàn thiện (297 ORF) được phát hiện tồn tại ở dạng cấu trúc chỉ chứa vùng xúc tác hoặc chứa thêm module chưa rõ chức năng (FN3, Ig). Trong đó, các ORF thuộc họ GH3 có tới 90,9% các trình tự có chứa module FN3; 100% các ORF họ GH9 chứa module Ig và chỉ 1 module FN3 đi kèm với GH5. Do đó, các module FN3, Ig không chỉ đơn giản là các vùng nối mà còn thể hiện một số chức năng sinh học chưa được xác định rõ ràng. Bảng 3.1. Tổng hợp các trình tự được chú giải mã hóa cho các enzyme thủy phân cellulose dựa trên cơ sở dữ liệu COG và KEGG Họ Số Họ Số Module Module GH ORF GH ORF GH1 GH1 16 GH16 GH16 33 GH3 GH3 198 GH16-CBM4 2 Fn3-GH3 202 GH44 GH44 2 GH5 GH5 189 GH48 GH48 1 Fn3-GH5 1 GH64 GH64-CBM6 1 GH5-CBM2 1 GH74 GH74 1 GH5-CBM37 1 GH94 GH94 50 GH8 GH8 48 CBM63 CBM63 1 GH9 GH9 11 FN3 FN3 10 GH9-Ig 30 - - 14 GH9-CBM3 2 GH9-CBM37 1 GH9-dockerin 1
8 3.1.2. Đánh giá đa dạng cấu trúc của cellulase hoàn thiện có cấu trúc module Trong số 243 ORF mã hóa cellulase chứa cấu trúc module có 148 ORF có cấu trúc hoàn thiện (131 ORF chứa FN3, 17 ORF chứa Ig). Trong đó, toàn bộ 17 ORF mã hóa endoglucanase GH9 có chứa module Ig (Ig-GH9); 131 ORF hoàn thiện có chứa module FN3 thì có 130 ORF (99,2%) mã hóa beta-glucosidase GH3 (GH3-Fn3) và chỉ duy nhất 1 ORF mã hóa endoglucanase GH5 (Fn3-GH5). Module FN3 đứng trước vùng xúc tác endoglucanase GH5 ở đầu N là cấu trúc hiếm gặp cần được nghiên cứu để xác định vai trò của module này đến hiệu quả thủy phân của enzyme. 3.1.3. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase Để hiểu rõ hơn về cộng đồng vi khuẩn và vai trò của chúng trong quá trình tiêu hóa cellulose ở dạ cỏ dê Việt Nam, chúng tôi đã xác định nguồn gốc của 816 ORF mã hóa cellulase. Trong đó, 221 ORF mã hóa cellulase đã được phân loại chủ yếu thuộc ngành Bacteroidetes (153 ORF) và Firmicutes (53 ORF) với tỷ lệ tương ứng là 69,2% và 24,0%. Bacteroides uniformis (29 ORF), Prevotella buccae (25 ORF) được xác định là 2 loài chiếm ưu thế nhất mang các gen mã hóa cellulase; Ruminococcus flavefaciens (7 ORF) được xác định là loài điển hình thuộc nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase có khả năng phân giải mạnh nguồn sinh khối cellulose. 3.1.4. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy diễn từ ORF được chú giải mã hóa cho cellulase Dựa trên cả 2 CSDL là NR và CAZy, 297 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase có độ tương đồng dưới 85% (trình tự mới) với tỷ lệ lần lượt là 80,1% và 77,4%. Trong 148 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase có cấu trúc module có 17 ORF hoàn thiện mã hóa endoglucanase chứa module Ig đều là trình tự mới; 131 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 có 90 trình tự mới chiếm trên 68% (89 ORF mã hóa beta-glucosidase, 01 ORF mã hóa
9 endoglucanase). Từ bộ dữ liệu này hứa hẹn sẽ khai thác được nhiều gen mới, đặc biệt là các trình tự hoàn thiện mã hóa cellulase có chứa module như FN3, Ig. 3.1.5. Ước đoán một số tính chất của enzyme suy diễn từ trình tự Ước đoán nhanh một số điều kiện tối ưu cho enzyme như khoảng pH, nhiệt độ hoạt động, giá trị pI là công việc cần thiết để sàng lọc nhanh các gen ứng viên cho nghiên cứu ứng dụng. 243 ORF mã hóa cho cellulase có cấu trúc module được ước đoán phần lớn bền ở khoảng nhiệt độ từ 55-65oC (130 ORF), hoạt động ở pH kiềm (139 ORF) và giá trị pI từ trên 5-6 (146 ORF). Trong 148 trình tự hoàn thiện chứa module FN3 và Ig xác định được 2 trình tự (1 trình tự Ig-GH9 và 1 trình tự endoglucanase FN3-GH5) có pI cao hơn 9. 3.2. Nghiên cứu lựa chọn các trình tự có cấu trúc module điển hình cho nghiên cứu vai trò của module 3.2.1. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3 Module FN3 trong cấu trúc của endoglucanase GH5 được phát hiện là cấu trúc hiếm gặp so với cấu trúc phổ biến là module FN3 trong beta-glucosidase GH3 được lựa chọn để nghiên cứu. Trình tự gen mã hóa cho endoglucanase trưởng thành có kích thước 1545 nucleotit. Kết quả so sánh tương đồng bằng BLASTN và phân loại bằng phần mềm MEGAN cho thấy gen có nguồn gốc từ Ruminococcus bicirculans. Khi so sánh trình tự amino acid của endoglucanase GH5 bằng BLASTP, trình tự này có độ tương đồng 60% so với endoglucanase mã CDC67342.1 của loài vi khuẩn phổ biến trong dạ cỏ dê là Ruminococcus sp. CAG:57. Khảo sát vùng bảo thủ bằng SwissProt cho thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất (49%) so với khuôn của endoglucanase 3pzt.1.A, với độ bao phủ là 53%, có cấu trúc monomer và phối tử là Mn (Hình 3.7). Sử dụng công cụ Phyre2 cho thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất với khuôn
10 c3pzvB endoglucanase (độ tin cậy 100%), có vùng chức năng tách biệt rõ ràng, vùng đầu N có cấu trúc FN3 tách biệt (Hình 3.8). Mn Hình 3.7. Khảo sát vùng Hình 3.8. Khảo sát vùng bảo thủ bảo thủ bằng SwissProt bằng Phyre2 3.2.2. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3 Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 chứa module FN3 được dự đoán hoạt động ở môi trường pH axit, có khả năng bền ở dưới 55oC và có chỉ số pI tương đồng và luôn ở mức cao ở cả vùng chưa biết chức năng (X domain, module FN3) và vùng hoạt tính (Egc). Chỉ số pI trên toàn phân tử enzyme và của các module tương đồng sẽ giúp cho việc nghiên cứu, biểu hiện và tối ưu một số điều kiện thủy phân của enzyme trở lên thuận lợi hơn. 3.3. Tách dòng gen XFn3Egc 3.3.1. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự XFn3Egc Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 (gen XFn3Egc) được tối ưu có tỷ lệ các bộ ba có khả năng sử dụng tốt là 97% so với 46% trước khi tối ưu. Các mã bộ ba được tối ưu có tới 86% trình tự có mức độ phù hợp từ 91-100% so với trước tối ưu chỉ có 49%. Trình tự gen trước và sau khi tối ưu để biểu hiện trên E. coli được mô tả tại Hình 3.10. Gen XFn3Egc sau khi được tối ưu đã được tổng hợp nhân tạo và đưa vào pET22b(+) tại vị trí NcoI+XhoI. Vector mang gen được đặt tên là pET22-XFn3Egc.
11 Hình 3.10. Trình tự gen XFn3Egc trước (A) và sau tối ưu các mã bộ ba để biểu hiện trong E. coli (B) (vùng màu vàng là trình tự FN3; vùng màu xanh là vùng hoạt tính; chữ màu đỏ là trình tự được tối ưu)
12 3.3.2. Tạo vector biểu hiện pETSUMO mang gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc Các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được khuếch đại bằng PCR từ khuôn là pET22-XFn3Egc, sau đó được cắt bằng cặp enzyme hạn chế NcoI + XhoI và nối vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp tương ứng. Các gen sau khi được đưa vào vector biểu hiện đã được giải trình tự để kiểm tra và đưa vào biểu hiện trong E. coli. Tuy nhiên, lượng protein được biểu hiện quá thấp và chủ yếu nằm ở pha tủa. Do đó, chúng tôi đã chuyển các gen từ vector pET22b(+) sang vector pETSUMO bằng enzyme hạn chế NcoI và XhoI. Sau khi được nối ghép, các vector pET22SUMO-Fn3, pET22SUMO-Egc, pET22SUMO-Fn3Egc, pET22SUMO-XFn3Egc và pET22SUMO-XFn3 được biến nạp vào tế bào E. coli DH10B để tách dòng gen. Các khuẩn lạc biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LBA để chọn các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Kết quả cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn đơn lẻ, các plasmid đã được cắt mở vòng và khi cắt bằng cặp enzyme giới hạn thì các gen tương ứng được cắt ra có kích thước như tính toán. Như vậy, các vector biểu hiện mang gen đã được thiết kế thành công. 3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho biểu hiện, chúng tôi tiến hành biểu hiện các chủng E. coli BL21 (DE3) mang các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc trong môi trường LB có bổ sung Amp, nhiệt độ biểu hiện 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTD, thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. Kết quả kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide cho thấy, ở pha tổng số cả 5 loại protein đều được biểu hiện tốt, đúng kích thước theo tính toán. Các gen có
13 protein được biểu hiện chủ yếu ở pha tan trừ gen Egc không chứa FN3 chỉ biểu hiện protein nằm ở pha tủa (Hình 3.18). Kết quả thử hoạt tính cellulase của các protein tái tổ hợp biểu hiện ở pha tan trên đĩa thạch aga-CMC cho thấy chỉ có dịch pha tan của SXFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ nhất. Kết quả thử hoạt tính zymogram cho thấy ở bản nhuộm comassie, cả 4 loại protein (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3) mặc dù không được xử lý biến tính và chạy điện di trên gel không biến tính nhưng đều di chuyển đúng vị trí trên bản gel. Ở bản gel nhuộm congo red, xuất hiện 1 band sáng tương tự như đối chứng dương ở vị trí của SXFn3Egc (Hình 3.19). Do đó, gen XFn3Egc biểu hiện được enzyme đúng kích thước như tính toán và thể hiện hoạt tính rõ ràng với cơ chất CMC. Module FN3 được xác định có tác dụng làm tăng tính tan của vùng xúc tác. Vùng X cũng có vai trò nhất định trong việc hỗ trợ cho vùng xúc tác thể hiện hoạt tính cellulase mạnh hơn. Hình 3.18. Điện di đồ protein SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 ở pha tổng số, pha tan, pha không tan được biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3) trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. Đối chứng âm pETSUMO; Marker: protein chuẩn unstained
14 (A) (B) Hình 3.19. Phân tích protein pha tan bằng điện di không biến tính (A) và zymogram (B); Marker: Thang protein chuẩn unstained (Thermo scientific); cellulase: Đối chứng dương (Sigma) 3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp và xác định hoạt tính 3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp Các protein tái tổ hợp được rửa ra hoàn toàn ở đệm thu mẫu có nồng độ 400 mM imidazole. Kiểm tra bằng điện di đồ các phân đoạn tinh chế protein cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện duy nhất băng có kích thước tương đương với protein đích cần tinh chế. Kết quả đánh giá độ sạch bằng phần mềm Quantity One cho thấy các protein tái tổ hợp sau tinh chế đều có độ sạch trên 99%. Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế SFn3 (F1-F9) tinh chế SFn3Egc (F1-F7)
15 Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế SXFn3Egc (F1-F10) tinh chế SXFn3 (F1-F8) 3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế 3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC Kết quả đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC của protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế cho thấy chỉ có SXFn3Egc và SFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ nhất. Vòng hoạt tính thủy phân cellulose của SXFn3Egc có kích thước lớn hơn (hoạt tính mạnh hơn) so với SFn3Egc. 3.5.2.2. Đánh giá khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của enzyme trên CMC Khi phối trộn các protein chưa biết chức năng (SFn3, SXFn3) và enzyme chứa vùng hoạt tính, khả năng thủy phân cơ chất CMC của hỗn hợp đều tăng. Phối trộn SFn3 và SXFn3 với SFn3Egc đều làm tăng hoạt tính lên lần lượt là 74,5% và 49,9%. Phối trộn SXFn3 và SFn3 với SXFn3Egc hoạt tính đều tăng khoảng 27% (Hình 3.29). Kết quả cho thấy, module FN3 khi phối trộn có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme trên cơ chất CMC lên đáng kể so với thử nghiệm chỉ với enzyme riêng rẽ. Từ kết quả này có thể đưa ra giả thuyết là do module FN3 có khả năng phản ứng với CMC, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất.
16 Hình 3.29. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein tái tổ hợp sau tinh chế trên cơ chất CMC; ĐC +: Cellulase (Sigma) 3.5.2.3. Đánh giá khả năng của SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính enzyme trên giấy lọc Trên cơ chất giấy lọc, SFn3 và SXFn3 có khả năng làm cho hoạt tính của SXFn3Egc tăng lên tương ứng là 86,8% và 13,6% so với khi thử nghiệm riêng rẽ chỉ có SXFn3Egc. SFn3Egc khi phối trộn với SFn3 và SXFn3 cũng đều có hoạt tính tăng so với khi thử nghiệm phản ứng chỉ có SFn3Egc nhưng sự sai khác không có ý nghĩa thống kê. Kết quả này chứng tỏ, SFn3 và SXFn3 khi được phối trộn đã có tác dụng làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của enzyme trên cơ chất giấy lọc. Vì SFn3 và SXFn3 không thể hiện được hoạt tính cellulase nên các protein này chỉ có tác dụng hỗ trợ giúp enzyme SXFn3Egc, SFn3Egc tăng khả năng thủy phân cơ chất. Khả năng làm tăng hoạt tính enzyme trên cơ chất giấy lọc của protein chứa module FN3 có thể do hai giả thiết sau: (1) module FN3 có khả năng làm nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể của giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận dễ dàng hơn với sợi cellulose để thực hiện
17 phản ứng thủy phân; (2) module FN3 làm tăng ái lực với cellulose, giúp enzyme bám dính tốt với cơ chất. Hình 3.30. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein sau tinh chế trên cơ chất giấy lọc; ĐC +: Cellulase (Sigma) 3.5.3. Đánh giá khả năng FN3 tăng ái lực của enzyme với cơ chất 3.5.3.1. Cơ chất CMC Hoạt tính cellulase của SXFn3Egc, SFn3Egc đều tăng trên cơ chất CMC được xử lý hấp phụ trước với SFn3 và SXFn3 (Hình 3.31).Trên cơ chất được hấp phụ với SFn3 hoặc SXFn3, hoạt tính của SXFn3Egc đều tăng mạnh hơn so với SFn3Egc. Hoạt tính của SXFn3Egc và SFn3Egc trên cơ chất CMC được phản ứng hấp phụ trước SFn3 tăng lần lượt là 31,5% và 23,8%. Tuy nhiên, hoạt tính của 2 enzyme này trên cơ chất CMC được hấp phụ với SXFn3 chỉ tăng lần lượt là 7,3% và 5,9%. Như vậy, SFn3 và SXFn3 có khả năng thúc đẩy phản ứng của enzyme với cơ chất lên rõ rệt thông qua việc làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất CMC. Quan sát hình dạng của các băng protein trên bản gel không biến tính sau phản ứng có cơ chất CMC, SFn3 và SXFn3 đều thể hiện khả năng liên kết, phản ứng với cơ chất CMC. SFn3 và SXFn3 có khả năng làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất, làm cho phản
18 ứng diễn ra mạnh hơn so với phản ứng chỉ có enzyme. SXFn3Egc khi phối trộn với SFn3 hầu như đã phản ứng hết với cơ chất CMC và không còn quan sát được rõ trên bản gel so với khi được phối trộn với SXFn3 (Hình 3.32). Điều này có thể giải thích lý do enzyme được phối trộn với SFn3 thường cho có hiệu quả thủy phân cơ chất tốt hơn so với khi được phối trộn với SXFn3. Hình 3.31. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ chất CMC đến hoạt tính của SFn3Egc và SXFn3Egc Hình 3.32. Kiểm tra khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất CMC; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific)