Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm phân tích đặc điểm hình thái, phân tử và đa dạng của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên. Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát triển của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp. Ở TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2019
2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trịnh Quang Pháp Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Phan Kế Long Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tuyến trùng ký sinh gây sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh cố định gây sần rễ. Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây chủ khác nhau ở và phân bố rộng trên thế giới, làm suy giảm năng suất và sản lượng của các loại cây trồng. Vì vậy, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp trên thế giới. Tính đến năm 2006, có 111 loài đã được mô tả và có 18 loài Meloidogyne ký sinh trên cây cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, tại Tây Nguyên được ghi nhận sự xuất hiện của cả 5 loài này. Các nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên sự hiện diện và gây hại của nhóm tuyến trùng Meloidogyne rất lớn đặc biệt trên cây cà phê và hồ tiêu, làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để thay thế trồng những cây trồng khác . Những tiêu chuẩn chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử dụng tấm cắt cutin vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc điểm hình thái vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng hình thái giữa các loài. Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm hình thái của các quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các cây chủ khác nhau hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn nên gặp nhiều khó khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái. Vì vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử đã được sử dụng hiệu quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp., chủ yếu sử dụng các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã hóa giữa 2 vùng gen COII- 16s-rRNA đã hỗ trợ rất nhiều cho các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ. Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và
2 định hướng tới nền nông nghiệp an toàn. Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây hiện tượng kháng thuốc cũng như ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có ích, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi. Do đó, các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn, khi sử dụng các vi sinh vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật được xem là một trong những biện pháp rất tiềm năng. Xuất phát từ thực tiễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp. ở Tây Nguyên’’ 2. Mục tiêu nghiên cứu  Xác định các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây trồng chính ở khu vực Tây Nguyên.  Phân tích đặc điểm hình thái, phân tử và đa dạng của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên.  Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát triển của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu phân bố, tần suất bắt gặp và mật độ của tuyến trùng sần rễ trên một số cây trồng quan trọng: cà phê, hồ tiêu, rau màu và cây trồng xen ở Tây Nguyên.  Nghiên cứu về hình thái và đa dạng của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên.  Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên dựa trên phân tích các vùng gen nhân và gen ty thể.  Đánh giá khả năng phòng trừ Meloidogyne incognita của một số vi sinh vật đối kháng như: nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus và hợp chất 4-hydroxyphenylacetic acid 4- HPAA. 4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học
3  Thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được bổ sung mới ở Tây Nguyên, trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne cũng như sự phân bố của chúng. Mô tả và ghi nhận loài mới, Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê.  Các chỉ tiêu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây chủ và địa điểm được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi hình thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu quan trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của vân cutin vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi ấu trùng.  Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và tiến hóa cũng như phát sinh loài. Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử. Bên cạnh đó, lần đầu tiên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS, D2D3) và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt ở Việt Nam trên Genbank.  Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita phổ biến trên nhiều cây trồng. Ý nghĩa thực tiễn  Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng gây sần rễ hại cây trồng là tiêu chuẩn trong phòng trừ hiệu quả. Cung cấp số liệu về khả năng ký sinh, ký chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây trồng tránh bị lây nhiễm. Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối với từng cây trồng nhất là đối với cà phê và hồ tiêu cũng như những cây trồng xen và luân canh.  Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo.  Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, hợp chất 4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được
4 cân bằng sinh thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên. 5. Những đóng góp mới của luận án  Luận án lần đầu tiên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc trưng hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ tiêu và các cây trồng xen ở Tây Nguyên. Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới nhiễm tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam. Bổ sung 145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài tuyến trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank.  Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n. sp. và 01 loài còn lại đã được gửi công bố.  Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M. incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm: 179 trang; Mở đầu 4 trang, tổng quan tài liệu 22 trang. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:13 trang; kết quả và thảo luận: 119 trang; Kết luận và kiến nghị: 2 trang; Luận án gồm 34 bảng, 39 hình và 183 tài liệu tham khảo. Các danh mục các công trình công bố, phụ lục đi kèm. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu: Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến trùng sần rễ trên rễ. Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M. exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne hiện tại được theo hệ thống Karsen et al. (2013) 1.1.2. Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne: Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1) nằm trong trứng; ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2) là giai đoạn di động; ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực được cố
5 định trong rễ. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. có 2 hình thức sinh sản khác nhau: sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài còn lại là sinh sản lưỡng tính (parthenogensis) không cần con đực. 1.1.3. Khả năng gây hại trên một số cây trồng: Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên hầu như tất cả các loại cây trồng, lên tới 5500 loại cây khác nhau, bao gồm từ các cây công nghiệp, nông nghiệp cho đến các cây cỏ dại. Thiệt hại cho kinh tế của thế giới hàng năm ước tính lên tới hàng trăm tỷ đô la . 1.1.4. Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne 1.1.4.1. Phương pháp phân tích hình thái: Chitwood (1949) và Jebson (1983) sử dụng chi tiết các đặc điểm: kim hút, DGO, đặc điểm tấm cắt cutin của con cái, vùng đầu con đực, hình thái lượng của kim hút; khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng (DGO) để mô tả các loài. Các nghiên cứu gần nhất đã sử dụng chi tiết các chỉ số hình thái và hình thái lượng. 1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử: Các phương pháp hiện nay bao gồm phân tích các vùng gen ribosome (rDNA) trong hệ gen nhân và các vùng gen trong hệ gen ty thể (mtDNA). 1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam. 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chung tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam: Các nghiên cứu công bố đã đề cập đến nhiều khía cạnh khác nhau, trong đó chủ yếu là thành phần loài, phạm vi ký chủ, sự phát triển số lượng quần thể tuyến trùng và các biện pháp phòng trừ. Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) có 5 loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne. Cho đến nay các nghiên cứu còn hạn chế chủ yếu tập trung vào một số phương pháp phòng trừ. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên 1.2.2.1. Tổng quan Tây Nguyên: Tây Nguyên là khu vực cao nguyên bao gồm 5 tỉnh, xếp theo thứ tự vị trí địa lý từ bắc xuống nam gồm Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng đây là một trong 3 tiểu vùng của miền Trung Việt Nam. Nằm trong vùng nhiệt đới xavan, khí hậu ở Tây Nguyên được chia làm hai mùa: mùa mưa từ tháng 5 đến hết tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Tây Nguyên có đến 2
6 triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức chiếm đến 60% diện tích đất bazan trên cả nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong hoá sâu, phân bố tập trung thuận lợi cho việc hình thành các vùng chuyên canh qui mô lớn với những cây công nghiệp như cà phê, ca cao, hồ tiêu, nên đây là vùng có diện tích cây công nghiệp lớn nhất cả nước với các cây trồng xuất khẩu chủ lực là cà phê và hồ tiêu. 1.2.2.2. Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên Tuyến trùng sần rẽ Meloidogyne được xem được xem là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên các vùng trồng cà phê và hồ tiêu ở Tây Nguyên do gây ra các bệnh vàng lá, còi cọc, chậm lớn trên cà phê, bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu. 1.3. Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne. Phòng trừ sớm là giải pháp quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng. Hiện nay, các biện pháp phòng trừ được sử dụng khi cây đã có biểu hiện triệu chứng thì bệnh do tuyến trùng gây ra đã tương đối nặng nên việc phòng trừ sẽ khó có hiệu quả hoặc có tác dụng chậm trễ. Biện pháp sinh học hay phòng trừ sinh học là một biện pháp tạo ra các sản phẩm tác động trực tiếp hoặc gián tiếp tới tuyến trùng ký sinh thực vật. Nấm Paecilomyces javanicus có khả năng ký sinh gây chết tuyến trùng Meloidogyne. Dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và hoạt chất kháng sinh 4-HPAA do chủng vi khuẩn này sinh ra có khả năng ức chế tuyến trùng Meloidogyne incognita. CHƢƠNG 2 THỜI GIAN, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne . 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Một số cây trồng vùng Tây Nguyên: cà phê, hồ tiêu, rau màu, ổi, lúa... Nấm Paecilomyces javanicus, dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, Kháng sinh 4-Hydroxyphenylacetic (4-HPAA) (Hãng Sigma) 2.1.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian khảo sát thực địa được tiến hành từ tháng 1/ 2014 đến tháng 10 năm 2017 tại một số địa điểm thuộc các huyện: CuM‘ga (tỉnh Đắk Lắk); Di Linh (tỉnh Lâm Đồng); Kiến Đức (tỉnh Đắk Nông); Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và Đắk Hà (tỉnh Kon Tum)
7 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu 2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất Tuyến trùng được tách lọc từ đất theo phương pháp được mô tả của Nguyễn Ngọc Châu (2003). 2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ Phương pháp tách mẫu rễ theo xay nghiền: theo mô tả Nguyễn Ngọc Châu (2003). Các mẫu rễ có nốt sần sẽ được soi trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi để tách con cái và túi trứng.Con cái được phân tích sơ bộ hình thái và ủ nở trứng thành ấu trùng để nhân nuôi phục vụ cho các nghiên cứu 2.2.4. Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne được nhân nuôi trên cây cà chua theo phương pháp được mô tả của López-Pérez et al. 2011. 2.2.5.Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng Phương pháp cố định tuyến trùng theo Courtney et al., 1955, Phương pháp làm tiêu bản cố định; Phương pháp cắt tấm cutin vùng hậu môn- sinh dục (Hartman & Sasser, 1985). 2.2.6. Nghiên cứu hình thái Phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne dựa trên khóa phân loại của Eisenback (1985), Hewlett & Tarjan (1981; 1983), Jepson (1987), Karssen (2002), Kazachenko & Mukhina (2013) kết hợp với các tài liệu khác có liên quan. 2.2.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2.7.1. Tách chiết DNA: Theo Holterman et al. 2009: Ấu trùng được ủ nở từ các túi trứng của từng con cái sẽ được sử dụng để tách chiết DNA. 2.2.7.2. Phản ứng PCR Multiplex-PCR phân loại nhanh các loài Meloidogyne: 3 loài M. arenaria, M. incognita, M. javanica sử dụng đồng thời 3 cặp mồi đặc hiệu Far/Rar; Mi2F4/Mi1R1; Fjav/Rjav được mô tả theo Kiewnick et al. (2013). PCR khuếch đại các vùng gen: Các vùng gen được sử dụng trong nghiên cứu gồm gen ribosome (D2D3, ITS) và các vùng gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) 2.2.7.3. Điện di sản phẩm: Kết quả phản ứng Multiplex PCR được so sánh theo kết quả của Kiewnick et al. (2013).
8 2.2.7.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA: bằng kít GenJet PCR Purification (Thermo Scientific- Đức) theo quy trình của nhà sản xuất và được gửi giải trình tự ở công ty Macrogen- Hàn Quốc. 2.2.7.5. Phân tích trình tự DNA: Các trình tự sẽ được lựa chọn để phân tích, so sánh bằng chương trình ClustalW trong phần mềm BioEdit (Hall. 1999) 2.2.7.6. Thiết lập cây phát sinh chủng loại: Các trình tự của từng vùng gen sẽ được thiết lập cây phát sinh chủng loại theo phương pháp ML (Maximum Likelihood) với mô hình phù hợp nhất cho từng trình tự bằng chương trình Modeltest trong MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013), 2.2.8. Nghiên cứu khả năng phòng trừ trong điều kiện phòng thí nghiệm 2.3.8.1. Chuẩn bị nguồn vi sinh vật: Nấm Paecilomyces javanicus cung cấp bởi trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN, Vi khuẩn Lysobacter antibioticus từ chế phẩm GCM của Đại học Quốc gia Chonnam (Hàn Quốc)., Hợp chất 4-HPAA từ hãng Sigma. 2.2.8.2. Đánh giá khả năng ức chế tuyến trùng M. incognita: Các phương pháp được thực hiện theo phương pháp mô tả của Yoon et al., 2012 có hiệu chỉnh. 2.2.8.3. Phân tích số liệu: Số liệu để tính tỷ lệ trứng nở (%) và tỷ lệ chết của ấu trùng (%) được chuyển sang hàm Asin ((x/100)^1/2) và phân tích so sánh ANOVA trong chương trình thống kê SPSS 20. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 3.1.1. Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số cây trồng ở Tây Nguyên Kết quả phân tích 553 mẫu trên 22 cây chủ khác nhau ở các tỉnh thuộc Vùng Tây Nguyên với sự hiện diện của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở 17/22 cây ký chủ với tần suất bắt gặp trung bình là 55,6%. Lớn nhất được ghi nhận trên cây hồ tiêu 84,3%, cà chua 83,3% và cà phê 68%, các mẫu lạc, bơ, sầu riêng, sắn không ghi nhận được sự xuất hiện của của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne. 3.1.2. Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu và cây chủ Trên cơ sở phân tích hình thái dựa trên tấm cutin vùng chậu của con cái, hình dạng đuôi của ấu trùng , phần đầu của con đực của các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne và phản ứng Multiplex-PCR đã ghi nhận được 7 loài ở các địa điểm nghiên cứu: M. incognita, M. javanica,
9 M. arenaria, M. enterolobii, M. graminicola và xác định 02 loài mới cho khoa học, một loài được đặt tên và mô tả với tên Meloidogyne daklakensis và một loài chưa được công bố tạm đặt là Meloidogyne sp. 3.2. Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên 3.2.1. Loài M. incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái & hình thái lượng Con cái: Cơ thể dạng quả lê đến hình cầu, thân tròn, cổ ngắn đến hơi dài. Phần cutin với vòm lưng nhô cao, hơi vuông và bóp hẹp lại từ hai phía bên, vân bụng tròn mịn, đứt đoạn không đều, cấu trúc vulva, anus và mút đuôi rõ ràng. Vùng bên đặc trưng với dạng đứt nối giữa các vân vùng bụng và vùng lưng. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, hơi nhô cao so với môi giữa. Kim hút to khỏe, chiều dài từ 15- 21µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau . Ấu trùng: Cơ thể dạng giun, thon nhỏ vào ở phần đầu và đuôi. Đuôi thuôn nhọn với phần hyaline dài từ 9,2-17,8µm chiếm khoảng 33% chiều dài đuôi. 3.2.1.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể M. incognita trong nghiên cứu có sự đa dạng cao về các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng trên các cây chủ và các địa điểm thu mẫu khác nhau. Trong đó các đặc điểm tấm cắt cutin vùng hậu môn- sinh dục, đặc điểm kim hút, chiều dài hyaline ở ấu trùng và đặc điểm vùng đầu của con đực giữa các quần thể là ít biến đổi nhất. 3.2.2. Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949 3.2.2.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể lớn, hình cầu. Phần môi nhô lên tách biệt với cơ thể từ 1-2 vòng đầu ,với phần cổ dài. Nhóm này với đặc trưng rõ rệt nhất ở tấm cutin vùng sinh dục là có 2 đường bên rất rõ ràng, chạy từ phía trong ra đến hết vân, vùng lưng cao vuông và hơi hẹp, cho đến thấp tròn, hai vùng bên hơi phình ra hai phía, các vân mịn và mờ dần phía dưới hậu môn. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể với chiều cao môi từ 4,2-7,0µm. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, hơi nhô cao so với môi giữa. Kim hút to
10 khỏe, chiều dài trung bình từ 17,8-19,7µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Cơ thể có dạng giun, vót nhọn ở phần đầu và đuôi. Đuôi hình chóp dài với mút đuôi tròn, chiều dài đuôi từ 31-63µm, phần hyaline chiếm 1/3 chiều dài đuôi với chiều dài từ 9,1-16,7µm, hình dạng đuôi biến đổi. 3.2.2.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể M. javanica có sự biến đổi các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng trên các cây chủ và vùng thu mẫu khác nhau. 3.2.3. Loài M. arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 3.2.3.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể hình quả bầu, hồ lô, cổ ngắn đến hơi dài. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục với đặc điểm phần lưng hơi phình sang hai bên, vùng lưng tròn, thấp sát vào phía phasmid, không có đường bên nhưng có một đường dài chạy xen giữa các vân sang hai phía làm đường giao nhau cho vân vùng lưng và bụng, vulva hẹp với chiều dài vulva từ 16-26µm. Khoảng cách phasmid nhỏ, mút đuôi không rõ ràng. Con đực: Cơ thể hình giun, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi nhô lên, tách biệt với cơ thể, chiều cao môi 4,2-5,8. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng tròn, đĩa môi nằm ngang với môi giữa. Kim hút to khỏe, chiều dài trung bình từ 14,3-20µm. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Có dạng giun, vót nhọn ở phần đầu và đuôi. Đuôi hình chóp dài với mút đuôi tròn, chiều dài từ 39-60µm, phần hyaline chiếm 1/3-1/4 chiều dài đuôi với chiều dài từ 12-15,7µm. Hình dạng đuôi biến đổi nhiều. 3.2.3.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các quần thể loài M. arenaria có các chỉ số chiều dài, chiều rộng, chiều dài cổ, chiều dài từ đầu- lỗ bài tiết, các đặc điểm hình thái và hình thái lượng tấm cutin ở con cái, các đặc điểm chiều cao môi, chiều dài đuôi, phasmid, b, b’, c, c’ ở con đực, chỉ số chiều dài kim hút, chiều dài đuôi, chiều dài hyaline ở ấu trùng ít biến đổi. 3.2.4. Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 3.2.4.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Con cái: Cơ thể dạng tròn hoặc quả lê với phần cố từ ngắn đến hơi dài. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục thường xuyên có dạng ô van, với các vân thô và nhẵn; vòm lưng thường từ trung bình đến cao, thường xuyên có dạng vuông, một số hơi tròn. Đường bên hơi mờ. Vân của vùng trung tâm thường mịn hoặc nhẵn, mấu đuôi quan sát được; ống phasmid lớn.
11 Con đực: Cơ thể màu trắng đục, dạng giun dài, thuôn nhỏ ở hai đầu. Đầu dạng bằng, vùng môi hơi cao từ 4,2-5,6µm tách biệt với cơ thể. Môi giữa và đĩa môi tạo thành dạng quả tạ, đĩa môi dạng tròn, nằm ngang so với môi giữa. Kim hút khá mảnh. Núm gốc lớn, dạng tròn, tách rời nhau. Ấu trùng: Cơ thể hình giun, thon, mảnh thon dần cả hai phía, phía đuôi nhọn. Phần đuôi khá dài, chóp đuôi nhọn, mút đuôi khá đậm, hyaline dài từ 20,1- 26,7µm, đuôi nhỏ, hình dạng đuôi biến đổi. 3.2.4.2. Đa dạng hình thái và các đặc điểm chẩn loại Các chỉ số chiều dài kim hút, DGO và chiều dài ở ấu trùng là các đặc điểm ít biến đổi nhất ở loài M. enterolobii giữa các mẫu nghiên cứu, đây là các đặc điểm có thể sử dụng để phân loại M. enterolobii kết hợp với các đặc điểm ở tấm cắt cutin vùng hậu môn- sinh dục của con cái. 3.2.5. Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 3.2.5.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng của loài M. graminicola Con cái: Cơ thể hình quả lê, tròn với phần cổ ngắn, thẳng. Phần cutin vùng hậu môn-sinh dục hình tròn vân mịn, vân đều liên tục không bị đứt đoạn, vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva, anus và mút đuôi.. Vulva tròn, nằm ở vị trí trung tâm của vùng không có vân. Con đực: Cơ thể dạng trụ, hình giun, thuôn nhỏ về phía trước hơn về phía sau. Các vòng cutin phân đốt rõ ràng. Vùng môi liên tục với cơ thể hoặc hơi tách biệt bằng một sự thắt lại, gần như phẳng ở phần trước, bao gồm một vòng môi rõ ràng và theo sau bởi 1 hoặc đôi khi là 2 vòng sau môi rộng. Khung đầu kitin hóa mạnh. Kim hút khá khỏe với các núm gốc tròn và nghiêng về phía sau chiều dài từ 13,2-17µm. Ấu trùng : Cơ thể dạng trụ, hình giun và thuôn nhỏ dần về phía hai đầu. các vòng cutin khá mịn và được đánh dấu bởi các vân ngang rõ ràng. Đuôi dài 47,7-74,8µm, đuôi nhọn, nhỏ, mút đuôi vót nhọn, hyaline khá dài, từ 16-24,4µm. 3.2.5.2. Đa dạng hình thái loài M. graminicola 3.2.6. Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen, 2018 3.2.6.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng. Con cái: Cơ thể hình quả lê với phần cổ ngắn, thẳng không bị uốn cong. Phần đầu nhọn. Miệng dạng khe ngang với phần môi phân thành 2 đốt, hơi tách biệt với phần còn lại của cơ thể, đĩa môi không hợp nhất với phần giữa môi và hơi nhô cao, phần môi bên mở rộng. Phần cutin vùng hậu môn-sinh dục hình tròn hoặc bầu dục, vân mịn, vân đều liên tục
12 không bị đứt đoạn, vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva, anus và mút đuôi. Phasmids không rõ. Vulva nằm ở vị trí trung tâm của vùng không có vân. Hình 3.13. Ảnh chụp loài Meloidogyne daklakensis (A-E: con cái: A: hình dạng; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu môn- sinh dục; F-I: ấu trùng: F: phần miệng; G: đường bên; H-I: phần đuôi; K-N: con đực: K, L: phần đầu- miệng; M: đường bên;N: phần đuôi; thước đo:A: 100 µm; B-N: 10 µm; B, C, E, F, G, I, L, M, N: ảnh chụp SEM; A, D, H, K: ảnh chụp kính hiển vi) Con đực: Vùng đầu cao, hơi tách ra khỏi cơ thể bao gồm một vòng môi lớn, môi giữa và đĩa môi tạo thành hình cái nơ, môi bên lơn và có dạng tam giác, hơi thấp hơn đĩa môi và môi giữa; lỗ mở amphid dạng khe ngang lớn khá dài nằm ở giữa đĩa môi và môi bên. Vòng môi sau chia thành bốn phần bởi các khía dọc. Kim hút mập và thẳng, một núm gốc bên phát triển, hai núm còn lại vát về phía sau.
13 Ấu trùng: Cơ thể dài dạng mảnh, thon dài về phía đuôi. Đuôi thuôn dài và nhọn. 3.2.7. Loài Meloidogyne sp. 3.2.7.1. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng Hình 3.16. Ảnh chụp loài Meloidogyne sp. (A-E: con cái: A: hình dạng cơ thể; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu môn- sinh dục; F-K: ấu trùng: F,G: phần đầu ; H: đường bên; I-K: phần đuôi ;L-O: con đực: L,M: phần đầu- miệng; N: đường bên; O: phần đuôi; thước đo: A: 100 µm; B-M:10 µm; B, E, G, H, K, M, N, O: ảnh chụp SEM; A, C, F, I, L: Ảnh chụp kính hiển vi) Con cái: Con cái dạng trong phần đuôi hơi lồi ra ngoài, màu trắng đục. Phần đầu hơi tách biệt với cơ thể, lỗ miệng dạng khe ngang, nằm trong vùng trước miệng hình trứng, bao quanh bởi 6 nhú môi trong. Đĩa môi dạng tròn, hơi
14 nhô cao so với môi. Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục dạng tròn đến oval, các vân nhẵn, liên tục. Vòm lưng thấp và tròn bao quanh vulva và mấu đuôi. Con đực: Phần đầu là cao và tròn, gồm vòng môi lớn và hai vòng sau môi, đôi khi chứa các vòng không hoàn toàn. Vùng đầu là không tách biệt với cơ thể. Các môi phụ lưng và môi phụ bụng hợp nhất thành môi giữa, mỗi môi với hai nhú đầu. Ấu trùng: Cở thể mảnh, thuôn dần đến phần đuôi thuôn dài. Đuôi dạng nón nhọn với chóp tròn không phân đốt. Hyaline rõ ràng. Phasmids nhỏ, rõ ràng 3.3. Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng các loài Meloidogyne 3.3.1. Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne spp. Ở con cái qua phân tích các chỉ số khác biệt (CDA) bằng phần mềm Genstat 12 với 20 chỉ số hình thái lượng ghi nhận được 3 giá trị có ý nghĩa là chỉ số Stl, EP, a và tỷ lệ EP/ST, đây là các chỉ số phù hợp với các mô tả của các loài Meloidogyne.Kết quả phân tích CDA của 26 chỉ số hình thái lượng của con đực chỉ có 2 chỉ số cho vectơ có ý nghĩa là chỉ số b’ và c’ có thể sử dụng trong phân loại các loài Meloidogyne.Trong phân tích CDA của 16 chỉ số hình thái lượng của ấu trùng ghi nhận 3 chỉ số cho chỉ số vectơ có ý nghĩa là chiều cao môi, DGO, Hyaline, b và c’ đây được xem là các chỉ số có thể phân biệt được các loài. 3.3.2. Đa dạng hình thái giữa các loài Meloidogyne spp. Hình 3.21. Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu của con cái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., (Thước đo: 10 µm;)
15 Hình 3.22. Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. (Thước đo: 10 µm) Hình 3.23. Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùg sần rễ Meloidogyne spp., (Mũi tên chỉ vị trí phasmid; thước đo:10 µm)
16 3.4 . Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp. 3.4.1. Phản ứng Multiplex-PCR Kết quả sản phẩm điện di của loài M. incognita cho kích thước 300 bp, loài M. arenaria cho kích thước 420 bp và loài M. javanica cho kích thước 670 bp, phù hợp với nghiên cứu của Kiewnick et al., 2013. Phương pháp này có thể sử dụng để phân loại nhanh 3 loài M. incognita, M. javanica, M. arenaria trong cùng một phản ứng Multiplex-PCR. Hình 3.24. Hình điện di sản phẩm Multiplex PCR (Giếng M: Marker 100; J: M. javanica; A: M. arenaria; I: M. incognita; 1-27: M. incognita ; 28-29: M. graminicola; 30-36: M. javanica; 37-40: M. daklakensis; 41-43: M. enterolobii; 44-48: M. arenaria; 49-50: Meloidogyne sp; +, - : mẫu đối chứng)
17 3.4.2. Phân tích đa dạng di truyền 3.4.2.1 Vùng gen ITS-rDNA Hình 3.25. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene ITS xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình TN92+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank
18 3.4.2.2 Vùng gen D2D3-rDNA Hình 3.26. Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gene D2D3 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình K2+G). Số ở gốc các nhánh là giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%). Các số hiệu phía sau tên loài là ký hiệu mẫu hoặc mã số genbank