Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI -- -- HOÀNG THỊ LỆ THƯƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY TỪ QUẢ DỨA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào TS. Trần Thị Thuý Hà Nội - 2020
Luận án được hoàn thành tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào TS. Trần Thị Thúy Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Vào hồi.... giờ.... ngày.... tháng.... năm 2020 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Trung tâm thông tin thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Hoàng Thị Lệ Thương, Nguyễn Quang Hào (2014), Động thái lên men vang dứa để sản xuất rượu Brandy của chủng Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học, Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30(6S), tr. 587-591. 2. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2016), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và dinh dưỡng đến quá trình lên men vang để sản xuất Brandy từ dứa Queen bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học và công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 12 (73), tr. 23-28. 3. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2017), Taxonomic characterization and identification of Saccharomyces cerevisiae D8 for brandy production from pineapple, Tạp chí sinh học, số 39 (4), tr. 474-482. 4. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Cải biến chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên nhằm nâng cao hoạt lực lên men ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học, số 16 (2): tr. 337 – 344. 5. Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Vai trò của gỗ sồi trong cất giữ brandy dứa ở Việt Nam, Tạp chí sinh học số 40 (2): tr. 130 - 139.
1 MỞ ĐẦU Brandy là loại rượu cao độ chưng cất từ vang chất lượng cao, rất được ưa chuộng. Brandy có tác dụng kích thích thần kinh, tim mạch, tiêu hóa nên sử dụng một lượng nhỏ mỗi ngày rất tốt cho sức khỏe. Rượu brandy phù hợp với nhu cầu của giới trẻ nói riêng và người dân nói chung nên được sử dụng ngày càng nhiều. Tuy nhiên, rượu brandy mà chúng ta sử dụng hiện nay chủ yếu vẫn là nhập ngoại, khối lượng nhập đứng thứ 3 trong số các loại rượu mạnh nhập khẩu vào Việt Nam. Mức tăng trưởng của thị trường brandy bình quân mỗi năm là 18,8% nên rượu có giá thành cao, chưa được sử dụng rộng rãi. Chính vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu trong nước và công nghệ phù hợp để chủ động sản xuất brandy đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng có ý nghĩa quan trọng. Dứa là cây ăn quả phổ biến ở nước ta, được phân bố từ Bắc đến Nam. Năm 2007 tổng sản lượng dứa trong cả nước đạt 529.100 tấn, năm 2011 đạt 532.700 tấn, năm 2016 đạt 579.982,3 tấn, năm 2018 đạt 674 nghìn tấn...luôn đứng đầu trong các loại cây ăn quả. Quả dứa có thành phần dinh dưỡng phong phú. Hàm lượng nước, đường, protein, các vitamin, khoáng chất và độ acid trong dịch quả cao, phù hợp cho sản xuất rượu vang chất lượng để chưng cất thành brandy có hương vị đặc trưng. Cho đến nay, theo các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được, các nghiên cứu về quả dứa ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở quy trình bảo quản quả tươi, sấy khô, làm siro, các đồ uống và lên men vang. Nhiều công ty, doanh nghiệp và các cơ quan nghiên cứu về thực phẩm trong nước đã tiến hành quy trình sản xuất rượu brandy từ vải thiều, táo, mận, điều…Riêng với rượu brandy từ dứa, hiện mới có duy nhất dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất brandy trái cây (vải, dứa) ở quy mô công nghiệp” do Công ty TNHH MTV Bia rượu Eresson chủ trì. Theo hướng này, nấm men được thu thập từ nhiều nguồn trong và ngoài nước, quy trình công nghệ chưng cất bằng tháp cao. Sản phẩm brandy dứa đang dừng lại ở mức thăm dò thị trường, số lượng ít, giá thành cao, chưa phổ biến. Do đó, việc nghiên cứu chế biến dứa thành rượu brandy theo hướng truyền thống thành công sẽ là cơ sở khoa học để tổ chức sản xuất rượu brandy từ dứa ở Việt Nam, tạo thêm hướng tiêu thụ cho quả dứa, giải quyết công ăn việc làm cho nông dân lao động, góp phần phát triển kinh tế cho nhiều địa phương trồng dứa. Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, nhằm giúp nông dân giải quyết khâu tiêu thụ dứa bằng phương pháp chế biến, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa”. Mục tiêu của đề tài Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt.
2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu etanol phân lập từ dịch ép dứa Queen trồng tại Nông trường Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình. Phạm vi nghiên cứu: - Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu được phân lập từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên. - Nguyên vật liệu: Giống dứa Queen trồng tại Nông trường dứa Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình. Nội dung nghiên cứu (1) Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao và cho hương thơm đặc trưng trong quá trình lên men dịch dứa Queen. (2) Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng nấm men được tuyển chọn: Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả năng lên men các loại đường, khả năng đồng hóa muối nitrat, định tên khoa học, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (hàm lượng đường, ảnh hưởng của pH môi trường, ảnh hưởng của nguồn nitơ) đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men tuyển chọn (3) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa của chủng nấm men được tuyển chọn: pH, nhiệt độ, acid hữu cơ, hàm lượng đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống; nghiên cứu quá trình lên men vang từ dịch dứa Queen. (4) Cải biến chủng nấm men D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên. (5) Nghiên cứu quy trình chưng cất, làm sạch, tạo màu và hương vị cho brandy. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Ý nghĩa khoa học: Luận án đã cung cấp những dẫn liệu khoa học về việc sử dụng quả dứa để lên men vang sản xuất brandy chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu đã phân tích được thành phần cơ bản của dịch ép dứa Queen (nguyên liệu dùng để lên men vang sản xuất brandy); tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men cao, hương thơm đặc trưng; cải biến chủng nấm men này theo phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên tạo dòng nấm men có khả năng chịu độ rượu, chịu đường và có hoạt lực lên men cao hơn 22% so với chủng gốc. Luận án cũng đã đề xuất phương pháp loại bỏ các tạp chất không mong muốn trong rượu brandy thô, chỉ ra tác dụng của gỗ sồi trong việc tàng trữ tạo màu sắc và hương vị cho brandy dứa; xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất brandy từ dứa.
3 - Ý nghĩa thực tiễn Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể ứng dụng để sản xuất brandy dứa, làm đa dạng hóa sản phẩm chất lượng cao từ quả dứa, mở thêm hướng giải quyết được đầu ra cho quả dứa. Bên cạnh đó, luận án cũng có thể được dùng như một tài liệu tham khảo phục vụ học tập, nghiên cứu, giảng dạy về lên men vang và ứng dụng trong sản xuất rượu brandy từ quả dứa. Những điểm mới của luận án - Luận án là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu có hệ thống về sản xuất brandy dứa từ phân lập, tuyển chọn, định tên khoa học của chủng nấm men được tuyển chọn, điều kiện nhân giống, lên men, chưng cất, loại bỏ tạp chất, tàng trữ tạo hương vị và màu sắc đặc trưng cho brandy. - Tạo đươc biến chủng có hoạt lực lên men rượu cao đạt hàm lượng ethanol 15,1 % V/V từ chủng S. cerevisiae bằng đột biến ngẫu nhiên. - Đề xuất việc sử dụng nước chiết giá đỗ thay thế cho pepton trong nhân giống nấm men để lên men vang, sản xuất brandy. - Đề xuất được quy trình lên men vang để sản xuất brandy dứa sử dụng chủng nấm men S. cerevisiae D8 và nguồn nguyên liệu dứa Queen - Đề xuất phương pháp loại bỏ tạp chất trong rượu brandy trong môi trường acid bằng cách kết hợp phương pháp hóa học và vật lý. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 136 trang, bao gồm các phần sau: Mở đầu: 4 trang Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 44 trang Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 23 trang Chương 3. Kết quả và Thảo luận: 63 trang Kết luận và Kiến nghị: 2 trang Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo được 45 tài liệu tiếng Việt, 131 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web. Phụ lục: Luận án có 9 phụ lục các kết quả phân tích
4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trong chương này, ba vấn đề liên quan đến các nghiên cứu trong luận án này đã được tổng quan. Đó là: (1.1) NẤM MEN; (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT BRANDY và (1.3) CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY. Trong phần (1.1) NẤM MEN, Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm men trong sản xuất rượu (mục 1.1.1.) trên thế giới và ở Việt Nam đã được trình bày cụ thể. Các tiêu chí Phân loại, tuyển chọn các chủng nấm men (mục 1.1.3.) cũng được tổng quan. Các loài nấm men được dùng trong sản xuất vang thuộc giống Saccharomyces (gồm 286 loài nằm trong 17 chi. Đặc điểm sinh học của nấm men (Đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào và đặc điểm sinh lý – mục 1.1.2) và Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và lên men của nấm men (nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hóa tan, hàm lượng đường, hàm lượng rượu, các chất khử trùng,…mục 1.1.4) được trình bày cụ thể từ trang 15 đến trang 20. Trong phần (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT BRANDY, các tổng quan về (1.2.1) Nguồn gốc của cây dứa; (1.2.2) Sơ lược tình hình trồng và chế biến dứa ở Việt Nam; (1.2.3) Đặc điểm sinh học và thành phần dinh dưỡng của dứa được trình bày từ trang 21 đến trang 26. Phần (1.3) CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY mô tả (1.3.1) Lịch sử nghiên cứu và sản xuất rượu brandy trên thế giới và ở Việt Nam, từ trang 27 đến trang 33; (1.3.2) Sản xuất vang để chưng cất thu brandy từ trang 34 đến trang 38; (1.3.3) Chưng cất rượu vang để thu brandy và (1.3.4.) Tàng trữ và tạo hương cho brandy trang 38 đến 44 (1.3.5) Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam từ trang 45 đến 48. Trong mục 1.3.1 (Tình hình nghiên cứu và sản xuất rượu brandy), một số sản phẩm brandy của các nước (Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Đức, Mỹ và châu Mỹ latin…) cùng một số quy trình công nghệ sản xuất brandy trên thế giới (VD: Quy trình sản xuất rượu Cognac) đã được tổng quan. Tình hình sản xuất vang và brandy của Việt Nam cũng được đề cập cụ thể. Trong mục 1.3.2. (Sản xuất vang để chưng cất thu brandy) chúng tôi đã tổng quan về: (1) Cơ chế lên men rượu; (2) Các giai đoạn lên men vang từ khâu chuẩn bị nguyên liệu, dịch lên men đến nhân giống nấm men và các giai đoạn lên men được mô tả kỹ lưỡng. Trong mục 1.3.3. (Chưng cất rượu vang để thu brandy) và mục 1.3.4. (Tàng trữ và tạo hương cho brandy) chúng tôi đã mô tả các thiết bị chưng cất rượu (từ chưng cất gián đoạn, cải tiến đến chưng cất liên tục) và các kỹ thuật làm sạch rượu, tạo màu và tạo hương cho brandy thành phẩm. Trong mục 1.3.5. (Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam) tiêu chuẩn về nguyên liệu, cảm quan, thành phần hóa học, giới hạn về thành phần kim loại nặng, phụ gia thực phẩm và quy cách đối với việc bao gói, ghi nhãn, bảo quản và vận chuyển brandy đều được trình bày cụ thể.
5 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trong chương này, các Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị chính được trình bày trong mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Nguyên liêu dứa; (2.1.2) Các hoá chất và môi trường; (2.2.3) Chủng giống vi sinh vật và (2.1.4) Thiết bị nghiên cứu. Các Phương pháp nghiên cứu (mục 2.2) được chia thành 04 nhóm chính như sau: 2.2.1. Phương pháp vi sinh gồm các phương pháp: Pha loãng mẫu để phân lập nấm men, Phân lập nấm men trên môi trường Hansen đặc, Làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định nhuộm đơn, Bảo quản chủng giống nấm men, Hoạt hoá tế bào nấm men, Đếm số lượng tế bào nấm men, Nghiên cứu hình thái, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men, Xác định hoạt lực lên men, Sàng lọc và tuyển chọn dòng đột biến có hoạt lực lên men cao, Định loại nấm men. 2.2.2. Phương pháp hóa lý-hoá sinh gồm các phương pháp: Xác định trị số pH, Xác định hàm lượng oxy hòa tan, Xác định hàm lượng đường tổng, Xác định hàm lượng Vitamin C, Xác định acid tổng số, Xác định hàm lượng rượu etanol, Thu hồi và làm sạch rượu, Xác định hàm lượng furfurol và Xác định hiệu suất lên men. 2.2.3. Phương pháp phân tích cảm quan rượu 2.2.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men từ dịch ép dứa Queen 3.1.1. Phân lập nấm men trong môi trường dịch ép dứa Queen Từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên, chúng tôi đã phân lập được 8 chủng nấm men, kí hiệu lần lượt là D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7 và D8 có khả năng sinh trưởng và lên men etanol trong môi trường có hàm lượng đường và acid tổng số cao. Định hướng phân lập như vậy tạo điều kiện thuận lợi cho việc tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng sinh trưởng mạnh, lên men etanol tốt trong điều kiện lên men tự nhiên dịch ép dứa Queen, hạn chế được sự tạp nhiễm từ các vi sinh vật khác trong tự nhiên. 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men a) Đánh giá sinh trưởng của 8 chủng nấm men phân lập được trong môi trường Hansen với lượng bổ sung giống ban đầu như nhau (13,4 × 106 tế bào/ml) cho thấy: Chủng nấm men D1, D4 và D5 có khả năng sinh trưởng trong môi trường Hansen tốt hơn cả, mật độ tế bào trong bình nhân giống đạt trên 130 × 106 tế bào/ml. Các chủng D2, D3 và D8 sinh trưởng kém hơn,
6 đạt 121 – 128 × 106 tế bào/ml dịch môi trường nhân giống. Khả năng sinh trưởng của các chủng D6 và D7 trong môi trường nhân giống là kém nhất (đạt dưới 120 × 106 tế bào/ml). b) Khảo sát hoạt lực lên men của 8 chủng nấm men phân lập được Các tiêu chí chính được sử dụng để tuyển chọn chủng nấm men là: khả năng lên men mạnh, chịu được độ đường cao, pH thấp và tạo hương thơm đặc trưng. Hoạt lực lên men của 8 chủng nấm men D1 - D8 được đánh giá thông qua lượng CO2 thoát ra sau 120 giờ lên men ở 28°C (Bảng 3.1). Ngoài ra, chúng tôi cũng so sánh khả năng tạo hương giữa các chủng để lựa chọn được 04 chủng vừa có hoạt lực lên men etanol cao, vừa có hương thơm đặc trưng của dứa trong dịch lên men; đó là các chủng: D3, D4, D5 và D8. Bảng 3.1. Hoạt lực lên men etanol và khả năng tạo hương của 8 chủng nấm men phân lập Hoạt lực lên men tính bằng lượng CO2 sinh ra (g/100ml) Thời gian lên men (h) D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 4,44 ± 5,06 ± 4,88 ± 5,38 ± 5,79 ± 5,02 ± 4,63 ± 5,10 ± 24 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,02 0,02 5,08 ± 6,25 ± 6,02 ± 7,0 2 ± 8,70 ± 6,84 ± 5,55 ± 6,48 ± 72 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,02 0,01 0,01 7,32 ± 7,63 ± 8,13 ± 8,29 ± 9,67 ± 7,96 ± 7,82 ± 9,85 ± 96 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,02 0,01 0,01 7,35 ± 7,70 ± 8,24 ± 8,32 ± 9,73 ± 7,85 ± 7,98 ± 9,89 ± 120 0,02 0,01 0,03 0,02 0,02 0,03 0,02 0,03 Hương ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ thơm Chú thích: Khả năng tạo hương thơm: +++: Thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ;+: Thơm ít Đánh giá khả năng lên men của 4 chủng nấm men tuyển chọn trong môi trường có pH thấp (Bảng 3.2) chúng tôi nhận thấy: chủng D8 có khả năng lên men mạnh nhất, tạo ra từ 9,65 đến 9,88 g CO 2 /100 ml dịch lên men ở môi trường có pH từ 3,5 đến 4,5. Bảng 3.2. Khả năng lên men của 4 chủng nấm men D3, D4, D5, D8 ở các môi trường có pH thấp Hoạt lực lên men tính bằng lượng CO2 thoát ra (g/100ml) pH môi trường D3 D4 D5 D8 2,5 2,79 ±0,03 3,32 ± 0,02 3,07 ± 0,01 2,49 ± 0,2 3,0 8,88 ± 0,02 8,79 ± 0,03 6,92 ± 0,02 9,10 ± 0,02 3,5 9,41 ± 0,01 9,44 ± 0,02 8,01 ± 0,02 9,65 ± 0,02 4,0 9,52 ± 0,01 9,62 ± 0,02 8,93 ± 0,02 9,88 ± 0,02 4,5 9,53 ±0,02 9,63 ±0,01 8,96 ±0,03 9,97 ±0,03
7 Ở môi trường có pH = 3, trong khi các chủng D3, D4 và D5 lên men yếu nhưng chủng D8 vẫn lên men khá mạnh, tạo ra 9,10 g CO 2 /100 ml. Sự khác biệt về khả năng lên men etanol của các chủng nấm men tuyển chọn ở môi trường có pH 4,0 và 4,5 không nhiều, có ý nghĩa thống kê (p
8 Hình 3.2. Hình dạng tế bào của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc sau 96h nuôi cấy ở 28 o C (chụp dưới kính hiển vi điện tử S4800-NHE) A - Tế bào mẹ, B - Chồi , C - Lõm trên bề mặt tế bào, D - Sẹo (vị trí tách ra của chồi) 3.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng nấm men D8 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa và khả năng chuyển hóa đường của chủng nấm men D8 được so sánh với chủng nấm men đối chứng S. cerevisiae TCCY bằng kit API C 20 AUX được trình bày ở bảng 3.3 và bằng kit API ID32 C được trình bày ở bảng 3.4.
9 Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API C 20 AUX Chủng nấm men Loại Chủng D8 Chủng S. cerevisiae TCCY Mẫu trắng Bộ 3 đường Phản Mã định Phản Mã định Phản Mã định Điểm Cộng Điểm Cộng Điểm Cộng ứng danh API ứng danh API ứng danh API I O + 1 3 3041130 + 1 7 7040130 - 0 0 0000000 GLU + 2 + 2 - 0 GLY - 0 + 4 - 0 II 2KG - 0 0 - 0 0 - 0 0 ARA - 0 - 0 - 0 XYL - 0 - 0 - 0 III ADO - 0 4 - 0 4 - 0 0 XLT - 0 - 0 - 0 GAL + 4 + 4 - 0 IV INO + 1 1 - 0 0 - 0 0 SOR - 0 - 0 - 0 MDG - 0 - 0 - 0 V NAG + 1 1 + 1 1 - 0 0 CEL - 0 - 0 - 0 LAC - 0 - 0 - 0 VI MAC + 1 3 + 1 3 - 0 0 SAC + 2 + 2 - 0 TRE - 0 - 0 - 0 VII MLZ - 0 0 - 0 0 - 0 0 RAF - 0 - 0 - 0 + H/pH - 0 - 0 - 0 Ghi chú: +/-: Phản ứng/ không phản ứng; O: không đường; GLU: D-glucose; GLY: glycerol; 2KG: calcium-2;keto- gluconate; ARA: L-arabinose; XYL: D-xylose; ADO: adonitol (ribitol); XLT: xylitol; GAL: D-galactose; INO: inositol; SOR: D-sorbitol; MDG: Methyl-αD-glucopyranoside; NAG: N-acetyl-glucosamine; CEL: cellobiose; LAC: D-lactose; MAL: D-maltose; SAC: D-saccharose; TRE: D-trehalose; MLZ: D-melezitose; RAF: D-raffinose.
10 Bảng 3.4. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API ID 32 C Chủng nấm men Chủng D8 Chủng S. cerevisiae TCCY Mẫu trắng Bộ 3 Đường Phản Mã định Phản Mã định Phản Mã định Điểm Cộng Điểm Cộng Điểm Cộng ứng danh API ứng danh API ứng danh API I GAL + 1 5 504000 + 1 5 504001 - 0 0 000000 ACT - 0 0031 - 0 0031 - 0 0000 SAC + 4 + 4 - 0 II NAG - 0 0 - 0 0 - 0 0 LAT - 0 - 0 - 0 ARA - 0 - 0 - 0 III CEL - 0 4 - 0 4 - 0 0 RAF - 0 - 0 - 0 MAL + 4 + 4 - 0 IV TRE - 0 0 - 0 0 - 0 0 2 KG - 0 - 0 - 0 MDG - 0 - 0 - 0 V SOR - 0 0 - 0 0 - 0 0 SYL - 0 - 0 - 0 RIB - 0 - 0 - 0 VI GLY - 0 0 - + 1 - 0 0 RHA - 0 - 0 - 0 PLE - 0 - 0 - 0 VII ERY - 0 0 - 0 0 - 0 0 MEL - 0 - 0 - 0 GRT - 0 - 0 - 0 VII MLZ - 0 0 - 0 0 - 0 0 I GNT - 0 - 0 - 0 LVT - 0 - 0 - 0 ĨX MAN + 1 3 + 1 3 - 0 0 LAC + 2 + 2 - 0 INO - 0 - 0 - 0 X GLU + 1 1 + 1 1 - 0 0 SBE - 0 - 0 - 0 GLN - 0 - 0 - 0 ESC - 0 - 0 - 0 Ghi chú: +/-: Phản ứng/ không phản ứng; O: không đường; GAL: D-galactose; ACT: cycloheximide (actidione); SAC: D-saccharose; NAG: N-acetyl-glucosamine; LAT: lactic acid; ARA: L-arabinose; CEL: cellobiose; RAF: D- raffinose; MAL: D-maltose; TRE: D-trehalose; 2KG: potassium-2;keto-gluconate; MDG: Methyl-αD- glucopyranoside; SOR: D-sorbitol; XYL: D-xylose; RIB: D-ribose; GLY: glycerol; RHA: L-rhamnose; PLE: palatinose; ERY: erythritol; MEL: D-melibiose; GRT: sodium glucuronate; MLZ: D-melezitose; GNT: potassium gluconate; LVT: levulinic acid (levulinate); MAN: D-manitol; LAC: D-lactose; INO: inositol; GLU: D-glucose; SBE: L-sorbose; GLN: glucosamine; ESC: esculin ferric citrate. Kết quả lên men các loại đường và một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng D8 bằng Kit API C20 AUX và API ID 32 đều cho phép khẳng định chủng D8 là Saccharomyces cerevisiae với xác suất >98%. 3.2.3. Xác định tên khoa học của chủng D8 Căn cứ vào các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào (3.2.1), đặc điểm sinh học của chủng nấm men D8 (3.2.2), chúng tôi xác định vị trí phân loại của chủng D8 thuộc chi Saccharomyces, lớp nấm túi (Ascomycota) (theo khóa phân loại Looder, 1971). Chủng D8 có khả năng đồng hóa (NH4)2SO4 thuộc phân lớp Nấm túi trần (Hemiascomycetidae). Chủng D8 có khả năng sử dụng D-glucose, D-galactose, inositol, D- maltose, D-saccharose, D-manitol and D-lactose trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
11 Chủng D8 không sử dụng nguồn các bon từ glycerol, L-arabinose, D-xytose, D-sorbitol, xilitol, D-cellobiose, D-trehalose, D/L-rafinose and L-sorbose. Do đó, theo khóa phân loại truyền thống của Looder chủng D8 có nhiều đặc điểm của loài S. cerevisiae. Nhằm khẳng định lại một lần nữa kết quả định danh bằng các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và khả năng chuyển hóa đường đối với chủng nấm men D8, chúng tôi đã định danh chủng D8 bằng phương pháp sinh học phân tử. Đoạn mã hóa trình tự D1/D2 trong gen 28S r-RNA của chủng D8 được nhân lên bằng phản ứng PCR để so sánh với trình tự đoạn gen tương tự của các chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae được lưu giữ trong ngân hàng gen (NCBI). > Trình tự D1/D2 của chủng nấm men D8 ACGTCGCAGTCCTCAGTCCCAGCTGGCAGTATTCCCACAGGCTATAATACTTACCGAGGCAAGCTACATTCCTATGGATT TATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCAGTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAGGAGCAGAGGGCACAAAACACC ATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCA TCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCC CAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTTTACAAAGAACCGCACTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCC TGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATT TCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGT Saccharomyces cerevisiae Sequence ID: gb|KF646229.1| Identities 531/531(100%) Kết quả đọc trình tự đoạn D1/ D2 của chủng nấm men D8 và kết quả so sánh với các trình tự tương tự trong ngân hàng gen NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy mức độ tương đồng của trình tự này là 99 đến 100% so với trình tự đoạn D1/D2 của các chủng nấm men S. cerevisiae ATCC 18824 KC881066.1, S. cerevisiae SR127 CP011558.1, S. cerevisiae NCIM3186 CP011821.1 và S. bayanus CHFY0321EU719073. Kết quả định tên khoa học bằng hình thái tế bào và khuẩn lạc, bằng phương pháp hóa sinh và bằng phương pháp sinh học phân tử đều khẳng định chủng D8 thuộc loài S. cerevisiae họ Saccharomycetaceae, bộ Saccharomycetales. Chủng này được chúng tôi đặt tên là S. cerevisiae D8 để tiếp tục tiến hành các nghiên cứu lên men rượu và sản xuất rượu brandy từ dứa Queen. Các kết quả này được trình bày trong bài báo số 3. 3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae D8 Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae D8 nhằm xác định môi trường nhân giống thích hợp. Các yếu tố môi trường cơ bản ảnh hưởng đến quá trình nhân giống nấm men S. cerevisiae D8 bao gồm: pH môi trường, nhiệt độ, hàm lượng đường, nguồn nitơ, được trình bày cụ thể
12 từ trang 79 đến 90 bản toàn văn của luận án tiến sỹ này. Đặc biệt, nước chiết giá đỗ không những có thể thay thế pepton trong nhân giống S. cerevisiae D8 mà còn đem lại hiệu quả nhân giống cao hơn so với khi dùng pepton. Nước chiết giá đỗ cung cấp nitơ và đặc biệt là vitamin và khoáng (hai nhóm chất mà pepton bị thiếu hụt) cho sinh trưởng của nấm men. Thêm vào đó, nước chiết giá đỗ lại rẻ tiền, dễ làm, dễ kiếm hơn so với pepton và ít ảnh hưởng đến hương thơm và màu sắc tự nhiên của sản phẩm lên men cuối cùng. Các nghiên cứu đó giúp chúng tôi xác định được môi trường nhân giống tốt nhất đối với nấm men S. cerevisiae D8 là: Môi trường Hansen có hàm lượng đường 70g/l, pH 4,0 và nước chiết của 100 g giá đỗ /l, nhiệt độ nuôi là 28oC. Trong môi trường này, mật độ tế bào nấm men cực đại đạt 342,8 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt 88%. 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa 3.3.1. Thành phần hóa học cơ bản của dịch dứa ép Kết quả phân tích cho thấy dịch ép dứa Queen có hàm lượng đường tổng đạt trung bình 126 g/l, hàm lượng vitamin C đạt 41 mg/l, acid tổng số 3,6 g/l, giá trị pH đạt 3,4. Kết quả này cao hơn công bố trên cơ sở dữ liệu dinh dưỡng của USDA. Theo công bố của cơ sở dữ liệu này, hàm lượng đường trong dịch dứa là 9,26 g/l, vitamin C 36,2 mg/l. Điều này được giải thích bởi thành phần hóa học của dứa phụ thuộc vào giống dứa, đất trồng, chế độ chăm sóc, mùa vụ và thời điểm thu hoạch… So sánh với tiêu chí nguyên liệu sản xuất rượu brandy, thành phần hóa học của dịch ép dứa vừa phân tích hoàn toàn phù hợp để lên men chưng cất rượu brandy. 3.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống, đến khả năng lên men rượu của chủng S. cerevisiae D8 được dẫn ra từ bảng 3.7 đến 3.11 bản toàn văn của luận án này từ trang 92 - 98 và trong bài báo số 2.
13 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dịch dứa Nhiệt độ lên men (ᴼC) Chỉ tiêu 20 24 28 32 36 Hàm lượng rượu 10,82±0,4 10,91±0,2 11,04±0,1 11,02±0,2 10,82±0,3 (%V/V) Đường tiêu hao 194,18±0,03 194,31±0,05 194,72±0,02 195,03±0,03 195,37±0,07 (g/l) Acid tổng số 5,71 ±0,02 5,93 ±0,05 6,09±0,02 6,14±0,02 6,22±0,03 (g/l) Hiệu suất lên 83,35±0,31 84,13±0,15 85,11±0,08 85,01±0,15 83,25±0,23 men (%) Hương thơm của +++ +++ +++ ++ ++ dịch lên men Ghi chú: Khả năng tạo hương thơm: +++: thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ; +: Ít thơm Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men vang dứa pH ban đầu của môi trường lên men Chỉ tiêu 3 3,5 4 4,5 5 Hàm lượng rượu (% 11,03±0,01 11,08±0,03 11,16±0,06 11,01±0,02 10,84±0,2 V/V) Đường tiêu hao (g/l) 194,43±0,07 194,97±0,09 195,52±0,03 195,36±0,05 195,20±0,04 Acid (g/l) 5,44 ±0,03 5,62±0,03 5,68±0,01 5,89±0,04 6,04±0,05 Hiêu suất lên men (%) 85,1±0,08 85,84±0,23 86,28±0,46 85,01±0,15 83,64±0,15 Hương thơm của dịch ++ +++ +++ +++ ++ lên men Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men Hàm lượng đường trong môi trường lên men (g/l) Chỉ tiêu 126 150 170 200 220 250 Hàm lượng 6,92±0,03 8,58±0,02 9,54±0,02 11,22±0,02 11,24±0,02 11,21±0,03 rượu (% V/V) Đường tiêu 115,88 144,99 164,92 194,46 240,14 211,22 ±0,02 hao (g/l) ±0,01 ±0,02 ±0,02 ±0,03 ±0,02 Acid (g/l) 6,64±0,02 6,22±0,02 5,83±0,01 5,56±0,02 5,28±0,01 5,21±0,02 Hiêu suất lên 89,02±0,21 88,43±0,17 86,78±0,18 86,67±0,15 78,88±0,14 69,58±0,18 men (%) Hương thơm của dịch lên ++ ++ ++ ++ +++ +++ men
14 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan ban đầu trong dịch lên men đến quá trình lên men vang dứa Hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men (mg/l) Chỉ tiêu 5 6 7 8 9 Hàm lượng rượu (% 11,29±0,02 11,81±0,02 12,37±0,02 11,88±0,02 11,36±0,02 V/V) Đường tiêu hao (g/l) 197,5±0,02 197,6±0,02 198,8±0,02 197,4±0,02 197,3±0,02 Acid (g/l) 5,1±0,02 5,2±0,02 5,3±0,02 5,3±0,02 5,4±0,02 Hiệu suất lên men (%) 87,07±0,02 91,17±0,02 95,18±0,02 91,66±0,02 86,58±0,02 Hương thơm của ++ ++ +++ +++ +++ dịch lên men Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lượng men giống đến quá trình lên men vang dứa Thể tích men giống (% V/V) Chỉ tiêu 2 5 7 10 Hàm lượng rượu (% V/V) 12,35±0,01 12,37±0,02 12,37 ±0,02 12,34±0,01 Đường tiêu haog/l) 198,16±0,02 198,75±0,03 198,48±0,01 198,31 ±0,03 Acid (g/l) 4,52±0,02 4,67±0,01 4,81±0,01 4,83±0,02 Hiệu suất lên men (%) 95,09±0,08 95,28±0,15 95,28±0,15 94,99±0,08 Thời gian kết thúc lên men 5 4 3 3 chính (ngày) Hương thơm của dịch lên men + +++ ++ ++ Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi lựa chọn môi trường thích hợp cho lên men vang dứa Queen để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa có pH=4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan là 7 mg/l, hàm lượng men giống bổ sung là 17,1×106 tế bào/ml dịch lên men (5% thể tích V/V của bình lên men). Lên men ở 28o C trong 14 ngày đã thu được loại vang dứa đạt tiêu chuẩn để chưng cất brandy dứa. 3.3.3. Quá trình lên men vang dứa (quy mô 20 và 100 lít/mẻ) bằng chủng S. cerevisiae D8 Giống nấm men S. cerevisiae D8 được nhân giống cấp 1, 2 và 3 được mô tả cụ thể trong phần phương pháp trang 53 của luận án. Giống nấm men cần được kiểm tra nhanh từng giai đoạn bằng việc quan sát hình thái và xác định mật độ tế bào nấm men sống, đảm bảo mật độ tế bào sống ở giai đoạn nhân
15 giống cấp 3 phải đạt tối thiểu 340 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt xấp xỉ 88%. Lên men vang dứa để sản xuất brandy từ dịch dứa Queen Biến động về số lượng tế bào nấm men, đường tiêu hao, lượng rượu, hàm lượng acid của dịch lên men được theo dõi trong 24 h đầu. Kết quả sau mỗi 4 h lấy mẫu được thể hiện ở bảng 3.12. Trong ngày đầu lên men lượng tế bào tăng nhanh, lượng đường tiêu hao chậm, chỉ tiêu hao hết 38,5 g/l. Theo lý thyết sẽ tạo ra 5,9 g/100ml rượu tương đương 7,47% V/V nhưng thực tế lượng rượu sinh ra chỉ đạt 2,24% V/V, thấp hơn nhiều so với lượng rượu tạo thành theo lý thuyết. Điều này được lý giải là do lượng đường tiêu hao trong ngày đầu lên men chủ yếu cho tế bào nấm men sinh trưởng và phát triển. Chỉ sau 24 h, khi số lượng tế bào trong dịch lên men đạt cực đại 342,8 ×106 tế bào/ ml, lượng đường tiêu hao mới chủ yếu được dùng để tạo etanol. Bảng 3.12. Động thái của quá trình lên men dịch dứa trong 24 giờ đầu quy mô 20 lit/mẻ Chỉ tiêu Thời gian Đường tiêu hao Số lượng tế bào nấm men (×106 Lượng rượu tạo thành Acid tổng số (h) (g/l) tế bào/ml) (% V/V) (g/l) 0 0 17,3 ± 0,2 0 3,6 ± 0,01 4 2,8 ± 0,1 24,5 ± 0,3 0,16 ± 0,02 3,6 ± 0,01 8 5,9 ± 0,3 41,2 ± 0,5 0,34 ± 0,03 3,6 ± 0,01 12 12,6 ± 0,3 88,4 ± 0.6 0,72 ± 0,1 3,7 ± 0,02 16 18,7 ± 0,5 216,7 ± 0,8 1,09 ± 0,1 3,8 ± 0,02 20 26,1± 0.5 296,5 ± 3 1,63 ± 0,2 3,8 ± 0,02 24 38,5± 0,4 342,8 ± 5 2,24 ± 0,3 3,9 ± 0,02 Động thái lên men dịch dứa những ngày tiếp theo được đánh giá qua các chỉ tiêu như trên theo từng ngày. Kết quả được biểu thị ở hình 3.9.
16 Hình 3.9. Động thái của quá trình lên men vang dứa quy mô 20 lit/mẻ Thành phần dịch lên men thay đổi rõ ràng trong 10 ngày đầu lên men. Số lượng tế bào, hàm lượng đường và hàm lượng rượu có liên quan chặt chẽ với nhau. Sau ngày đầu số lượng tế bào sống đạt mức cực đại là 342,8 × 106 tế bào/ml, đường và chất dinh dưỡng có trong môi trường tiêu hao chủ yếu cho nấm men sinh trưởng phát triển, tạo sinh khối lớn vì thế lượng rượu tạo ra ít không tương ứng với lượng đường tiêu hao. Ngày thứ hai, lượng tế bào sống không tăng, giữ ở pha cân bằng động, số tế bào sinh ra tương đương với số tế bào chết đi. Lượng rượu tăng nhanh tương ứng với đường tiêu hao cho quá trình lên men tạo rượu etanol. Từ ngày thứ 3 trở đi, số lượng tế bào sống giảm nhanh dần, có thể giải thích tốc độ giảm nhanh đó là do lượng oxy trong bình lên men giảm do nấm men đã dùng trong quá trình sinh trưởng hiếu khí, đồng thời lượng rượu tạo thành tăng gây ức chế sinh trưởng của nấm men, lượng CO2 thoát ra trong quá trình hô hấp và lên men của các tế bào nấm men tạo môi trường kị khí trong bình lên men. Lúc này nấm men chuyển từ giai đoạn sinh trưởng hiếu khí sang giai đoạn lên men, chuyển đường thành rượu là chủ yếu. Đặc biệt hàm lượng rượu tăng nhanh nhất vào ngày thứ 3, thứ 4 và 5. Từ ngày thứ 6 trở đi, quá trình lên men diễn ra chậm chạp, các thông số thay đổi không đáng kể, lượng đường, cơ chất chính của quá trình lên men rượu, chỉ còn 50 g/l.
17 Đến ngày lên men thứ 10, lượng rượu tạo ra là 11,3 % V/V và hầu như không tăng nữa. Ngày thứ 25, kết thúc quá trình lên men lượng rượu đạt 11,6 % V/V. Các kết quả này được trình bày trong bài báo số 1. 3.3.4. Sản xuất brandy dứa ở quy mô thực nghiệm (100 lít/mẻ) bằng chủng S. cerevisiae D8 Ở quy mô 100 lít, sau 10 ngày, quá trình lên men vang dứa cơ bản đã kết thúc, vang non có độ rượu là 12,4 % V/V. Kết quả cao hơn một số công bố của Nadya Hajar, et al (2012) đạt 8,6% V/V) tiệm cận kết quả lên men của Ibegbulem và cộng sự (2014) đạt 12,7% V/V). Hàm lượng đường sót 1,25 g/l, acid 5,67 g/l và hiệu suất lên men đạt 95,3%, đạt tiêu chuẩn rượu vang để chưng cất brandy. Sau 25 ngày, quá trình lên men hoàn toàn kết thúc, lượng rượu tạo ra đạt 12,4% V/V, hàm lượng đường sót còn 0,93 g/l, acid tổng số là 5,78 g/l không khác biệt nhiều với thành phần dịch lên men sau 10 ngày. Hơn nữa, kết quả cảm quan cho thấy: nếu chưng cất sau 10 ngày lên men, rượu brandy có hương vị tốt còn nếu giai đoạn lên men phụ kéo dài đến 25 ngày, brandy kém thơm. Đây cũng chính là sự khác biệt trong sản xuất Brandy từ dứa so với từ nho. Khi kéo dài lên men phụ dịch nho lên men sau khi chưng cất sẽ cho brandy thơm hơn; tuy nhiên việc kéo dài thời gian lên men phụ của vang dứa lại thu được brandy dứa mất hương nhiều. Vì vậy, chúng tôi chọn ngày thứ 10 là thời điểm kết thúc lên men để chưng cất rượu brandy dứa. Những kết quả trên cho phép khẳng định môi trường thích hợp cho lên men vang dứa để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa được điều chỉnh để có pH = 4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan là 7mg/l, hàm lượng men giống bổ sung là 17,3 × 106 tế bào/ml dịch lên men, lên men ở 28o C, thời gian dừng lên men vang dứa để chưng cất là ngày thứ 10 sau lên men. 3.4. Cải biến chủng nấm men S. cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên 3.4.1. Tác dụng gây chết của hóa chất NTG, tia cực tím UV và kết hợp NTG với UV đến tế bào nấm men S. cerevisiae D8 Chủng nấm men S. cerevisiae D8 được gây đột biến bằng 3 phương pháp: Sử dụng hóa chất NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine), tia cực tím UV (50W, 260nm) và kết hợp NTG với UV trong khoảng thời gian từ 20 – 140 phút. Tác dụng gây chết của từng tác nhân đột biến đến tế bào nấm men S. cerevisiae D8 được trình bày trong hình 3.10.