Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thú y: Một số đặc điểm dịch tễ học và sinh học bệnh sán lá gan lớn trên bò ở đồng bằng sông Cửu Long và thử hiệu quả của thuốc tẩy trừ

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là xác định được loài, sự phân bố, đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm SLGL trên bò tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Đề xuất được biện pháp tẩy trừ bệnh SLGL trên bò tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Thú y: Một số đặc điểm dịch tễ học và sinh học bệnh sán lá gan lớn trên bò ở đồng bằng sông Cửu Long và thử hiệu quả của thuốc tẩy trừ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62640102 HÀ HUỲNH HỒNG VŨ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÕ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ Cần Thơ, 2018
CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN HỮU HƢNG Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc …. giờ …. ngày …. tháng …. năm …. Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam. II
DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 1. Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2014. Thành phần các loài ốc nước ngọt - ký chủ chủ trung gian của các loài sán lá ký sinh ở vật nuôi tại hai tỉnh Vinh Long và Đồng Tháp. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề Nông nghiệp /2014, trang 8- 12. 2. Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2015. Đặc điểm hình thái và phân tử của sán lá gan lớn ký sinh ở bò tại tỉnh Đồng Tháp. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 6/2015, trang 63-69. 3. Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Phạm Đức Phúc, Nguyễn Hữu Hưng, 2016. Ứng dụng chỉ thị gen phân tử ITS-1 và kỹ thuật PCR- RFLP để xác định loài sán lá gan lớn (Fasciola sp.) trên bò tại Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 2/2016, trang 85-92. 4. Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2016. Tình trạng nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và thử hiệu quả tẩy trừ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ /2016, trang 17-22. 5. Hà Huỳnh Hồng Vũ, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2018. Khảo sát một số đặc điểm bệnh lí của bệnh sán lá gan lớn trên bò tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề Nông nghiệp /2018, trang 12-17. III
Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Theo Tổ chức y tế Thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là một trong những bệnh quan trọng được phát hiện ngày càng nhiều ở người và động vật, có hơn 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL (WHO, 2015; Amer, 1016). Tại Việt Nam, bệnh SLGL ở người có xu hướng tăng dần, từ năm 2006 đến năm 2010 có số ca mắc bệnh là 15.764 và số ca đã tăng lên trên 20.000 người năm 2011. Bệnh phân bố ở 52 tỉnh thành từ Bắc đến Nam và loài gây bệnh được xác định chủ yếu là Fasciola gigantica (Nguyễn Văn Đề và ctv.2012). Trong những năm qua các nghiên cứu về bệnh SLGL đã cho biết bệnh này nằm trong danh sách bệnh truyền lây giữa vật nuôi và người. Các bệnh do sán lá gan gây ra cần phải thông qua vật chủ trung gian là các loài ốc nước ngọt.Với đặc điểm của vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là trồng lúa và rau màu nên rất thích hợp cho ốc nước ngọt và thực vật thủy sinh phát triển. ĐBSCL là khu vực ưu thế phát triển chăn nuôi bò nhờ tận dụng thức ăn thô xanh từ nguồn phụ phẩm – phế phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến. Tuy nhiên, phần lớn chăn nuôi tập trung ở các nông hộ với quy mô nhỏ, thức ăn tận dụng là chính, trình độ người chăn nuôi còn thấp, việc ứng dụng khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi còn hạn chế, hình thức chăn nuôi chủ yếu là bán chăn thả nên khả năng bò nhiễm giun sán rất cao. Để hạn chế thiệt hại do sán lá gan gây ra thì việc nghiên cứu bệnh sán lá gan và kiểm soát bệnh là rất cần thiết. Tuy nhiên, cho tới nay hầu như chưa có một công trình nghiên cứu nào có tính tổng hợp để xác định thành phần loài, đặc điểm sinh học và sự phân bố của sán lá gan ở khu vực ĐBSCL. Do đó nghiên cứu đề tài: “MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH HỌC BỆNH SÁN LÁ GAN LỚN TRÊN BÒ Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ THỬ HIỆU QUẢ CỦA THUỐC TẨY TRỪ” là rất cần thiết. 1.2 Mục tiêu của đề tài - Xác định được loài, sự phân bố, đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm SLGL trên bò tại các tỉnh ĐBSCL - Đề xuất được biện pháp tẩy trừ bệnh SLGL trên bò tại các tỉnh ĐBSCL. 1.3 Ý nghĩa khoa học - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sán lá gan lớn Fasciola gigantica trên bò: xác định tình hình nhiễm bệnh và các yếu tố liên quan đến sự phân bố của mầm bệnh. Định loài bằng hình thái học và sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự gen ITS1. 4
- Là công trình đầu tiên ở ĐBSCL nghiên cứu vòng đời SLGL trên bò, xác định thành phần ký chủ trung gian, nghiên cứu bệnh lý lâm sàng ở bò, điều trị thử nghiệm và đề ra biện pháp tẩy trừ. - Cung cấp thêm tư liệu khoa học về loài Fasciola sp. ký sinh trên bò ở (ĐBSCL), đồng thời bổ sung cho giáo trình ký sinh trùng thú y để phục vụ công tác giảng dạy. 1.4 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả đề tài là cơ sở khoa học để khuyến cáo người dân ở vùng (ĐBSCL) áp dụng biện pháp phòng trị bệnh SLGL một cách hữu hiệu, nhằm giảm thiểu những tác động có hại, góp phần phát triển chăn nuôi bò theo hướng bền vững. 1.5 Những đóng góp mới của luận án - Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên xác định được loài Fasciola gigantica lưu hành trên bò nuôi tại ĐBSCL bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu thành công vòng đời của SLGL (Fasciola gigantica) trên bò tại ĐBSCL. - Mô tả triệu chứng lâm sang, bệnh tích đại thể và vi thể bệnh sán lá gan lớn do loài Fasciola gigantica gây ra, tạo cơ sở khoa học cho công tác chẩn đoán phát hiện bệnh nhanh để kịp thời điều trị. Chƣơng III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh ĐBSCL - Xác định tỷ lệ nhiễm SLGL ký sinh trên bò tại các tỉnh ĐBSCL qua phương pháp kiểm tra phân và phương pháp mổ khám. 3.1.2 Xác định loài sán lá gan lớn trên bò tại các tỉnh ĐBSCL - Xác định loài sán lá gan lớn qua định danh phân loại bằng hình thái học, bằng kỹ thuật sinh học phân tử và giải trình tự gen. 3.1.3 Nghiên cứu vòng đời của sán lá gan lớn - Theo dõi quá trình phát triển của trứng SLGL bên ngoài cơ thể ký chủ. - Theo dõi quá trình phát triển của SLGL trong ký chủ trung gian (ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis) đến giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm cercaria). - Xác định vòng đời của SLGL trong vật chủ cuối cùng qua gây nhiễm ấu trùng gây bệnh cho bò. 3.1.4 Nghiên cứu bệnh lý lâm sàng ở bò nhiễm sán lá gan lớn - Xác định triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và trên bò nhiễm SLGL và khảo sát những biến đổi vi thể trên gan bò nhiễm SLGL 3.1.5 Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh sán lá gan lớn trên bò 5
- Thử hiệu lực của thuốc tẩy trừ SLGL bằng albendazole, triclabendazole và mebendazole; đề xuất biện pháp phòng bệnh sán lá gan cho trâu bò. 3.2 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Bò nuôi tại 6 tỉnh: Đồng Tháp, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng; sán lá gan Fasciola sp.; ốc Lymnaea spp. 3.2.2 Thời gian tiến hành: Tiến hành từ tháng 11/2013 đến 06/2017. 3.2.3 Địa điểm tiến hành - Các hộ chăn nuôi bò tại 6 tỉnh ĐBSCL, lò giết mổ tập trung tại các tỉnh khảo sát, phòng thí nghiệm Ký sinh trùng và phòng thí nghiệm Mô học thuộc Bộ môn Thú Y - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Thú y Lâm sàng – Khoa Chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh, phòng thí nghiệm Giải phẩu bệnh học – Trường Đại học Y dược Cần Thơ. 3.3 Dụng cụ và hoá chất: Một số dụng cụ, hóa chất cần thiết để nghiên cứu ký sinh trùng và sinh học phân tử. 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Xác định tình hình nhiễm SLGL trên bò tại ĐBSCL - Đối tƣợng thí nghiệm: Bò địa phương, bò lai Sind, bò sữa. Mỗi giống bò theo dõi ở các lứa tuổi: < 1 năm tuổi, 1 - 2 năm tuổi và > 2 năm tuổi.Bò giết mổ gia súc tập trung có nguồn gốc tại các tỉnh khảo sát. - Phƣơng pháp kiểm tra phân: áp dụng phương pháp gạn rửa sa lắng của Benedek (1943). - Phƣơng pháp mổ khám: Phương pháp mổ khám Skrjabine (1937) - Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm trứng sán lá gan chung trên bò; tỷ lệ nhiễm sán lá gan theo giống, theo lứa tuổi bò, theo phương thức nuôi, theo mùa, theo vùng sinh thái và theo địa bàn; cường độ nhiễm và số loài/cá thể. - Phân tích thống kê:Dùng trắc nghiệm Chi-Square trong chương trình Minitab version 16 để so sánh tỷ lệ nhiễm. 3.4.2 Phƣơng pháp định danh phân loài 3.4.2.1 Phƣơng pháp định danh phân loại sán lá gan bằng hình thái học Định danh phân loài sán lá gan được dựa vào tài liệu theo David and Erasmus (1972), Soulsby (1980), Nguyễn Thị Lê (2000). 3.4.2.2 Phƣơng pháp định danh sán lá gan lớn bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-RFLP) và giải trình tự gen Thu và trữ mẫu ly trích DNA Chọn ngẫu nhiên 180 mẫu SLGL được thu thập từ gan và ống dẫn mật ở bò tại lò giết mổ đại diện cho 6 tỉnh ĐBSCL. Mẫu được trữ trong dung dịch nước muối sinh lý và đem ngay về phòng thí nghiệm để ly trích DNA. 6
Tách chiết DNA từ mẫu sán lá gan lớn Kiểm tra nồng độ DNA Thực hiện phản ứng PCR - RFLP Phản ứng PCR: Bảng 3.1 Trình tự mồi tương ứng với gen Nhiệt Tên Tên Trình tự mồi (5’ – 3’) độ -Tm Tham khảo Gene mồi (oC) ITS1-F: TTG CGC ITS1- TGA TTA CGT CCC ITS1 F/ITS1- TG 56 Itagaki T (2005) R ITS1-R: TTG GCT GCG CTC TTC ATC Thực hiện phản ứng PCR-RFLP Sản phẩm phản ứng PCR được ủ với enzyme cắt giới hạn RsaI (5 IU) ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC sản phẩm thu được được điện di trên agarose 1.5% có bổ sung Ethidium bromide ở điện thế 80 volt trong 30 phút. Sản phẩm điện di được ghi lại bằng máy chụp hình gel. Bảng 3.2 Dự đoán kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) của các enzyme cắt giới hạn Enzyme RsaI ở vùng ITS1 của sán lá gan lớn Dự đoán Nhiệt độ, Enzyme chiều dài Tài liệu tham Tên loài thời gian Vị trí cắt sử dụng đoạn cắt khảo ủ mồi (bp) 367, 104 Fasciola (68, 59, hepatica 5’..GT↓AC...3' 370C, ủ 54, 28) (Ichikawa và RsaI 3'..CA↑TG...5' qua đêm 367, 172 Itagaki, 2010) Fasciola (59, 54, gigantica 28) Giải trình tự chuỗi nucleotide khuếch đại chứa đa hình Chọn 12 mẫu SLGL đại diện cho 6 tỉnh thuộc vùng ĐBSCL cụ thể là mỗi tinh chọn 2 mẫu, các sản phẩm PCR của các mẫu này được tinh sạch tách dòng. Mẫu được gửi lên công ty Marcogen (Hàn Quốc) để giải trình tự (sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp của Sanger). * Chỉ tiêu theo dõi - Kết quả xác định loài SLGL bằng kỹ thuật PCR-RFLP và phương pháp xác định hình thái. - Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS1 của SLGL giữa các địa phương với nhau và với ngân hàng gen thế giới. 7
* Phân tích và xử lý số liệu :Trình tự đoạn gen ITS-1 của 12 mẫu SLGL được sử dụng truy cập Ngân hàng gen dùng chương trình BLASTN trên NCBI để so sánh với trình tự trong Genbank; Clustal Omega để so sánh sự khác biệt giữa các trình tự, và so sánh mức tương đồng bằng phương pháp Pairwise alignment/Calculate identity/Similarity for sequences (Bioedit). 3.4.3 Nghiên cứu vòng đời của Fasciola sp. 3.4.3.1 Phƣơng pháp định danh phân loại ốc nƣớc ngọt Dựa vào hệ thống phân loại ốc nước ngọt của John (1982), Đặng Ngọc Thanh và ctv. (1980). Dựa trên cơ sở định danh phân loại ta chọn những ốc Lymnaea để nuôi trong phòng thí nghiệm cho sinh sản ra thế hệ ốc sạch để gây nhiễm ấu trùng SLGL cho ốc Lymnaea sp. 3.4.3.2 Theo dõi quá trình phát triển của trứng sán lá gan Fasciola sp. ở ngoài môi trƣờng trong điều kiện thí nghiệm a. Đối tượng nghiên cứu Trứng SLGL, ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis là ”ốc sạch”. b. Bố trí thí nghiệm Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm quá trình phát triển của trứng SLG lớn Nghiệm thức Số trứng/đĩa Số đĩa / nghiệm thức Đối chứng 0 5 1 60 10 2 60 10 3 60 10 Nghiệm thức 1: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với mực nước 0,5cm, không chiếu sáng, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 - 290C.Nghiệm thức 2: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với mực nước 0,5cm, có chiếu sáng 4 giờ/ngày, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 - 290C.Nghiệm thức 3: Trứng SLGL cho vào đĩa petri không chứa nước. c. Chỉ tiêu theo dõi - Thời gian trứng bắt đầu nở thành miracidium thoát ra khỏi trứng. - Thời gian trứng bắt đầu nở thành miracidium cho đến khi 50% số trứng đã hình thành miracidium thoát ra khỏi trứng 3.4.3.3 Theo dõi thời gian sống của miracidium trong nƣớc a. Đối tượng nghiên cứu Các miracidium mới thoát nắp vỏ trứng thu nhận từ các nghiệm thức trên (Thí nghiệm quá trình phát triển của trứng SLG) để bố trí thí nghiệm xác định thời gian sống của chúng trong nước. b. Bố trí thí nghiệm Sau khi gây nhiễm, ốc được mổ khảo sát ở các thời điểm như sau: 6 ngày, 10 ngày, 14 ngày, 18 ngày, 22 ngày, 26 ngày, 30 ngày, 34 ngày, 38 ngày và 42 ngày cho đến khi phát hiện cercaria bơi lội trong nước và thành Adolescaria; mỗi đợt mổ 10 con ốc Lymnaea swinhoei và 10 con ốc 8
Lymnaea viridis để xác định thời gian các giai đoạn phát triển của ấu trùng (sporocyst, redia và cercaria) trong 2 loài ốc Lymnaea Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm thời gian sống của miracidium trong nước Số miracidium Lô thí nghiệm Số đĩa / nghiệm thức /đĩa 1 15 10 2 15 10 3 15 10 3.4.3.4 Theo dõi quá trình phát triển của ấu trùng sán lá gan trong ký chủ trung gian ốc Lymnaea spp. 960 ấu trùng miracidium, 240 ốc Lymnaea swinhoei và 240 Lymnaea viridis là ”ốc sạch” được sử dụng trong thí nghiệm, miracidium được lấy từ thí nghiệm trên. Bảng 3.5 Bố trí gây nhiễm ấu trùng sán lá gan cho ốc Lymnaea Liều gây nhiễm Nghiệm thức Số ốc thí nghiệm (micracidium /ốc) Lymnaea swinhoei đối 0 80 chứng Lymnaea viridis đối chứng 0 80 Lymnaea swinhoei 3 160 Lymnaea viridis 3 160 . 3.4.3.5 Gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò a. Đối tượng nghiên cứu Bố trí 8 con bò có độ tuổi từ 7 tháng đến 12 tháng tuổi được mua từ các nông dân địa phương trong tỉnh khảo sát, khi mua về được tẩy sạch giun sán bằng thuốc albendazole và được kiểm tra phân là không có nhiễm SLGL và các loài giun sán khác. b. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm cercaria cho bò thí nghiệm Sáu con bò được gây cảm nhiễm bằng đường miệng với 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức tiến hành 2 bò với liều gây nhiễm cho mỗi nghiệm thức lần lượt là 100, 150, 200 cercaria di động của SLGL cho mỗi bò bằng một ống bơm tiêm qua đường miệng.Nghiệm thức đối chứng không gây nhiễm. Theo dõi sự xuất hiện trứng sán lá gan lớn trong phân bò gây nhiễm: Bắt đầu kiểm tra phân sau 11 tuần gây nhiễm ấu trùng SLGL cho bò và sau đó kiểm tra phân hàng ngày cho đến khi phát hiện trứng Fasciola sp. trong phân bằng phương pháp gạn rửa sa lắng. - Mổ khám bò gây nhiễm: khi phát hiện trứng SLGL trong phân bò. 9
- Chỉ tiêu theo dõi + Xác định thời điểm xuất hiện trứng SLGL trong phân trên bò thí nghiệm. + Số lượng SLGL thu được trên mỗi bò thí nghiệm và xác định loài SLGL bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân tử. 3.4.4 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể và những biến đổi vi thể trên bò nhiễm sán lá gan lớn 3.4.4.1 Nghiên cứu triệu chứng của bò nhiễm SLGL Quan sát về thể trạng và biểu hiện lâm sàng của 60 con bò nhiễm SLGL trong tự nhiên và 6 con bò trong gây nhiễm thực nghiệm. 3.4.4.2 Nghiên cứu bệnh tích đại thể và mô bệnh học gan nhiễm sán lá gan lớn - Đối tượng: Gan bò nhiễm SLGL trong gây nhiễm thực nghiệm và 45 gan bò nhiễm SLGL trong tự nhiên thu thập từ các cơ sở giết mổ tại các tỉnh ĐBSCL. 3.4.5. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sán lá gan lớn bò 105 bò lai Sind nhiễm SLGL được phát hiện trong phương pháp kiểm tra phân có cường độ nhiễm từ 2+ đến 3+ được bố trí thử nghiệm với các thuôc albendazole, triclabendazole, mebendazole với 2 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức15 con) và 5 bò được chọn ngẫu nhiên để làm đối chứng. Nghiệm thức 1: dùng liều lượng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Nghiệm thức 2: dùng liều lượng cao hơn liều hướng dẫn của nhà sản xuất. Nghiệm thức đối chứng: không dùng thuốc. Bảng 3.7 Bố trí thử nghiệm albendazole, triclabendazole và mebendazole tẩy trừ sán lá gan bò Nghiệm Liều dùng Số bò thử Đƣờng cấp thức (mg/kg thể trọng) nghiệm thuốc Đối chứng 0 5 - albendazole: 10mg/KgP 15 Uống triclabendazole: 15 Uống 1 15mg/KgP mebendazole:10mg/KgP 15 Uống albendazole:15mg/KgP 15 Uống triclabendazole: 15 Uống 2 20mg/KgP mebendazole:15mg/KgP 15 Uống c. Chỉ tiêu theo dõi - Hiệu lực tẩy trừ của thuốc sau 5, 10, 15 ngày điều trị, liều lượng thuốc tẩy trừ hiệu quả và theo dõi phản ứng phụ của thuốc trên bò điều trị. 10
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả tình hình nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL 4.1.1 Kết quả kiểm tra phân Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan trên bò tại ĐBSCL CƢỜNG ĐỘ NHIỄM Tỉnh SMKT SMN TLN(%) + ++ +++ SMN TLN(%) SMN TLN(%) SMN TLN(%) a a An Giang 1036 268 25,87 196 73,13 54 20,15 18 6,72a Đồng Tháp 987 249 25,23a 175 70,28 52 20,88a 22 8,84a a a Vĩnh Long 993 244 24,57 174 71,31 48 19,67 22 9,02a b b Bến Tre 933 149 15,97 121 81,21 22 14,77 6 4,03b b b Trà Vinh 900 142 15,78 119 83,80 17 11,97 6 4,23b b b Sóc Trăng 935 134 14,33 114 85,07 16 11,94 4 2,99b Tổng 5.784 1.186 20,50 899 75,80 209 17,62 78 8,68 Chú thích: các giá trị trên cùng 1 cột có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê P< 0,05; SMKT: số mẫu kiểm tra; SMN: số mẫu nhiễm; TLN(%): tỷ lệ nhiễm (%) Bảng 4.1 cho thấy bò nhiễm SLGL có tỷ lệ chung là 20,50%. Trong đó, bò nuôi ở các tỉnh có tỷ lệ nhiễm SLGL cao như tỉnh An Giang có tỷ lệ nhiễm (25,87%) cao nhất, kế đến bò nuôi ở Đồng Tháp có tỷ lệ nhiễm (25,23%), bò nuôi ở tỉnh Vĩnh Long có tỷ lệ nhiễm (24,57%). Bò nuôi có tỷ lệ nhiễm SLGL thấp thuộc các tỉnh như tỉnh Bến Tre có tỷ lệ nhiễm (15,97%), kế đến là bò nuôi ở tỉnh Trà Vinh (15,78%) và nhiễm thấp nhất là ở tỉnh Sóc Trăng (14,33%). Cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở mức độ thấp (+) 75,80%, cường độ ++ chiếm tỷ lệ 17,62%, cường độ +++ chiếm tỷ lệ 8,68%. Tỷ lệ nhiễm SLGL của bò nuôi ở các tinh như An Giang, Đồng Tháp và Vĩnh Long cao hơn ở các tinh Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng sự sai khác này rất có ý nghĩa thống kê (p
ốc nước ngọt ký chủ trung gian của các loài sán lá gan phát triển. Kết quả này một lần nữa cho thấy điều kiện địa lý, khí hậu và vùng sinh thái là điều kiện để cho mầm bệnh là các vật chủ trung gian có điều kiện tiếp cận và cảm nhiễm gây bệnh cho bò.Kết quả này phù hợp với nhận xét của Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996); Phan Địch Lân và ctv. (2002); Nguyễn Thị Kim Lan và ctv. (2008). Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo giống bò tại các tỉnh ĐBSCL Giống Bò TỈNH Bò Sữa Bò lai Sind Bò địa phƣơng SMKT SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) AG - - - 558 139 24,91b 478 129 26,99b ĐT - - - 506 131 23,48b 481 118 24,53b VL 130 16 12,31a 430 110 25,58b 433 118 27,25b BT - - - 487 73 14,99b 446 76 17,04b TV - - - 473 73 15,43b 427 69 16,16b ST 198 14 7,07a 375 64 17,07b 362 56 15,47b TỔNG 328 30 9,15a 2.829 590 20,86b 2.627 566 21,55b Chú thích: các giá trị trên cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê P< 0,05; SMKT: AG: An Giang; ĐT:Đồng Tháp; VL:Vĩnh Long; BT: Bến Tre; TV: Trà Vinh; ST: Sóc Trăng Bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ nhiễm SLGL ở bò địa phương (21,55%) cao hơn bò lai Sind (20,86%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất ở bò sữa (9,15%). Qua phân tích thống kê cho thấy: tỷ lệ nhiễm giữa bò sữa với bò lai Sind cũng như bò địa phương có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó bò lai Sind và bò địa phương không có sự sai khác. Tỷ lệ nhiễm SLGL theo giống bò giữa các tỉnh cũng cho kết quả tương tự như trên. Bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ nhiễm SLGL ở bò tại các điểm tăng dần theo lứa tuổi, thấp nhất là bò 2 năm (31,38%). Qua phân tích thống kê cho thấy có sự sai khác rất có ý nghĩa giữa các lứa tuổi bò trong từng tỉnh khảo sát. Bò >2 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm SLGL cao hơn các lứa tuổi khác là do tiếp xúc với môi trường lâu dài và do tuổi càng cao thì sức đề kháng càng giảm nên khả năng cảm nhiễm càng cao, đôi khi tái nhiễm nhiều lần. Còn bò 2 năm tuổi thì thấp hơn. Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với kết quả của Đỗ Dương Thái (1978), Hồ Thị Thuận (1986), Phan Địch Lân (2000), Lê Hữu Khương và ctv. (2001), Nguyễn Đức Tân 12
và ctv. (2010), Nguyễn Khắc Lực và ctv. (2010), Võ Thị Hải Lê và ctv. (2010), Nguyễn Hữu Hưng (2011), Nguyễn Thu Hương và ctv. (2012), Nguyen Thi Sam et al. (2012), các tác giả trên cho rằng tỷ lệ nhiễm sán lá gan phụ thuộc vào nhóm tuổi Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn theo lứa tuổi bò tại các tỉnh ĐBSCL Lứa tuổi Tỉnh 2 NĂM SMKT SMN TLN(%) SMKS SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) a b c AG 285 30 10,53 413 99 23,97 338 139 41,12 ĐT 260 24 9,23a 396 90 21,79b 331 135 40,79c VL 276 28 10,14a 410 94 22,93b 307 122 39,74c BT 275 19 6,91a 311 46 14,79b 347 84 24,21c TV 215 14 6,51a 327 46 14,07b 358 82 22,91c ST 242 13 5,37a 331 42 12,69b 362 79 21,82c TỔNG 1.553 128 8,24a 2.188 417 19,06b 2.043 641 31,38c Chú thích: các giá trị trên cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê P< 0,05; Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo phương thức nuôi tại các tỉnh ĐBSCL Phƣơng thức nuôi Tỉnh Nuôi nhốt Nuôi bán chăn thả SMKT SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) AG 395 49 12,41a 641 219 34,17b a ĐT 385 46 11,95 602 203 31,67b VL 420 49 11,67a 573 195 34,03b a BT 296 24 8,11 637 125 19,62b TV 356 35 9,83a 544 107 19,67b a ST 375 32 8,53 560 102 18,21b Tổng 2.227 235 10,55a 3.557 951 26,74b Chú thích: các giá trị trên cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê P< 0,05. Bảng 4.4 cho thấy ở ĐBSCL tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở bò nuôi bán chăn thả (26,74%) cao hơn bò nuôi nhốt (10,55%). Qua phân tích thống kê về tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn giữa 2 phương thức nuôi ở ĐBSCL có sự sai khác rất có ý nghĩa thống kê (p
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên bò theo mùa tại các tỉnh ĐBSCL Mùa khô Mùa mƣa Tỉnh SMKT SMN TLN(%) SMKT SMN TLN(%) AG 522 164 31,42a 514 104 20,23b a ĐT 553 168 30,38 434 81 18,66b a VL 498 147 29,52 495 97 19,60b BT 436 96 22,02a 497 53 10,66b a TV 462 95 20,56 438 47 10,73b ST 460 94 20,43a 475 40 8,42b Tổng 2.931 764 26,07 a 2.853 422 14,79b Chú thích: các giá trị trên cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê P< 0,05. Bảng 4.5 cho thấy tỷ lệ nhiễm SLGL ở bò nuôi tại ĐBSCL chịu ảnh hưởng tác động của mùa, bò nhiễm SLGL vào khô với tỷ lệ nhiễm là 26,07% cao hơn bò nhiễm SLGL vào mùa mưa (14,79%). Qua phân tích thống kê về tỷ lệ nhiễm SLGL giữa mùa khô và mùa mưa ở ĐBSCL có sự sai khác rất có ý nghĩa thống kê (p
ĐBSCL có sự sai khác rất có ý nghĩa thống kê (p
thể, ruột phân nhánh và có tuyến noãn hoàng phân bố khắp cơ thể. Giác bụng thường to hơn giác miệng. Tinh hoàn và buồng trứng nằm ngay sau giác bụng và ở giữa cơ thể sán lá. Theo Phan Thế Việt và ctv. (1977) và Nguyễn Thị Lê (2000) thì 2.259 con SLGL thu được ở 6 tỉnh của ĐBSCL đều thuộc loài Fasciola gigantica. 4.2.2 Kết quả xác định loài sán lá gan bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 4.2.2.1 Kết quả phân tích PCR-RFLP trong định danh loài sán lá gan ký lớn sinh trên bò tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Tất cả 180 mẫu SLGL đại diện cho 6 tỉnh ĐBSCL thực hiện PCR để nhân đoạn gen ITS1 bằng primer đặc hiệu cho loài sán lá gan ITS1-F và ITS1-R (Itagaki et al., 2005) cho sản phẩm PCR với kích thước đặc hiệu khoảng 680 bp (Ichikawa and Itagaki, 2010). Qua kết quả điện di các sản phẩm PCR-RFLP của 180 mẫu SLGL ở ĐBSCL cho thấy tất cả 180/180 mẫu đều có kiểu hình cắt của Fasciola gigantica tạo ra 3 band cắt với kích thước 360, 170 và 60bp (Hình 4.2), theo Ichikawa and Itagaki (2010) thì 180 mẫu SLGL là Fasciola gigantica. Kết quả trong nghiên cứu này một lần nữa khẳng định loài SLGL đang lưu hành và gây bệnh trên bò ở các tỉnh ĐBSCL đều là loài F.gigantica. 360b p170b p 60bp Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP Từ bên trái sang phải, M: thang chuẩn 100bp, giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 chứa sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme RsaI 11: đối chứng âm, 12: đối chứng dương loài Fasciola gigantica. 16
4.2.2.2 Kết quả xác định trình tự đoạn gen ITS1 Bảng 4.8 So sánh trình tự chuỗi nucleotide vùng ITS1 của các chủng SLGL ở ĐBSCL và thế giới Vị trí có Nucleotide biến đổi STT 13 48 149 173 265 359 437 457 1 F-A A T G T T C T C 2 F-C A T G T T C T C 3 F-J A Y G Y W Y W Y 4 F-K A Y G Y W Y W Y 5 BT2 G C G T T T A T 6 TV2 G C G T T T A T 7 AG1 C C G T T T A T 8 DT1 A C A T T T A T 9 ST2 A C G T T T A T 10 ST1 A C G T T T A T 11 VL2 A C G T T T A T 12 BT1 A C G T T T A T 13 AG2 A C G T T T A T 14 F-T A C G T T T A T 15 F-VN A C G T T T A T 16 DT2 A C G T T T A T 17 VL1 A C G T T T A T 18 TV1 A C G T T T A T Chú thích: AG1, AG2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh An Giang; BT1, BT2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh Bến Tre; ĐT1, ĐT2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh Đồng Tháp; ST1, ST2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh Sóc Trăng; TV1, TV2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh Trà Vinh; VL1, VL2: mẫu sán lá gan thu tại tỉnh Vĩnh Long; F-T: Fasciola gigantica thuần chủng của Thái Lan; F-VN: Fasciola gigantica thuần chủng của Việt Nam; F-A: Fasciola hepatica thuần chủng của Úc; F-C: Fasciola hepatica của Trung Quốc; F-J: Fasciola sp. dạng lai của Nhật Bản; F-K: Fasciola sp. dạng lai của Hàn Quốc. Các sản phẩm PCR của 12 mẫu SLGL đại diện cho 6 địa điểm thu thập mẫu được tinh sạch tách dòng, giải trình tự và BLAST trình tự trên với đoạn gen ITS1 đã được công bố trên ngân hàng gen. Kết quả cho thấy 12/12 sản phẩm PCR từ các mẫu sán lá gan cần giám định đều là loài Fasciola gigantica. Điều này một lần nữa khẳng định rằng, phương pháp 17
PCR-RFLP là một phương pháp hữu hiệu giúp phân biệt những kiểu DNA trong vùng ITS1 của các loài sán lá Fasciola spp. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen ITS1 (660bp) và tỷ lệ tương đồng nucleotide (Bảng 4.8) cho thấy:Trình tự nucleotide của đoạn ITS1 (660bp) giữa các mẫu sán lá gan thu thập ở 6 tỉnh ĐBSCL có độ tương đồng cao, chỉ sai khác từ 1-2 nucletotide trong đoạn gen được phân tích. Trong đó, 8/12 mẫu có trình tự hoàn toàn trùng khớp với các mẫu Fasciola gigantica thuần chủng được thu thập ở Thái Lan (F-T) và mẫu F.gigantica ở Việt Nam (F-VN) (Ichikawa & Itagaki, 2010). Tỷ lệ tương đồng giữa các mẫu sán lá gan F.gigatica thu thập tại ĐBSCL cao, dao động 99,8% đến 100%. Điều này chứng tỏ gen này có độ bảo tồn tương đồng rất cao giữa những mẫu sán lá F. gigantica không phụ thuộc vào địa điểm thu thập mẫu ở các tỉnh có đặc điểm tự nhiên khác nhau. Các mẫu sán lá gan Fasciola gigantica ở các tỉnh ĐBSCL có tỷ lệ tương đồng với các mẫu SLGL của Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc và Việt Nam dao động từ 98,9% đến 99,0%. Chính vì vậy, loài sán lá gan lớn lưu hành trên bò tại vùng ĐBSCL là loài F. gigantica. 4.3 Vòng đời sán lá gan 4.3.1 Sự phân bố các loài ốc nƣớc ngọt - ký chủ trung gian của sán lá F. gigantica Qua thu thập 15.848 con ốc tại các tỉnh ĐBSCL, qua định danh phân loại dựa vào hệ thống phân loại ốc nước ngọt của Đặng Ngọc Thanh và ctv. (1980) và John (1982) cho thấy, trong tổng số 15.848 mẫu ốc thu được tại các tỉnh ĐBSCL thì loài có tần số xuất hiện phổ biến ở ĐBSCL với mức độ cao là loài Lymnaea swinhoei (15,61%), kế đến là loài ốc Lymnaea viridis (9,71%). 4.3.2 Sự phát triển của trứng sán lá gan lớn Bảng 4.9 Sự phát triển của trứng Fasciola sp. trong môi trường nước Nghiệm thức STKS TGTBĐN (ngày) TGTN(50%) (ngày) 1 600 15,18±0,16 19,05±0,129 2 600 10,57±0,14 15,88±0,10 3 600 - - Chú thích: Nghiệm thức 1: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với độ cao của mực nước 0,5cm, không chiếu sáng, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 - 290C. Nghiệm thức 2: Trứng SLGL cho vào đĩa petri với độ cao của mực nước 0,5cm, có chiếu sáng 4 giờ/ngày, pH từ 6-8, nhiệt độ từ 26 - 290C. Nghiệm thức 3: Trứng SLGL cho vào đĩa petri không chứa nước. STKS: Số trứng khảo sát; TGTBĐN: Thời gian trứng bắt đầu nở, TGTN(50%): Thời gian trứng nở đạt tỷ lệ 50%. 18
Qua bảng 4.9 cho thấy trứng SLGL nuôi trong đĩa petri ở nghiệm thức 1 thì thời gian trứng Fasciola sp. bắt đầu nở là 15,18±0,16 ngày, thời gian trứng Fasciola sp. nở đạt tỷ lệ 50% là 19,05±0,129 ngày. Khi trứng SLGL được nuôi trong đĩa petri ở nghiệm thức 2 thì thời gian trứng bắt đầu nở là 10,57±0,14 ngày, thời gian trứng Fasciola sp. nở đạt tỷ lệ 50% là 15,88±0,10 ngày. Nghiệm thức 3 thì không có trứng nở. Như vậy, trong cùng một điều kiện như nhau khi được chiếu sáng thì thời gian trứng bắt đầu nở và thời gian trứng nở đạt 50% có sớm hơn khi không chiếu sáng. Như vậy, yếu tố nước và ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp. và sự thoát vỏ của miracidium, ánh sáng là yếu tố quan trọng giúp miracidium thoát vỏ. Qua nghiên cứu, chúng tôi cũng thấy rằng, trứng sán lá gan lớn Fasciola sp. phát triển không đồng đều và nở thành miracidium không trong cùng một thời gian. A B C D Hình 4.3 Các giai đoạn phát triển của trứng SLGL hình thành miracidium A. Trứng Fasciola sp.; B. Miracidium trong trứng; C. Miracidium trong trứng sắp thoát vỏ; D. Miracidium 4.3.3 Thời gian sống của miracidium trong môi trƣờng nƣớc Theo dõi thời gian sống của miracidium ở điều kiện 26-290C cho thấy miracidium sống được từ 10-12 giờ. Trước 10 giờ sau khi nở chưa có miracidium chết, sau 10 giờ tỷ lệ chết là 8,22%, từ 10-11 giờ tỷ lệ chết là 41,56% và từ 11-12 giờ tỷ lệ chết là 52,89%. Kết quả nghiên cứu thời gian sống của miracidium trong nước trong nghiên cứu này ngắn hơn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả ngoài nước, nhưng dài hơn so với số liệu của Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996); Phạm Diệu Thùy và ctv. (2014). 4.3.4 Sự phát triển của ấu trùng sán lá gan lớn trong ký chủ trung gian ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis. Qua bố trí thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ấu trùng sán lá gan lớn trên 2 loài ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis, kết quả cho thấy ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis bị nhiễm ấu trùng sporocyst sau 10 19
ngày gây nhiễm, redia được tìm thấy trong ốc từ ngày thứ 14 đến ngày thứ 38 sau khi gây nhiễm miracidium, các cercaria được tìm thấy trong ốc từ ngày thứ 26 –42 ngày sau khi gây nhiễm miracidium. Đồng thời, quan sát trong nước nuôi ốc gây nhiễm miracidium sau 42 ngày thấy có xuất hiện cercaria bơi lội trong nước nhờ đuôi hoạt động rất mạnh, sau 1–2 giờ thì cercaria rụng đuôi hình thành adolescaria. Như vậy thời gian ấu trùng sán lá gan phát triển trong ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis từ giai đoạn miracidium đến giai đoạn hình thành cercaria và thoát ra ngoài môi trường nước trong thí nghiệm này là từ 26 đến 42 ngày tính từ ngày gây nhiễm ấu trùng miracidium cho ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis. Kết quả nghiên cứu này cho thấy cả 2 loài ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis đều nhiễm ấu trùng SLGL Fasciola sp. khi gây nhiễm thực nghiệm, kết quả nghiên cứu này cho thấy vật chủ trung gian của SLGL tại vùng ĐBSCL là 2 loài ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis. A B C Hình 4.4 Các giai đoạn ấu trùng SLGL phát triển trong ốc Lymnaea swinhoei và Lymnaea viridis A. Sporocyst; B. Redia; C. Cercaria 4.3.5 Kết quả gây nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn cho bò Sau khi gây nhiễm ấu trùng cercaria cho 6 con bò thí nghiệm theo dõi sự xuất hiện trứng Fasciola sp. trong phân của bò thí nghiệm cho thấy bò khi gây nhiễm ở nghiệm thức 1 (gây nhiễm 100 cercaria/bò) phát hiện trứng SLGL trong phân từ 114 đến 115 ngày sau khi gây nhiễm ấu trùng và cường độ nhiễm trứng Fasciola sp. ở mức + và ++, tương tự ở nghiệm thức 2 (gây nhiễm 150 cercaria/bò) cũng phát hiện trứng SLGL trong phân bò từ 114 đến 115 ngày sau khi gây nhiễm ấu trùng và cường độ nhiễm trứng Fasciola sp. ở mức ++, nghiệm thức 3 (gây nhiễm 200 cercaria/bò) bò sau khi gây nhiễm ấu trùng từ 111 ngày đến 114 ngày thì phát hiện trứng SLGL trong phân bò và cường độ nhiễm trứng Fasciola sp. ở mức +++. Như vậy từ kết quả thí nghiệm cho thấy ấu trùng cercaria khi xâm nhập vào ký chủ cuối cùng là bò, trong cơ thể bò chúng tiếp tục phát triển thành sán trưởng 20