Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân: Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân "Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên" được nghiên cứu với mục tiêu: Làm rõ ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống đặc biệt là DNA và tế bào; Phân tích tỉ lệ đứt gãy đơn và đứt gãy đôi của DNA trong điều kiện có/không có các chất chống oxy hóa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Vật lý nguyên tử và hạt nhân: Nghiên cứu khả năng làm giảm mật độ các gốc tự do gây bởi bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN NĂNG LƯỢNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vật lý nguyên tử và hạt nhân Mã ngành: TRẦN THỊ NHÀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM GIẢM MẬT ĐỘ CÁC GỐC TỰ DO GÂY BỞI BỨC XẠ ION HÓA CỦA CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN. Hà Nội, 2023
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN NĂNG LƯỢNG NGUYÊN TỬ VIỆT NAM, VIỆN NGHIÊN CỨU HẠT NHÂN ĐẠI HỌC FUKUI-NHẬT BẢN. Người hướng dẫn khoa học: GS. Izumi Yoshinobu TS. Vương Thu Bắc Cố vấn khoa học: TS. Đặng Đức Nhận Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp viện Họp tại: Vào lúc: …… giờ …… ngày …… tháng …… năm …… Phản biện 1: Phản biện 2: Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Trung tâm đào tạo, Viện Năng lượng Nguyên tử Việt Nam - Thư viện quốc gia Việt Nam
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 6 1.1. Gốc tự do ..................................................................................................... 6 1.2. Tác động của bức xạ ion hóa lên các phần tử sinh học ................................ 7 1.2.1. Cơ chế tác dụng trực tiếp........................................................................... 7 1.2.2. Cơ chế tác dụng gián tiếp.......................................................................... 7 1.2.3. Tổn thương do bức xạ ion hóa................................................................... 7 1.2.3.1. Tổn thương ở mức độ phân tử................................................................ 7 1.2.3.2. Tổn thương ở mức độ tế bào – Độ mẫn cảm phóng xạ .......................... 7 1.3. Tổng quan về hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa. ...................... 8 1.3.1. Sự oxy hóa, chất chống oxy hóa, các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ..................................................................................................... 9 1.3.1.1. Sự oxy hóa ............................................................................................. 9 1.3.1.2 Chất chống oxy hóa ............................................................................... 9 1.3.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa .................................... 9 1.3.2. Tổng quan về hợp chất polyphenol có tác dụng chống oxy hóa. .............. 9 1.3.3. Cơ chế hoạt động của các hợp chất chống oxy hóa polyphenol ................ 9 1.3.3.1 Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atomic Transfer-HAT) ..... 9 1.3.3.2 Cơ chế chuyển một electron chuyển proton (Single Electron Transfer- Proton Transfer − SET−PT)................................................................................ 9 1.3.3.3 Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer − SPLET). ............................................................................................ 9 1.3.4. Khả năng chống oxy hóa của các polyphenol trong chè xanh. ................. 9 1.3.4.1 Thành phần catechin trong lá chè xanh. ................................................. 9 1.3.4.2. Khả năng chống oxy hóa của EGCG, EC. ........................................... 10 1.3.5. Khả năng chống oxy hóa của AA ........................................................... 10 1.3.5.1. Cấu tạo và tính chất của AA ................................................................ 10 1.3.5.2. Khả năng chống oxy hóa của AA ........................................................ 10 1.4. Các phương pháp đánh giá, đo lường tổn thương bức xạ mức độ phân tử và tế bào................................................................................................................. 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 11 2.1.1 DNA plasmid ........................................................................................... 11 2.1.1.1 Tổng quan về plasmid ........................................................................... 11 2.1.1.2. Phân loại plasmid ................................................................................. 11 2.1.1.3. Hình thái và sự nhân lên của plasmid .................................................. 11 2.1.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ...................................................... 11 1
2.1.2.1. Một số đặc tính của tế bào nấm men Saccharomyces .......................... 11 2.2.2.2. Cấu tạo ................................................................................................. 11 2.1.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men ............................................................... 12 2.2. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu..................................................... 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu. ........................................................................... 12 2.3.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ phóng xạ của EGCG, EC, AA đối với DNA........................................................................... 12 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu với tế bào nấm men. ...................................... 12 2.3.2.1. Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men .................................................. 13 2.3.2.2 Tỉ lệ sống sót của tế bào........................................................................ 13 2.3.2.3 Phương trình LQ (Linear- quadratic) .................................................... 13 2.4. Phương pháp bố trí mẫu và xử lý chiếu xạ ................................................ 14 2.4.1 Chiếu xạ gamma (LET thấp) ................................................................... 14 2.4.2. Chiếu xạ chùm ion (LET cao)................................................................. 14 2.4.3. Xác định liều hấp thụ .............................................................................. 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 14 3.1. Đứt gãy DNA, giá trị G và tổn thương tương đối của DNA khi trong môi trường chứa DNA có EGCG, EC, AA. ............................................................. 14 3.2. Tỷ lệ sống sót của tế bào khi trong môi trường nuôi cấy có chứa EGCG, AA .................................................................................................................... 18 3.3. Thảo luận ................................................................................................... 20 3.3.1. Ảnh hưởng của độ truyền năng lượng tuyến tính (LET) đến mức độ tổn thương (DNA và tế bào sống) của bức xạ ........................................................ 20 3.3.2. Khả năng chống oxy hóa của EGCG là lớn hơn EC ............................... 21 3.3.3. So sánh khả năng chống oxy hóa của EGCG và AA .............................. 21 3.3.4. Tỉ lệ sống sót của tế bào không tỉ lệ thuận với số mol chất chống oxy hóa .................................................................................................................... 22 3.3.5. Kết quả thu được tổn thương trên DNA chỉ có đứt gãy đơn (SSB) ........ 22 3.3.6. Hệ số α và tỉ số α/β ................................................................................. 22 NHỮNG ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................. 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ............................................... 25 2
MỞ ĐẦU Bức xạ ion hóa có thể bắt nguồn từ tự nhiên và có sẵn trên mặt đất hoặc từ nguồn con người tạo ra đều góp phần khiến con người bị phơi nhiễm và tạo thành mối nguy hiểm cho sức khỏe. Khi tương tác với tế bào và cơ thể sống, bức xạ ion hóa tạo ra các gốc tự do, làm hỏng nhân của tế bào như DNA và màng tế bào cũng như gây chết hoặc đột biến tế bào. Khi vi sinh vật tiếp xúc với bức xạ ion hóa, các bức xạ ion hóa này sẽ gây những tổn thương đối với DNA trong tế bào (tương tác trực tiếp) hoặc những bức xạ ion hóa sẽ tương tác với các phân tử nước tạo ra những gốc tự do (H , OH  ). Những gốc tự do này sẽ gây ra những tổn thương đối với DNA như đứt gẫy đơn hoặc đứt gãy đôi của DNA trong tế bào (tương tác gián tiếp). Bức xạ gây ra một loạt các tổn thương trong DNA, chẳng hạn như đứt gãy đơn (SSB) trong các liên kết phosphodiester, đứt gãy đôi (DSB) trên các vị trí đối diện hoặc bị dịch chuyển, tổn thương cơ sở, liên kết chéo protein-DNA và liên kết ngang protein-protein. Đứt gãy đôi gây ra những tổn thương nghiêm trọng đối với các tế bào bởi với tế bào có đứt gẫy đôi trong DNA thì rất khó để sửa chữa hoặc quá trình sửa chữa sẽ không hoàn thiện và xuất hiện những đột biến (tế bào lạ hay còn gọi là tế bào ung thư). Hơn nữa, các tác động sinh học của bức xạ ion hóa thường được cho là phụ thuộc vào sự truyền năng lượng tuyến tính (LET). Bức xạ LET cao có khả năng gây ra nhiều DSB hơn. Bức xạ LET thấp tương tác với nước trong tế bào để tạo ra các gốc tự do sau đó tấn công DNA (tác động gián tiếp). Hầu hết năng lượng từ bức xạ LET cao được DNA hấp thụ trực tiếp để tạo ra các tổn thương DNA (thông qua tác động trực tiếp). Do vậy đánh giá tỉ lệ đứt gãy của DNA, tỉ lệ sống sót của tế bào là những nhân tố quan trọng trong việc xác định tác động sinh học của các bức xạ ion hóa. Đã từ lâu những chất có từ thiên nhiên đã được sử dụng làm chất chống oxi hóa để làm giảm tác động có hại của các bức xạ nói chung và bức xạ ion hóa nói riêng. Các hợp chất chống oxy hóa có thể ngăn chặn sự hình thành không kiểm soát của các gốc tự do hoặc ức chế phản ứng của chúng với các vị trí sinh học. Nghiên cứu để đánh giá khả năng bảo vệ các phần tử sinh học khỏi tác động từ bức xạ ion hóa của các hợp chất tự nhiên ở Việt Nam trong những năm gần đây rất được quan tâm và nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau và có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng các gốc tự do của một số các hợp chất trong các dòng thực vật bổ biến ở Việt Nam. Tuy nhiên, số lượng các công trình nghiên cứu về khả năng bảo vệ của các chất chống oxy hóa tới các phần tử sinh học như DNA và tế bào khi chúng bị chiếu xạ vẫn còn hạn chế. Nhiểu nghiên cứu được thực hiện trong thời gian gần đây để nghiên cứu vai trò làm giảm các gốc tự do sinh ra bởi các bức xạ ion hóa của các hợp chất trong tự nhiên. Tuy nhiên các phương pháp nghiên cứu chủ yếu dừng lại các mô 3
hình tính toán và gặp trở ngại lớn do yêu cầu khắt khe về cấu hình máy tính. Các nhà khoa học tại viện nghiên cứu Hạt nhân – Đại học Fukui, Nhật Bản cũng đang tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu để đo tỉ lệ đứt gãy của DNA và tính toán tỉ lệ sống của tế bào nhằm đánh giá sự suy giảm các gốc tự do sinh ra do bức xạ ion hóa khi trong môi trường sống của tế bào và DNA có các hợp chất trong tự nhiên. Vitamin C (Axit ascorbic (AA)) có nhiều trong trái cây, epigallo-catechin gallate (EGCG), (-)-epicatechin (EC) trong chè xanh đã từ lâu được coi những chất chống oxy hóa trong tự nhiên và được nghiên cứu trong và ngoài nước. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu trong đó tác dụng bảo vệ của các chất chống gốc tự do được thực hiện đồng thời ở cấp độ tế bào và DNA. Cần có thêm các nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ bức xạ của AA hoặc EGCG hoặc EC đối với tế bào và đối với đứt gãy DNA thông qua các cơ chế tác dụng trực tiếp hoặc gián tiếp của bức xạ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá và phân tích cơ chế bảo vệ DNA và tế bào của một số chất có trong tự nhiên trong việc chống lại các bức xạ ion hóa. Để đánh giá khả năng bảo vệ bức xạ (chống oxy hóa, ….) của những chất này theo năng lượng tuyến tính, chúng tôi sử dụng chùm bức xạ gamma (LET thấp) và chùm helium (LET cao) dùng để chiếu xạ. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN Nhân viên bức xạ khi phải ứng phó sự cố bức xạ cũng như sự cố hạt nhân, trong vận hành các cơ sở hạt nhân hoạt động bình thường, kể cả lò phản ứng nghiên cứu công suất thấp; các bác sĩ, kỹ thuật viên của các khoa X-quang can thiệp, kỹ thuật viên xạ hình công nghiệp phải tiếp xúc với các nguồn phóng xạ hoạt độ lớn và trường bức xạ có năng lượng cao có nhiều khả năng phải chịu những liều bức xạ cao hơn mức liều nghề nghiệp làm tăng nguy cơ rủi ro sức khỏe của họ. Cơ chế gây rủi ro sức khỏe đối với cơ thể sống khi bị chiếu xạ được chứng minh là năng lượng bức xạ trực tiếp ion hóa các mạch liên kết hóa học của tế bào, của DNA và thậm chí cả gene hoặc gián tiếp ion hóa thành phần nước trong cơ thể tạo ra các phần tử có tính oxy hóa mạnh, đó là các ion H+, -OH, H2O-, các gốc tự do như tham gia vào quá trình oxy hóa làm thay đổi cấu trúc mô và tế bào. Cho đến này chưa có nhiều nghiên cứu về biện pháp giảm mật độ các gốc tự do cũng như các ion trong cơ thể nhân viên bức xạ dưới tác động của bức xạ nhằm giảm nguy cơ rủi ro sức khỏe cho họ. Được biết viên sắt, trong thành phần có ion sắt hóa trị II (Fe2+) được sử dụng cho những cá thể bị chiếu xạ liều cao gây bởi nhân phóng xạ Cs-137, nhưng không thấy có thông tin về sử dụng viên sắt cho các trường hợp bị chiếu xạ khác như nơtron hoặc tia X. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu chung là chứng minh năng lực của một số hợp chất thiên nhiên có chứa gốc phenol làm giảm mật độ các phần tử oxy hóa (các ion và gốc tự do) sinh ra từ chiếu xạ nói chung trong cơ thể sống, làm giảm nguy cơ rủi ro sức khỏe đối với nhân viên bức xạ. Như vậy, nội dung nghiên cứu 4
của luận án mang tính cấp thiết rõ rệt là đảm bảo an toàn bức xạ cho nhân viên bức xạ chịu liều bức xạ cao hơn mức liều nghề nghiệp. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN - Làm rõ ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống đặc biệt là DNA và tế bào. (Xây dựng được cơ sở dữ liệu về mối tương quan giữa liều bức xạ và mật độ các gốc tự do để làm rõ các ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên DNA và tế bào). - Phân tích tỉ lệ đứt gãy đơn và đứt gãy đôi của DNA trong điều kiện có/không có các chất chống oxy hóa. - Tính toán tỉ lệ sống sót của tế bào khi chiếu xạ trong điều kiện có hoặc không có các chất chống oxy hóa. Dùng phương trình LQ để mô tả sự suy giảm tỷ lệ sống sót (S) khi theo liều lượng (D). Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA LUẬN ÁN: Triển khai một hướng nghiên cứu mới, phù hợp với xu thế chung trên thế giới cũng như các điều kiện của Việt Nam: Tìm kiếm chất chống oxy hóa xanh thân thiện môi trường. Bên cạnh đó, luận án còn có vai trò đóng góp vào việc đưa ra định lượng của một số chất chống oxy hóa để giảm được tổn thương do bức xạ ion hóa gây lên, đáp ứng được yêu cầu nghiên cứu và hướng tới việc ứng dụng trong nước. NHỮNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN: 1. Đã định lượng được tỉ lệ đứt gãy của DNA plasmid khi bị chiếu xạ bởi bức xạ gamma (LET thấp), bức xạ helium (LET cao) trong điều kiện môi trường chứa DNA không có các chất chống oxy hóa và chứa các chất chống oxy hóa như AA, EGCG, EC. Khi môi trường chứa DNA plasmid có các chất chống oxy hóa, tỉ lệ tổn thương trên DNA plasmid đã giảm, nói cách khác AA, EGCG, EC có tác dụng bảo vệ DNA plasmid khỏi tác động có hại của bức xạ ion hóa. 2. Đã định lượng được tỉ lệ sống sót của tế bào nấm men khi bị chiếu xạ bởi bức xạ ion hóa (bức xạ gamma, bức xạ helium) khi nấm men được nuôi cấy trong môi trường YPD lỏng không có chất chống oxy hóa và chứa chất chống oxy hóa như AA và EGCG. Với tất cả các hàm lượng 300 µM, 500 µM và 1000 µM của AA và EGCG, kết quả thực nghiệm đều cho thấy tỉ lệ sống sót của tế bào tăng. Nghĩa là AA và EGCG có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại các bức xạ ion hóa. 3. Đã đưa ra kết quả thực nghiệm về ảnh hưởng của LET đến mức độ tổn thương bức xạ của DNA và tế bào sống. Bức xạ có LET cao sẽ gây ra nhiều tổn thương hơn đối với DNA và tế bào sống. 4. Từ sự phân tích và so sánh giữa các giá trị thực nghiệm, luận án đã đưa ra được tỉ lệ tổn thương tương đối của DNA plasmid khi được bảo vệ bởi hợp chất EGCG và EC có trong chè xanh từ đó đi đến kết luận EGCG có khả 5
năng chống oxy hóa tốt hơn so với EC. 5. Bằng việc đánh giá tỉ lệ bảo vệ tế bào theo hàm lượng mol, kết quả thực nghiệm cho thấy AA có khả năng bảo vệ tốt hơn so với EGCG ở nồng độ 300 µM và 1000 µM. 6. Kết quả thực nghiệm tỉ lệ sống của tế bào phụ thuộc vào liều chiếu trong đó hàm lượng của EGCG và AA trong môi trường nuôi cấy nấm men YPD thay đổi từ 0 µM, 300 µM, 500 µM, 1000 µM cho thấy tỉ lệ sống không tỉ lệ với nồng độ. Dựa vào sự phụ thuộc này chúng tôi nhận thấy EGCG với hàm lượng 500 µM và AA với hàm lượng 300 µM bảo vệ tốt nhất tế bào nấm men khỏi bức xạ ion hóa. 7. Từ số liệu thực nghiệm, dựa vào đường cong đáp ứng liều xác định được các thông số theo phương trình LQ. Giá trị của hằng số α và α/β trong phương trình LQ đối với bức xạ LET thấp và LET cao giảm khi môi trường nuôi cấy tế bào nấm men có bổ sung EGCG và AA. Giá trị của α/β có xu hướng giảm khi môi trường sống của tế bào nấm men có bổ sung EGCG, AA. Điều này chỉ ra rằng EGCG, AA làm giảm sự đứt gãy của các phân tử DNA và giảm đột biến trong các tế bào bị chiếu xạ. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Kết quả nghiên cứu của luận án đã định lượng được tỷ lệ đứt gãy DNA plasmid và tỷ lệ sống của tế bào nấm men bị chiếu xạ bởi bức xạ gamma và chùm helium. 2. Xác định được hàm lượng chất chống oxy hóa EGCG và AA thích hợp để giảm mức độ tổn thương DNA, và bảo vệ tế bào nấm men khỏi tác động gây chết của hai loại bức xạ trên. 3. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đánh giá tác động của chiếu xạ chùm ion helium đối với DNA và tế bào nấm men. Kết quả nghiên cứu giúp mở rộng hợp tác của cơ sở đào tạo với các cơ sở nghiên cứu về Vật lý hạt nhân và Sinh học phóng xạ của Nhật Bản trong thời gian tới. Những kết quả nghiên cứu và đóng góp mới của luận án đã được công bố trên các tạp chí, hội nghị Quốc tế uy tín trong danh mục Scopus cũng như trên các hội nghị Quốc gia uy tín. Bố cục của luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Gốc tự do Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có một hay một số điện tử hóa trị chưa ghép cặp hoặc có lớp vỏ điện tử mở, nên có thể xem là sản phẩm trung gian có một hoặc nhiều liên kết cộng hóa trị “lơ lửng” tồn tại độc lập. Bức xạ ion hóa gồm các bức xạ hạt (neutron và các hạt tích điện), và bức xạ điện từ (photon) sinh ra từ quá trình phân rã của các hạt nhân không bền hoặc do khử kích thích các nguyên tử và hạt nhân của chúng trong các lò phản ứng hạt nhân, máy gia tốc... Khi tương tác với vật chất, các bức xạ này sẽ truyền một phần hoặc 6
toàn bộ năng lượng của nó để ion hóa vật chất tạo thành các gốc tự do và các ion. Một trong những gốc tự do đáng chú ý nhất là hydroxyl (OH  ), thường hình thành khi vật chất chứa nước bị chiếu xạ [1]. Trong y sinh học, người ta dùng khái niệm hệ số truyền năng lượng tuyến tính viết tắt theo tiếng anh là LET (Linear Energy Transfer) để diễn đạt giá trị năng lượng bức xạ đã chuyển giao cho vật chất. Tùy thuộc vào LET của bức xạ, mà số lượng và đặc tính của các gốc tự do hình thành sẽ khác nhau. Các gốc tự do và ion hình thành, sau đó tiếp tục tham gia các phản ứng khác nhau gây ra những hiệu ứng vật lý, hóa học và sinh học trong đối tượng bị chiếu xạ. Bức xạ ion hóa có thể tác động trực tiếp đến các phân tử chủ yếu trong tế bào và cơ thể sống như DNA, enzyme, axit béo, vitamin hoặc tác động gián tiếp thông qua quá trình phân ly phóng xạ phân tử nước tạo thành các cặp ion hoặc các phân đoạn có kích thước nhỏ và linh động với động năng nhất định để tiếp tục phản ứng dây chuyền, làm sai lệch chức năng sinh học, gây đột biến và thậm chí gây chết tế bào và cơ thể. 1.2. Tác động của bức xạ ion hóa lên các phần tử sinh học 1.2.1. Cơ chế tác dụng trực tiếp Những bức xạ với năng lượng lớn khi đi vào cơ thể sẽ trực tiếp phá vỡ các tế bào gây nên các quá trình kích thích hay ion hoá, làm đứt gãy các mối liên kết trong các gen, các nhiễm sắc thể của tế bào, gây tổn thương đến chức năng của tế bào. 1.2.2. Cơ chế tác dụng gián tiếp Bức xạ ion hóa tác dụng lên các phân tử nước, gây nên những biến đổi ở đó tạo ra các sản phẩm hóa học mới là các ion dương hoặc âm (H2O-, H2O+, H+, OH-) và các phân tử ở trạng thái kích thích như H2O, H2O, H2O. Các sản phẩm mới này sẽ gây nên các phản ứng hóa học với các phân tử hữu cơ của tổ chức sinh học và làm biến đổi chúng. 1.2.3. Tổn thương do bức xạ ion hóa 1.2.3.1. Tổn thương ở mức độ phân tử Sau khi chiếu xạ, xuất hiện trong tổ chức sinh học các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn, có cấu trúc khác trước bởi vì đã xảy ra sự phân ly, đứt đoạn do các phântử hữu cơ bị phá vỡ ở cấu trúc cấp hai, cấp ba và thậm chí ở các mạch chính. Một trong những tổn thương phân tử ảnh hưởng đến chức năng sinh học quan trọng là tổn thương phân tử DNA. Sau khi bị chiếu xạ, phân tử DNA có thể bị tách bỏ hoặc bị phá hủy gốc purin, pirimiđin, gốc NH2, gốc đường… vv. Khi bị chiếu xạ, phân tử DNA có thể bị ba tổn thương sau đây: Tổn thương các bazơ và các gốc đường; Gãy các mạch nối đơn hoặc đôi trong cấu trúc DNA; Phá hủy cấu trúc không gian của phân tử DNA. 1.2.3.2. Tổn thương ở mức độ tế bào – Độ mẫn cảm phóng xạ Một trong những chức năng quan trọng của tế bào là chức năng sinh sản. Khả năng đó có thể bị mất tạm thời hoặc vĩnh viễn dưới tác dụng của bức xạ ion 7
hóa. Có hai biểu hiện tổn thương chức năng sinh sản đó là sự phân bào bị chậm trễ và tế bào chết. Đồ thị mô tả sự phụ thuộc tỉ lệ sống sót của tế bào theo liều chiếu diễn tả ảnh hưởng của bức xạ lên khả năng phân bào hay còn gọi là tác dụng diệt bào của bức xạ. Độ mẫn cảm phóng xạ của tế bào nói lên mức độ mất khả năng sinh sản của tế bào nghĩa là mức độ bị hủy diệt tế bào sau chiếu xạ. Độ mẫn cảm phóng xạ của tế bào phụ thuộc vào liều lượng, suất liều, giá trị LET, nồng độ oxy, nhiệt độ, cách chiếu, và thời gian cách quãng và giai đoạn sinh trưởng của tế bào. Hình 1.5. Ảnh hưởng của suất liều đối với độ mẫn cảm phóng xạ của tế bào. Tỉ lệ sống sót của tế bào ở suất liều cao nhất (đường A), tỉ lệ sống sót của tế bào ở suất liều thấp nhất (đường C), tỉ lệ sống sót của tế bào ở suất liều nằm trong khoảng cao nhất và thấp nhất (đường B). 1.3. Tổng quan về hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa. Sự thoái hóa của tế bào là nguyên nhân chính gây nên các bệnh tật trong cơ thể con người. Bệnh ung thư cũng có liên quan đến sự thoái hóa của tế bào, các tế bào ác tính nói chung hoạt động hơn tế bào bình thường trong việc tạo ra các hợp chất chứa liên kết đơn O−O. Các bệnh tật này là kết quả của sự tạo ra quá nhiều tác nhân phản ứng chứa oxy (Reactive Oxygen Species−ROS) trong các hoạt động trao đổi chất của tế bào mà một trong những nguyên nhân do bức xạ ion hóa gây lên, dẫn đến tổn thương tế bào bao gồm peroxy hóa lipid, biến đổi cấu trúc DNA, quá trình oxy hóa protein, làm mất hoạt tính enzyme và cuối cùng có thể dẫn đến chết tế bào. Cơ thể động vật hay con người thường có các hợp chất có tính chống oxy hóa cao như gluthathione, vitamin E, vitamin C... Khi hàm lượng các chất chống oxy hóa trong cơ thể giảm xuống sẽ làm tăng nguy cơ các tế bào bị oxy hóa và biến đổi cấu trúc, chức năng do tác nhân oxy hoạt ROS. Tuy nhiên, những ảnh hưởng bất lợi của ROS có thể được ngăn ngừa bằng cách bổ sung chế độ ăn giàu thực phẩm có chứa chất chống oxy hóa (các loại đậu, rau và trái cây tươi…) và các vitamin có lợi cho sức khỏe con người. Các chất chống oxy hóa tự nhiên như các hợp chất polyphenol có khả năng loại bỏ gốc tự do, ngăn chặn quá trình oxy hóa rất hiệu quả và thường có trong các 8
sản phẩm tự nhiên như chè xanh. Nghiên cứu này tập trung nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các polyphenol có nguồn gốc từ chè xanh và vitamin C. 1.3.1. Sự oxy hóa, chất chống oxy hóa, các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 1.3.1.1. Sự oxy hóa Các quá trình oxy hóa xảy ra trong tế bào dưới tác dụng của các gốc tự do tạo ra năng lượng phá hủy các DNA, protein…là sự oxy hóa. 1.3.1.2 Chất chống oxy hóa Chất chống ôxy hóa là những chất chống lại sự ôxy hóa hoặc kiềm chế những phản ứng gây ra bởi oxygen hoặc peroxide 1.3.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hoạt tính chống oxy hóa. Những phương pháp được sử dụng phổ biến có thể kể đến là: phương pháp DPPH  , phương pháp ABTS   , phương pháp DMPD, phương pháp FRAP, phương pháp phép thử sinh học. 1.3.2. Tổng quan về hợp chất polyphenol có tác dụng chống oxy hóa. Đặc điểm chung của polyphenol là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa một hay hai, ba... hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen. 1.3.3. Cơ chế hoạt động của các hợp chất chống oxy hóa polyphenol 1.3.3.1 Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atomic Transfer-HAT) 1.3.3.2 Cơ chế chuyển một electron chuyển proton (Single Electron Transfer- Proton Transfer − SET−PT). 1.3.3.3 Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer − SPLET). 1.3.4. Khả năng chống oxy hóa của các polyphenol trong chè xanh. 1.3.4.1 Thành phần catechin trong lá chè xanh. Trong chè xanh gồm các thành phần: nước, các catechin chè xanh, caffein, protein và acid amin, carbohydrates, các chất màu, vitamin và khoáng và enzyme, trong đó các catechhin chè xanh thuộc phân lớp flavan-3-ol hay còn gọi là flavanol trong lớp chất flavonoid. Các chất này có bộ khung C6-C3-C6, được cấu thành từ 3 vòng phenol được kí hiệu là A, B và C, khác nhau về mức độ hydroxyl hóa. 9
Hình 1.23. Một số cấu trúc catechin chè xanh điển hình 1.3.4.2. Khả năng chống oxy hóa của EGCG, EC. Khả năng chống oxy hoá của EGCG, EC được cho là chủ yếu theo cơ chế chống oxi hoá trực tiếp (Direct antioxidant effects). Hoạt tính chống oxi hoá của EC và EGCG là do phản ứng chuyển vị nguyên tử hidro (HAT) hoặc phản ứng chuyển vị electron (SET) hoặc cả hai quá trình trên [58]. 1.3.5. Khả năng chống oxy hóa của AA 1.3.5.1. Cấu tạo và tính chất của AA Hình 1.25. Cấu tạo phân tử của AA. 1.3.5.2. Khả năng chống oxy hóa của AA Vai trò chính của AA là trung hòa các gốc tự do, do khả năng hòa tan trong nước nên nó có thể hoạt động cả bên trong và bên ngoài tết bào. Do AA dễ dàng nhường điện tử để loại, dập tắt các phản ứng gốc tự do, các chất oxy hóa, oxy đơn độc và ngăn chặn sự oxy hóa lipid. 1.4. Các phương pháp đánh giá, đo lường tổn thương bức xạ mức độ phân tử và tế bào. DNA sau khi chiếu xạ sẽ được đánh giá tổn thương bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng có hai phương pháp phổ biến đó là phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) nhân đoạn [1, 63, 64] hoặc và phân tích đứt gãy sợi đơn và đứt gãy đôi bằng phương pháp điện di DNA [1, 18]. Để nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ đối với tế bào có thể kể đến các phương pháp chủ yếu như Xác định tỉ lệ sống sót của tế bào sau chiếu xạ; Đánh giá các đột biến của tế bào sau khi chiếu xạ. 10
Khi vi sinh vật bị chiếu xạ bằng bức xạ ion hóa, các photon năng lượng cao hoặc hạt tích điện sẽ tấn công các đại phân tử sinh học (DNA, protein…), năng lượng bức xạ sẽ làm tổn thương chúng và sau đó gây sai lệch cấu trúc và chức năng trong tế bào (tương tác trực tiếp) hoặc tương tác với các phân tử nước tạo ra những gốc tự do (OH  ; H  ). Những gốc tự do này sẽ gây ra những tổn thương các phần tử sinh học. Đối với DNA, các tổn thương này có thể là đứt gẫy đơn hoặc đứt gãy đôi của DNA (tương tác gián tiếp). Cấu trúc xoắn kép của DNA gồm 2 sợi đơn liên kết với nhau bởi các cặp bazơ, khi một sợi bị tổn thương thì sợi còn lại sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp và sửa chữa phần bị tổn thương. Nếu cả 2 sợi của DNA bị đứt gãy thì không có khuôn để sửa nên cách phục hồi có thể không đúng hoặc không phục hồi. Đứt gãy đôi gây ra những tổn thương nghiêm trọng đối với các tế bào bởi với tế bào có đứt gãy đôi trong DNA thì rất khó để tái tạo hoặc quá trình tái tạo sẽ không hoàn thiện và xuất hiện những đột biến. Do vậy đánh giá tỉ lệ đứt gãy của DNA, tỉ lệ sống sót của tế bào là một nhân tố quan trọng trong việc xác định tác động sinh học của các bức xạ ion hóa [1,4]. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Cơ thể người có hàng tỷ tế bào đã chuyên biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào thần kinh, tế bào máu, tế bào cơ.... Mỗi loại thực hiện mộ chức năng, nhiệm vụ khác nhau. Dù một số sinh vật đa bào được sử dụng làm sinh vật mẫu (được dùng trong các nghiên cứu), nhưng mức độ phức tạp của các sinh vật này khó so sánh với cơ thể người. Vì vậy, để tránh vấn đề phức tạp, sinh vật đơn bào được lựa chọn làm sinh vật mẫu. Trong nghiên cứu này, các tế bào nấm men sẽ được sử dụng. Trong các phần tử sinh học thì DNA là quan trọng nhất vì mang thông tin di truyền. Vì thế, tổn thương DNA không chỉ ảnh hưởng tới tế bào mà còn có thể di truyền đến các tế bào con cháu. Do đó, các nghiên cứu về tác hại của bức xạ cũng như khả năng bảo vệ bức xạ ở mức độ phân tử chỉ tập trung vào DNA. 2.1.1 DNA plasmid 2.1.1.1 Tổng quan về plasmid Plasmids (thường) là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể. 2.1.1.2. Phân loại plasmid 2.1.1.3. Hình thái và sự nhân lên của plasmid 2.1.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 2.1.2.1. Một số đặc tính của tế bào nấm men Saccharomyces Nấm men (yeast) là tên chung chỉ nhóm nấm có đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. 2.2.2.2. Cấu tạo 11
Nấm nem có cấu tạo đơn bào mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống. Chúng có cấu tạo gồm màng, bào tương và nhân. 2.1.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính). 2.2. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu. - Epigallocatechin gallate (EGCG) được mua từ Nagara Science, Co. ltd, với độ tinh khiết ≥ 99%. - Epicatechin (EC) được mua từ Nagara Science, Co. ltd, với độ tinh khiết ≥ 99%. - Acid ascorbic (AA) được mua từ Nacalai Tesque, Inc, với độ tinh khiết ≥ 99%. 2.3 Phương pháp nghiên cứu. 2.3.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ phóng xạ của EGCG, EC, AA đối với DNA Bước 1: Tách chiết Plasmid DNA từ E.Coli Bước 2: Chuẩn bị EGCG, EC, AA và hòa tan vào LTB buffer Bước 3: Pha plasmid DNA với dung dịch chứa các chất chống oxy hóa Bước 4: Chiếu xạ Bước 5: Sử dụng hệ điện di gel agarose, đánh giá mức độ đứt gãy của plasmid DNA bằng phương pháp phân tích cường độ quang huỳnh quang.  Phân lập và tách chiết DNA của plasmid Về nguyên lý, quá trình phân lập và tách chiết DNA của plasmid tuần tự theo các bước sau đây: - Phá vỡ màng tế bào (lysis method): - Ly tâm (centrifugation): Bằng cách ly tâm, các thành phần bên trong tế bào và đại thành phần cấu trúc khác sẽ lắng xuống đáy và được loại bỏ. DNA của plasmid nằm trong phần nước trong trên được thu nhận, còn các tiểu phần tế bào, kể cả DNA của nhân (vì có trọng lượng phân tử lớn hơn) sẽ lắng xuống đáy được loại bỏ.  Phương pháp điện di DNA trên gel agarose: DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ nghịch với kích thước đoạn DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau trên bản gel. Xác định diện tích quang phổ thu được ta có thể tính được tỉ lệ đứt gãy DNA. Diện tích DNA đứt gãy Tỉ lệ % đứt gãy DNA = *100% Tổng diện tích của tất cả các dải DNA 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu với tế bào nấm men. Bước 1: Tế bào được nuôi cấy trong YPD lỏng có chứa các chất chống oxy hóa trong 24 giở nhiệt độ 30 0C. 12
Bước 2: Sử dụng kính hiển vi để đếm số tế bào trong 1ml YDP, sau đó tiến hành giảm thiểu. Bước 3: Các tế bào được đạt trong các màng chứa tế bào với mỗi màng chứa chứa 200 tế bào Bước 4: Chiếu xạ Bước 5: Tế bào được nuôi trên YPD rắn trong 2 ngày ở nhiệt độ 30 0C. Tính tỉ lệ sống sót của tế bào 2.3.2.1. Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men Môi trường để nuôi cấy tế bào nấm men là môi trường gồm các chất hóa học sau: yeast extract - peptone - D-glucose (YPD lỏng, yeast extract 1%; peptone 2%%; D-glucose 2,0%) và môi trường YPD agar (môi trường YPD bổ sung 2% agar). Các tế bào nấm men được nuôi cấy trong 24 giờ ở 30 0C trong môi trường lỏng YPD mà không có bất kỳ chất bảo vệ phóng xạ nào làm đối chứng và bổ sung 300 μM, 500 μM và 1000 μM EGCG, EC hoặc AA. Sau 24 giờ nuôi cấy, nồng độ tế bào được đếm bằng Neubauer buồng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần. Sau khi biết nồng độ ban đầu, các dung dịch tế bào nấm men được pha loãng theo pha log để có nồng độ 40 tế bào/ml, và cứ 5 ml sau đó được lọc qua bộ lọc chân không (hệ thống vô trùng Sterifil, Milipore®; Billerica, MA) bằng cách sử dụng nitrocellulose Bộ lọc màng 47 mm 0,45 μm (Milipore®; Billerica, MA) sau đó lọc các tế bào nấm men khỏi môi trường lỏng YPD. Mỗi màng lọc (chứa 200 tế bào nấm men) được đặt trong đĩa Petri 50 mm. Tại một điểm liều, 5 màng được chuẩn bị cho mỗi nhóm của mỗi chất bảo vệ phóng xạ để bị sai lệch độ lệch. Sau khi lọc xong, mỗi màng lọc (chứa 200 tế bào nấm men) được đặt trong đĩa Petri 50 mm. 2.3.2.2 Tỉ lệ sống sót của tế bào Số lượng tế bào sống còn lại sau khi chiếu xạ có thể được so sánh với số lượng tế bào ban đầu (trước khi chiếu xạ) để có tỷ lệ sống sót (S), như trong công thức dưới đây: S %   A . *100% B A: Số lượng khuẩn lạc của nhóm tế bào khi bị chiếu xạ B: Số lượng khuẩn lạc của nhóm tế bào không bị chiếu xạ 2.3.2.3 Phương trình LQ (Linear- quadratic) Một đường cong mô tả suy giảm tỷ lệ sống sót (S) khi tăng liều lượng (D) theo quy luật hàm mũ với các hằng số α và β là các hằng số. 2 𝑆 = 𝑒 −(𝛼𝐷+𝛽𝐷 ) Phương trình này còn được gọi là phương trình LQ. Phương trình LQ bao gồm hai thành phần chết tế bào: một thành phần tỷ lệ với liều lượng (αD) và thành phần còn lại tỷ lệ với bình phương liều lượng (  D ). Điều này chỉ ra rằng sự 2 sống sót của tế bào sau một liều bức xạ ion hóa tuân theo sự kết hợp của động 13
học một lần hoặc động học tuyến tính (dường như đại diện cho SSB) và động học hai lần được biểu thị bằng một thuật ngữ bậc hai (dường như đại diện cho DSB). Hơn nữa, tỷ số α/β đặc trưng cho tổn thương gây bức xạ lên tế bào dẫn đến đột biến. 2.4. Phương pháp bố trí mẫu và xử lý chiếu xạ 2.4.1 Chiếu xạ gamma (LET thấp) Nguồn bức xạ gamma được sử dụng trong nghiên cứu này là nguồn đồng vị Cobalt 60, thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học và Công nghiệp (ISIR), Đại học Osaka. Hoạt độ nguồn tại thời điểm chiếu xạ là 127,66 TBq (LET 0,2 keV/μm). Để nhận được liều hấp thụ đồng đều, các mẫu được đặt cách nguồn bức xạ (Co- 60) cùng một khoảng cách và thời gian xác định. 2.4.2. Chiếu xạ chùm ion (LET cao) Nguồn ion được sử dụng trong nghiên cứu này là chùm ion Helium với năng lượng 220 Mev (55 MeV/hạt) với LET 5,5 keV/μm tại Trung tâm Nghiên cứu Năng lượng Wakasa-Wan, Tsuruga, Fukui, Nhật Bản. Các mẫu được chiếu xạ trong cùng điều kiện với các khoảng thời gian khác nhau để đạt được liều hấp thụ khác nhau. 2.4.3. Xác định liều hấp thụ Đối với chiếu xạ gamma, liều chiếu xạ được xác định theo tính toán lý thuyết dựa trên hoạt độ nguồn. Đối với chiếu xạ chùm ion helium, liều hấp thụ được xác định bằng buồng ion hóa (A), (B). Buồng ion hóa hình tròn (A) được lắp đặt tại cửa sổ phát chùm tia và đo lượng điện tích được tạo ra bởi chùm ion helium đi qua. Buồng ion hóa (B) được lắp đặt tại vị trí mẫu dùng để đo liều tích lũy [C/kg] khi chùm tia đi qua và liều hấp thụ [Gy] được tính toán bằng cách sử dụng hệ số chuyển đổi áp dụng cho chùm ion helium. Hình 2.13. Mô tả phương pháp đo liều chiếu xạ chùm ion helium CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đứt gãy DNA, giá trị G và tổn thương tương đối của DNA khi trong môi 14
trường chứa DNA có EGCG, EC, AA. Hình 3.1. Hình ảnh điện di trên gel agarose 1,0% (w/v) của plasmid pUC118 bị chiếu xạ gamma với các liều xạ khác nhau. Giếng 1 - 3 ứng với liều chiếu 0 Gy; giếng 4 - 6 ứng với liều chiếu 25 Gy; giếng 7 - 9 ứng với liều chiếu 50 Gy; giếng 10-12 ứng với liều chiếu 75 Gy và giếng 12-14 ứng với liều chiếu 100 Gy. Giếng 16 là giếng đánh dấu trọng lượng phân tử DNA. Ảnh điện di trên gel agarose của DNA plasmid pUC 118 chiếu xạ gamma với các liều 0, 25, 50, 75 và 100 Gy được trình bày trên Hình 3.1. Dễ dàng nhận thấy, DNA plasmid ban đầu (không chiếu xạ, giếng 1-3) có cấu trúc hình xoắn kép ổn định không bị đứt gãy như chỉ ra bởi hình ảnh các băng điện di đặc hiệu rõ nét. Các băng điện di này cũng không cho thấy bất kỳ dải nào khác ứng với plasmid có cấu trúc hình tròn mở và đường thẳng, hình thành do đứt gãy đơn và đứt gãy đôi gây bởi chiếu xạ tia gamma như đã đề cập trong phần tổng quan. Đối với các DNA bị chiếu xạ (giếng 4-15), xuất hiện dải điện di ứng với đứt gãy đơn (SSB) gây bởi chiếu xạ gamma. Các dải điện di hình thành do các phân tử DNA bị đứt gãy đơn dần trở nên sắc nét hơn, trong khi dải điện di của DNA cấu trúc xoắn mờ dần khi liều chiếu tăng. Kết quả điện di cũng cho thấy không xuất hiện bất kỳ dải điện di nào khác trên các băng điện di, chứng tỏ sự đứt gãy đôi của DNA plasmid không ghi nhận được trong khoảng liều chiếu 25-100 Gy. Hình 3.2. Tỷ lệ phần Hình 3.3. Tỷ lệ phần Hình 3.4. Tỷ lệ phần trăm trăm đứt gãy đơn (SSB) trăm đứt gãy đơn đứt gãy đơn (SSB) của của DNA plasmid sau (SSB) của DNA DNA plasmid sau khi khi chiếu xạ gamma plasmid sau khi chiếu chiếu xạ gamma không không hoặc có bổ sung xạ gamma không hoặc hoặc có bổ sung 1000 µM 300 µM EC hoặc EGCG có bổ sung 500 µM EGCG hoặc EC hoặc AA. hoặc AA. Các giá trị EGCG hoặc EC hoặc Các giá trị được hiển thị 15
được hiển thị dưới dạng AA. Các giá trị được dưới dạng trung bình ± trung bình ± SD (tổng số hiển thị dưới dạng SD (tổng số mẫu là 5). mẫu là 5). trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). Kết quả nghiên cứu tổn thương của DNA và vai trò bảo vệ phóng xạ của EGCG, EC, AA theo LET được thể hiện trên Hình 3.6, 3.7, 3.8 khi thay nguồn chiếu xạ gamma bằng nguồn helium. Kết quả quang phổ trên gel điện di cũng không ghi nhận được đứt gãy đôi. Hình 3.6. Tỷ lệ phần trăm Hình 3.7. Tỷ lệ phần Hình 3.8. Tỷ lệ phần trăm SSB của DNA plasmid sau trăm SSB của DNA SSB của DNA plasmid khi chiếu xạ bằng ion plasmid sau khi chiếu xạ sau khi chiếu xạ bằng helium không hoặc có bổ bằng chùm helium chùm ion helium không sung 300 µM EGCG hoặc không hoặc có bổ sung hoặc có bổ sung 1000 µM EC hoặc AA. Các giá trị 500 µM EGCG hoặc EC EGCG hoặc EC hoặc được hiển thị dưới dạng hoặc AA. Các giá trị AA. Các giá trị được hiển trung bình ± SD (tổng số được hiển thị dưới dạng thị dưới dạng trung bình mẫu là 5). trung bình ± SD (tổng số ± SD (tổng số mẫu là 5). mẫu là 5). Kết quả thực nghiệm cho thấy tỉ lệ đứt gãy đơn của DNA plasmid khi bị chiếu xạ bởi chùm bức xạ gamma và helium đã giảm đi đáng kể trong trường hợp có EGCG, EC và AA ở tất cả các hàm lượng. Để đánh giá về hiệu suất tác dụng của bức xạ ion hóa, giá trị của G (G- value) của bức xạ được xác định. Đây chính là tỷ số giữa số phần tử bị tổn thương M và giá trị năng lượng E mà tổ chức sinh học, trường hợp này là DNA plasmid, hấp thụ được từ nguồn bức xạ chiếu vào. Thông thường giá trị G được xác định khi hấp thụ năng lượng bức xạ 100 eV theo công thức sau: M G 100 16
Hình 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng EC, EGCG, AA đến giá trị G của bức EC, EGCG đến giá trị G (G value) của xạ gamma đối với DNA plasmid. Các chùm helium đối với DNA plasmid. giá trị được hiển thị dưới dạng trung Các giá trị được hiển thị dưới dạng bình ± SD (tổng số mẫu là 5). trung bình ± SD (tổng số mẫu là 5). Các kết quả thu được của luận án đã chứng minh rằng EGCG, EC, AA ở tất cả các hàm lượng nghiên cứu (trên 300 µM) đều có thể giảm tổn thương và do đó tỷ lệ đứt gãy sợi đơn của DNA plasmid do bức xạ gamma và chùm ion helium gây ra. Điều này nghĩa là cả EGCG, EC, AA đều có khả năng tiêu hủy các gốc tự do sinh ra bởi bức xạ LET thấp và LET cao, từ đó giảm tỷ lệ tổn thương DNA gây bởi hai loại bức xạ này. Hình 3.11. Tổn thương tương đối của Hình 3.12. Tổn thương tương đối DNA khi bị chiếu xạ bằng bức xạ của DNA khi bị chiếu xạ bằng chùm gamma theo hàm lượng chất chống ion helium theo hàm lượng chất oxy hóa bổ sung vào dịch chiết DNA chống oxy hóa bổ sung vào dịch chiếu xạ. Các giá trị được hiển thị chiết DNA chiếu xạ. Các giá trị được dưới dạng trung bình ± SD (tổng số hiển thị dưới dạng trung bình ± SD mẫu là 5). (tổng số mẫu là 5). Như quan sát trên Hình 3.11 và 3.12, tổn thương tương đối gây bởi bức xạ LET thấp và LET cao đều giảm khi bổ sung EGCG, EC và AA vào trong dịch chiết DNA chiếu xạ. Như vậy, cả ba chất chống ô xy hóa trên đều có khả năng bảo vệ phóng xạ đối với DNA plasmid, giúp giảm tỷ lệ tổn thương tương đối của DNA bị chiếu xạ. Đối với cả bức xạ LET thấp và cao, mức độ tổn thương tương đối của dịch chiết DNA bổ sung EGCG thấp hơn so với dịch chiết bổ sung EC và AA. Điều này chứng tỏ rằng EGCG có khả năng bảo vệ DNA khỏi bức xạ tốt hơn so với EC và AA ở cùng hàm lượng. Tổn thương tương đối của DNA 17
plasmid trong trường hợp bị chiếu bởi bức xạ gamma dường như không thay đổi theo hàm lượng EC bổ sung trong khoảng 300 µM đến 1000 µM. Kết quả thu được cũng cho thấy mức độ tổn thương tương đối của DNA được bổ sung 1000 µM EGCG, AA giảm mạnh trong cả hai trường hợp bị chiếu xạ bằng tia gamma và chùm helium. Bởi vì tổn thương tương đối của DNA khi chiếu xạ có bổ sung EC dường như không thay đổi theo hàm lượng chất chống oxy hóa này nên các nghiên cứu về tác động của bức xạ đối với tế bào nấm men và khả năng bảo vệ bức xạ của chất chống oxy hóa chỉ được thực hiện với EGCG và AA với hàm lượng khác nhau. 3.2. Tỷ lệ sống sót của tế bào khi trong môi trường nuôi cấy có chứa EGCG, AA a) b) Hình 3.13. Số khuẩn lạc phát triển sau khi chiếu xạ trên môi trường thạch YPD sau 2 ngày ở nhiệt độ 30 0C (a. không bổ sung chất chống oxy hóa, b. có bổ sung chất chống oxy hóa EGCG với hàm lượng 500 µM). Từ giá trị thực nghiệm thu được tỉ lệ sống của tế bào phụ thuộc vào liều chiếu chúng tôi xác định đường cong phản ứng liều. Đó là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc tỉ lệ sống sót của tế bào bị chiếu xạ vào liều chiếu được thiết lập theo phương trình LQ. Hình 3.14. Tỷ lệ sống Hình 3.15. Tỷ lệ sống sót Hình 3.16. Tỷ lệ sống sót sót của tế bào nấm men của tế bào nấm men được của tế bào nấm men được được chiếu xạ bằng bức chiếu xạ bằng chùm bức chiếu xạ bằng bức xạ 18