Tóm tắt Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thành phần hóa học cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.- Valerianaceae)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

51
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên c ứu thành ph ần hóa h ọc cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.- Valerianaceae)” được tiến hành nhằm tìm ra và chứng minh giá trị y học của cây thuốc này và so sánh với các loài đã dùng trên thế giới nhằm tăng cường nguồn thảo dược trong điều trị chứng mất ngủ cho người Việt Nam và nâng cao giá trị của dược liệu nước nhà.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thành phần hóa học cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.- Valerianaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NỮ LANG HARDWICKE (Valeriana hardwickii Wall. Valerianaceae) Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh Tp. Hồ Chí Minh, năm 2018
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN Công trình được hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 1. Huỳnh Lời, Trần Thị Bảo Châu, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu về cây Nữ lang Harwicke I: Khảo sát thực vật học cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall. Valerianaceae)”, Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 15(1), tr. 612-616. Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Trần Hùng 2. Loi Huynh, Hung Tran, Thomas Pacher, Johannes Novak (2013), “Comparative analysis of the essential oils of Valeriana hardwickii Wall. from Vietnam and Valeriana officinalis from Austria”. Journal Phản biện 1: of Essential Oil Research, 25(5), pp. 409-414. 3. Huỳnh Lời, Bùi Ngọc Thảo Trang, Trần Hùng (2014), “Nghiên cứu về cây Nữ lang Hardwicke II: Phân lập terpenoid từ thân và thân rễ Nữ Phản biện 2: lang Hardwicke Valeriana hardwickii”, Tạp chí Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 18(2), tr. 478-480. Phản biện 3: 4. Huỳnh Lời, Nguyễn Hữu Chí, Rudolf Moldzio, Trần Hùng (2015), “Nghiên cứu về cây Nữ lang Hardwicke III: Độc tính trên dòng tế bào thần kinh của isovaleroxyvaltrat hydrin và linarin phân lập từ Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii wall. Valerianaceae) và tác dụng Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại: chống oxy hóa của Valeriana hardwickii và Valeriana officinalis”. ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 19(3), tr. 574-580. vào hồi ……..giờ……….ngày…….tháng……..năm ………. 5. Huỳnh Lời, Bùi Khương Duy, Nguyễn Thị Phú, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng (2015). “Acute toxicity and anxiolytic, tranquilizing-like effect of Valeriana hardwickii extract in mice”, Journal of Medicinal Materials - Hanoi (Tạp chí Dượcc Liệu), 20 (3), tr. 186-192. Có thể tìm hiểu luận án tại: 6. Huỳnh Lời, Trần Hùng (2015), “Chemical constituents of Valeriana - Thư viện Quốc gia Việt Nam hardwickii Wall”. Proceeding of Asean PharmNET I, Bangkok, pp. - Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh 274-279. - Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 7. Loi Huynh, Hung Tran, Markus Bacher and Thomas Pacher (2016), “Iridoids and flavonoids from Valeriana hardwickii Wall.”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry”, 5(3), pp. 245-248.
24 1 4. Thử nghiệm tác dụng sinh học GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tác dụng chống oxy hóa với DPPH của rễ, thân, và lá quy theo Trolox lần 1. Đặt vấn đề lượt là 9,11; 6,53 và 13,71 mg/g ở V. hardwickii so với 15,76; 10,25 và 30,85 Hiện nay, theo thống kê, tỷ lệ người mất ngủ cấp và mãn tính trên thế giới mg/g ở rễ, thân, lá loài V. officinalis. Tác dụng chống oxy hóa với FRAP trên thay đổi từ 3,9-22%. Ở Việt Nam, tính theo tỷ lệ chung với 10% thì cả rễ; thân, lá tính theo Trolox lần lượt là 1,12; 0,69; 1,87 mg/g ở V. hardwickii; nước có gần 9,5 triệu người mất ngủ mãn tính. Mất ngủ dẫn tới nhiều so với 1,84; 0,97; 3,43 mg/g trên rễ; thân, lá loài V. officinalis. bệnh như lo lắng, tăng huyết áp, bệnh tim mạch, tăng lipid máu. Thuốc Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin không gây độc trên dòng tế bào điều trị mất ngủ có nguồn gốc hóa dược như BDZ có nhiều tác dụng phụ Neuroblastoma N18TG2 ở các nồng độ 0,01; 0,1; 1 và 10 g/ml. Hợp chất như lệ thuốc, té ngã, buồn ngủ, sa sút trí tuệ, tử vong. Vì vậy, việc tìm 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) không gây độc trên các kiếm dược liệu cho điều trị bệnh mất ngủ là rất cần thiết. Ở Việt nam, dòng tế bào MDA-MB 231, HCT 116 và Leukemia ở các nồng độ 5 g/ml Valeriana hardwckii (Nữ lang) dùng trị mất ngủ nhưng có ít tài liệu và 50 g/ml. nghiên cứu về Valeriana hardwickii. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.- Các cao chiết nước, cao chiết EtOH 45% và cao DCM của V. hardwickii Valerianaceae)” được tiến hành nhằm tìm ra và chứng minh giá trị y học không gây độc tính cấp trên chuột với liều Cao DCM, cao EtOH 45% và cao của cây thuốc này và so sánh với các loài đã dùng trên thế giới nhằm tăng nước lần lượt là 5000; 11900 và 14640 mg/kg chuột. Kết quả thử nghiệm cường nguồn thảo dược trong điều trị chứng mất ngủ cho người Việt Nam các cao trên mô hình môi trường mở, hai ngăn sáng tối và bơi gắng sức đã và nâng cao giá trị của dược liệu nước nhà. cho thấy các cao chiết có tác dụng an thần, giải lo âu trên chuột với liều 1/10 và 1/20 liều thử độc tính cấp. Đề tài bao gồm các mục tiêu như sau: KIẾN NGHỊ - Khảo sát hình thái, vi phẫu, bột dược liệu và phân tích ADN. - Phân tích sơ bộ thành phần hóa học, phân tích thành phần hóa học Các kết quả đạt được nêu trong luận án là cơ sở khoa học để thực hiện các bằng sắc ký lớp mỏng, bằng sắc ký lỏng, bằng sắc ký khí. Các phân hướng nghiên cứu tiếp theo cho dược liệu Nữ lang V. hardwickii: tích này có so sánh với V. officinalis. 1. Phân lập thêm các thành phần trong Nữ lang V. hardwickii, đặc biệt là - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các thành phần có trong Nữ các iridoid, lignan. lang Hardwicke. 2. Xác định các thành phần chưa xác định trong sắc ký khí. - Định luợng các thành phần có trong Nữ lang Hardwicke bằng UPLC. 3. Nghiên cứu các điều kiện trồng trọt để sản xuất các chế phẩm từ duợc - Tiến hành thử hoạt tính sinh học của cao chiết và hợp chất phân lập liệu này, thay thế cho V. officinalis ngoại nhập. được từ Nữ lang Hardwicke 4. Khảo sát tác dụng sinh học trên các thử nghiệm in vitro và in vivo các 2. Tính cấp thiết của đề tài cao chiết về tác dụng khác của dược liệu này như kháng viêm, tiểu đường. Việc tìm kiếm dược liệu cho điều trị bệnh mất ngủ là rất cần thiết. Nước 5. Áp dụng phương pháp định lượng bằng UPLC-PDA để định lượng các ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. với trên 12000 loài là mẫu thu thập các nơi. nguồn dược liệu quý dùng trong các bệnh trong đó có bệnh mất ngủ. Các loài thuộc chi Valeriana được dùng phổ biến để điều trị mất ngủ, lo âu, chữa chứng đau dạ dày-ruột và được dùng từ lâu ở các nước châu Âu
2 23 cũng như châu Á.Valerian ngày nay đã được đưa vào các chuyên luận cưú thực vật có cơ sở dữ liệu để xác định loài và so sánh với các loài khác Dược điển các nước và các tài liệu chính thống về điều trị. Việc dùng thuộc chi Valeriana. Valerian ít tác dụng phụ, tương đương với placebo. Do những lý do trên, 2. Nghiên cứu hóa học đề tài được thực hiện trên loài Valeriana hardwickii nhằm làm sáng tỏ Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cho thấy V. hardwickii có tinh thành phần cũng như tác dụng dược lý của dược liệu này. dầu, terpenoid, polyphenol. 3. Những đóng góp mới của luận án Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy trong V. hardwickii có các 3.1. Thực vật học thành phần terpenoid (tinh dầu, triterpen, iridoid…), polyphenol. So sánh Việc phân tích ADN của V. hardwickii với mã số định danh KX356086.1 với V. officinalis cho thấy 2 loài có 6 thành phần tương tự nhau và 2 thành trên trang thư viện gen của Mỹ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) phần khác biệt. Phân tích bằng HPLC cho thấy lá V. hardwickii chủ yếu có là lần đầu tiên được thực hiện với gen ITS. Với bản đồ gen được công polyphenol, trong thân và rễ ngoài polyphenol còn có iridoid. Trong rễ V. bố, các nhà nghiên cưú thực vật có cơ sở dữ liệu để so sánh, xác định và officinalis chủ yếu chứa các dẫn chất thuộc dẫn chất acid valerenic với hàm phân loại các loài trong chi Valeriana. lượng lớn trong khi đó rễ V. hardwickii với thành phần iridoid di-en là thành phần chính. Phân tích thành phần bay hơi bằng GC/MS cho kết quả ở rễ, 3.2. Phân tích các thành phần thân, lá của loài V. hardwickii có số thành phần được xác định tương ứng là - Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên loài V. hardwickii 62, 31, 31, trong khi đó trong rễ V. officinalis có 55 thành phần. và V. officinalis. Phân tích này giúp làm sáng tỏ các thành phần hóa học Từ V. hardwickii, đã phân lập được 11 hợp chất, tất cả đều là lần đầu tiên trong V. hardwickii đồng thời phân tích so sánh với dược liệu được được phân lập từ loài này (-sitosterol, daucosterol, linarin, neobudofficid, nghiên cứu nhiều là V. officinalis nhằm giúp cho hiểu rõ hơn sự tương rhoifolin, neodiosmin, acid oleanolic, acid ursolic, chlorvaltrat, isovaleroxy đồng về hóa học và có thể tương đồng về tác dụng dược lý. valtrat hydrin và 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton). Trong đó - Phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng lần đầu tiên được tiến 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton là hợp chất mới lần đầu được biết. hành để định tính các thành phần hóa học trong V. hardwickii và có so sánh với V. officinalis. Phân tích HPLC góp phần làm sáng tỏ sự tương 3. Định lượng các thành phần đồng về hóa học của hai dược liệu này. Phenol toàn phần trong lá, thân và rễ tính theo acid caffeic lần lượt là 24,3; - Phân tích bằng sắc ký khí cũng là phân tích mới trên loài V. hardwickii 17,4; 18,4 mg/g ở V. hardwickii; so với lá, thân và rễ lần lượt là 43,1; 16,0; ở Việt nam. Ngoài loài này, phương pháp này cũng đã được tiến hành 23,4 mg/g ở V. officinalis. trên V. officinalis. Kết quả cũng đã cho thấy các thành phần giống nhau Phương pháp định lượng đồng thời linarin, rhoifolin, neobudofficid và acid và khác nhau của hai dược liệu này. Phân tích này đã được công bố trên clorogenic bằng UPLC-PDA đã đuợc xây dựng với khoảng tuyến tính (R2 > tạp chí quốc tế chuyên ngành về sắc ký khí giúp cho các nhà hóa học có 0,999; 0,05-120 gml), độ lặp lại (RSD < 2%), độ đúng đạt 90 – 107%. cơ sở dữ liệu về các kiểu hóa học (chemotype) của cả hai loài này. Hàm lượng acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid và linarin trong mẫu lá 3.3. Phân lập và thử tác dụng sinh học các hợp chất phân lập V. hardwickii lần lượt là 1,24; 0,69; 0,05; và 1,26%. Hàm luợng acid - Trong nghiên cứu này, có 3 chất là các flavonoid lần đầu tiên tìm thấy clorogenic trong thân và rễ V. hardwickii lần lượt là 5,1% và 0,45%; so với trong chi Valeriana, đó là neobudofficid, rhoifolin, neodiosmin. Ngoài 0,44% và 0,66% ở lá và rễ của V. officinalis.
22 3 được thử nghiệm tác dụng độc tế bào Leukemia, HCT 116 và MDA MB 231. ra, có 5 chất lần đầu công bố trong loài V. hardwickii đó là chlorvaltrat, Kết quả cho thấy THDN không độc trên các dòng tế bào trên. Theo báo cáo isovaleroxyvaltrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, linarin. Chúng về hợp chất có cấu trúc tương tự là jatamin A, jatamin G, hexahydro-6- thuộc các nhóm iridoid, triterpenoid và flavonoid. Kết quả cũng đã được hydroxy-7-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran-1(3H)-on, đăng trên tạp chí quốc tế chuyên ngành về hóa học và dược liệu, giúp villosid aglycon được phân lập từ V. wallichii. Ba chất đầu cũng đã được thử cho các nhà nghiên cứu có dữ liệu về phổ học cũng như thành phần hóa tác dụng trên dòng tế bào ung thư nguời K562 và HepG2 và cho thấy không học của chi Valeriana. có tác dụng ức chế trên các dòng tế bào này (IC50 > 50 M). - Công trình nghiên cứu cũng đã phân lập được chất mới lần đầu công bố + Về thử nghiệm độc tính cấp, an thần và giải lo âu trên cao chiết V. là 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton. Hợp chất này cũng đã được hardwickii thử độc tính trên 3 dòng tế bào. Với chất mới này, cần được thử nghiệm trên các mô hình tác dụng dược lý khác như tiểu đường, chống viêm, Trong nghiên cứu này, tất cả chuột sống sót sau khi đã dùng cao chiết với kháng histamin nhằm tìm ra công dụng điều trị của nó. liều lượng khác nhau sau 14 ngày quan sát. Không có sự khác nhau giữa - Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin và 6,10,11-trihydroxy nhóm uống cao chiết và nhóm chứng. Không có sự bất thường nào của cơ dihydronepetalacton là các chất lần đầu được thử nghiệm độc tính trên quan chuột. Điều này cho thấy các cao chiết không có độc tính cấp và an các dòng tế bào và kết quả là chúng không có tác dụng độc tế bào. Kết toàn trong sử dụng. Độc tính cấp ở liều 5000 mg/kg (DCM), 11900 mg/kg quả này cho thấy sự an toàn trong sử dụng V. hardwickii. (cao 45% EtOH) và cao nước với liều 14640 mg/kg của V. hardwickii được xem là không phân loại độc tính khi liều 2 g/kg không gây chết hay triệu 3.4. Định lượng hàm lượng phenol toàn phần và thử nghiệm chống oxy hóa chứng độc trên chuột. Theo tài liệu, các loài khác thuộc chi Valeriana như Định lượng phenol toàn phần và thử tác dụng chống oxy hóa trên 2 mô Valeriana pavonii với liều 2000 mg/kg với cao EtOH, V. jatamansi với liều hình DPPH và FRAP cũng được tiến hành lần đầu tiên trên cả hai dược 10000 mg/kg, liều dùng của V. hardwickii trong nghiên cứu này cao hơn và liệu V. hardwickii và V. officinalis. Kết quả cho thấy hàm lượng các hợp có thể an toàn hơn với các loài thuộc chi Valeriana nêu trên. Các nghiên cứu chất phenol và tác dụng chống oxy hóa của chúng. khác cũng đã công bố về độc tính của V. officinalis cho thấy cao EtOH có 3.5. Định lượng các flavonoid và acid clorogenic trong V. hardwickii và V. độc tính thấp với liều 3,3 g/kg (đường tiêm phúc mạc). officinalis Lần đầu tiên phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC-PDA) KẾT LUẬN được tiến hành xây dư5ng và định lượng đồng thời 3 flavonoid và acid Sau quá trình 6 năm thực hiện đề tài (9/2010-9/2016) với các phương pháp clorogenic. Phương pháp này đuợc dùng để định luợng các thành phần về thực vật học, hóa học và thử nghiệm sinh học, luận án đã hoàn thành các này trong V. hardwickii và ứng dụng chúng để định lượng acid nội dung nghiện cứu và đạt được tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu. clorogenic trong V. officinalis. 1. Thực vật học của V. hardwickii 3.6. Thử nghiệm độc tính cấp, an thần và giải lo âu trên cao chiết V. Hình thái thực vật của cây đã được mô tả chi tiết, các đặc điểm vi phẫu, bột hardwickii dược liệu đã được mô tả. Việc xác định ADN của V. hardwickii với mã số Tác dụng dược lý của V. hardwickii cũng lần đầu tiên được tiến hành KX356086.1 được đăng trên trang pubmed.com sẽ giúp cho các nhà nghiên trên dược liệu V. hardwickii với các cao chiết nước, EtOH 45% và cao
4 21 DCM. Các cao này không gây độc tính cấp trên chuột. Kết quả đã cho Lần đầu tiên, một phương pháp định luợng được thiết lập dùng để định lượng thấy các cao có tác dụng an thần, giải lo âu trên chuột. Tác dụng an thần, các thành phần bao gồm 3 flavonoid trong V. hardwickii và acid clorogenic giải lo âu cũng đã được đăng trên tạp chí chuyên ngành dược liệu trong trong cả hai dược liệu V. hardwickii và V. officinalis.. Hiện nay vẫn chưa có nước. tài liệu nào công bố việc định lượng đồng thời các thành phần này trong 4. Bố cục luận án Valeriana. Trong nghiên cứu này, kết quả định lượng bằng UPLC-PDA cho thấy acid clorogenic nhiều nhất trong thân V. hardwickii với hàm lượng Luận án gồm 136 trang: Mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 35 trang, 5,19% và thấp nhất trong lá V. officinalis 0,44%. Ngoài ra các flavonoid nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết quả nghiên được định lượng với hàm lượng tương ứng là acid clorogenic, rhoifolin, cứu 64 trang, bàn luận 12 trang, kết luận và đề nghị 3 trang. Luận án có neobudofficid, linarin 1,24%, 0,69%, 0,05%,1,26%. Trong một báo cáo về 39 bảng, 56 hình, 15 biểu đồ, 6 sơ đồ, 151 tài liệu tham khảo gồm 8 tài định lượng thành phần này bằng phương pháp HPLC-PDA kết quả cho thấy liệu tiếng Việt và 143 tài liệu tiếng Anh, 24 phụ lục thể hiện các kết quả hàm lượng cao nhất trong toàn cây loài V. officinalis là 1,16%. Trong lá V. thực nghiệm. hardwickii, hàm lượng linarin là 1,26% cao hơn hàm lượng trong V. jatamansi với hàm lượng 0,24%. Dựa vào kết quả định lượng, thân V. Chương 1. TỔNG QUAN hardwickii là nguồn chiết xuất acid clorogenic và lá là nguồn để chiết linarin. 1.1. Tổng quan về chi Valeriana Kết quả xây dựng phương pháp này được dùng để định tính, định lượng các Chi Valeriana thuộc họ Valerianaceae. Hiện nay được xếp vào họ thành trong V. hardwickii và góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho dược điển Caprifoliaceae. Họ Valerianaceae có khoảng 350 loài. Ở nước ta có 2 cho dược liệu này. loài: V. hardwickii (Nữ lang) và V. jatamansi (Sì to). Về thử nghiệm sinh học Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Valeriana chủ yếu chứa + Về thử nghiệm chống oxy hóa tinh dầu, iridoid (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid phenol, Khả năng chống oxy hóa cao nhất là dịch chiết lá, thấp nhất là dịch chiết lignan, alkaloid. Ngoài ra còn có amino acid (arginin, GABA, glutamin, thân, điều này có thể do hàm lượng các hợp chất phenol trong các bộ phận ở tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ khác. 2 loài. Đã có một báo cáo trước đây về khả năng chống oxy hóa của V. 1.2. Tổng quan về loài V. hardwickii hardwickii trên DPPH với chất đối chiếu là acid ascorbic, tuy nhiên thử Trên thế giới V. hardwickii mọc ở Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, nghiệm này chỉ khảo sát tòan cây và chiết riêng rẽ bằng dung môi khác nhau Malaysia, Indonesia. Ở nuớc ta, Nữ lang (V. hardwickii) mọc ở Ô Quý là nước, EtOH, aceton, cloroform, hexan. Trong đó cao aceton và hexan có Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng tính chống oxy hóa cao nhất. Rễ V. officinalis cũng đã được thử nghiệm khả Văn, Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), Kon Tum (Đắk Tô: năng chống oxy hóa với DPPH tính theo Trolox là 7,88 mM/100 g dược liệu Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt). (19,7 mg/g) và với FRAP tính theo Trolox là 1,78 mM/100 g (4,45 mg/g), Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên loài V. hardwickii không nhiều. kết quả này tương tự như kết qủa trong nghiên cứu này. Năm 1989, Đỗ Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2 thành phần + Về thử nghiệm độc tính các hợp chất phân lập được trong V. hardwickii từ V. hardwickii ký hiệu là N1, N2 và chưa xác định được cấu trúc Trong nghiên cứu này, hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton trong V. hardwickii là chất lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên và đã
20 5 neuroblastoma N18TG2 và cho thấy linarin không có tác dụng độc trên dòng Thành phần chính trong tinh dầu V. hardwickii var. arnottiana là tế bào này. Hơn nữa, linarin được chứng minh có tính giảm đau, hạ sốt, valeracetat, bornyl acetat, methyl linoleat, cuparen và α-cedren và hàm chống viêm. Ngoài ra, linarin có tính an thần và kéo dài giấc ngủ trên chuột lượng tinh dầu là 0,3% Tinh dầu V. hardwickii mọc ở Hymalaya có với thí nghiệm bảng đục lỗ (hole board test). Neobudofficid có cấu trúc gồm thành phần chính là methyl linoleat, valeracetat, bornyl acetat và - 2 đường rhamnose gắn vào 1 đường glucose. Neobudofficid không phổ biến terpinyl acetat. Các hợp chất epoxysesquithujen, volvalerenol (triterpen trong tự nhiên và được tìm thấy trong Turpinia arguta Staphyleaceae và với vòng 12 carbon), 4α,5α-epoxy-8β-hydroxy-1α-hydro-α-guaien; Buddleja officinalis Scrophulariaceae, hiện chưa thấy có tài liệu nào báo cáo 4α,5α-epoxy-1-hydroxy-α-guaien (sesquiterpen), syzalterin, 6- về sự tồn tại của neobudofficid trong chi Valeriana cũng như tác dụng sinh methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'-dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, học của hợp chất này. Rhoifolin lần đầu tiên đuợc phân lập từ Rhus apigenin, quercetin, tricin, farrerol, sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7- succedanea và được đặt tên dựa vào tên chi Rhus. Hợp chất này đầu tiên methoxyflavanon, bornyl ferulat, bornyl caffeat là các hợp chất đã phân được phân lập từ chi Valeriana và có tác dụng chống co thắt mạch vành và lập từ V. hardwickii. chống thiếu máu cơ tim trên chuột. Neodiosmin được tìm thấy trong Citrus 1.3. Tác dụng sinh học của V. hardwickii aurantium, Trollius ledebourii Ranunculaceae và lần đầu được phân lập Cho đến nay, ít có công trình nghiên cứu về tác dụng của V. hardwickii. trong Valeriana. Neodiosmin kém tan trong nước, có tính khử đắng Cao chiết thân rễ V. hardwickii thể hiện tác dụng chống co thắt. (debittering), chống oxy hóa mạnh, đuợc ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và được dùng trong nghiên cứu trợ tan với cyclodextrin và lysin. 1.4. Công dụng trong y học cổ truyền Công trình phân lập các hợp chất trong nghiên cứu này cũng đã được đăng Theo y học cổ truyền, Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác động vào trên tạp chí quốc tế, giúp cho V. hardwickii được biết đến rộng rãi hơn. 2 kinh: tâm, can. Cây có tác dụng ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông kinh. Loài này tương đối hiếm ở Việt Nam. Hoạt chất từ thân rễ dùng Về định lượng các thành phần làm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây dùng làm thuốc chữa + Về định lượng phenol toàn phần phong thấp, đau dạ dày, điều kinh, sốt ở trẻ em. Nữ lang V. hardwickii Kết quả định lượng phenol toàn phần trong cho thấy hàm lượng phenol toàn được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml nước sôi, để nguội uống trong phần của 2 loài gần tương tự nhau. Xét về hàm lượng phenol toàn phần ở ngày hoặc nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 g/ ngày, có thể từng bộ phận của cây, hàm luợng của chúng trong dịch chiết lá cao hơn trong thái nhỏ dược liệu, ngâm ethanol 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g dịch chiết thân và rễ, điều này xảy ra ở cả hai loài. Đã có một vài nghiên cứu pha loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm, ngày dùng 1-4 g về hàm lượng phenol toàn phần với chuẩn acid gallic được công bố như với V. jatamansi (12,82 mg GAE/g dw), V. officinalis (14,2 mg GAE/g dw). Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ Trong công trình này, V. hardwickii lần đầu tiên định luợng phenol toàn phần PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU dựa trên acid caffeic. Hàm lượng của chúng trong V. hardwickii trong nghiên cứu này thấp hơn so với loài V. jatamansi (100,44 mg/100 g (trên mặt đất) 2.1. Nguyên liệu và 91,64 mg/100 g (rễ)). - Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại + Về định lượng các flavonoid và acid clorogenic trong lá V. hardwickii bằng Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt và Ngọc Linh, UPLC-PDA Quảng Nam. Thời điểm thu hái 6/2010, 9/2011, 6/2013, 9/2015.
6 19 - Nguyên liệu V. officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Có ba iridoid đã được phân lập trong V. hardwickii và chúng được công bố Vetmeduni – Vienna, Autria. Thu hái vào 6/2012, 4/2015. lần đầu tiên trong cây này, đó là clorovaltrat, isovaleroxyvaltrat hydrin (valtrat hydrin B4) và 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton. Trong đó, 2.2. Phương pháp nghiên cứu hợp chất sau cùng là hợp chất mới lần đầu được phân lập trong tự nhiên. 2.2.1. Phương pháp về thực vật học của V. hardwickii Trong đó có hai hợp chất đã thử nghiệm hoạt tính sinh học trên tế bào là - Khảo sát về hình thái, sinh thái và vi phẫu bằng các kỹ thuật thường quy. isovaleroxyvaltrat hydrin và 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton, hợp - Khảo sát về ADN bằng CTAB và giải trình tự ADN trên gen ITS 5.8 S. rADN, so sánh với các loài cùng chi đã công bố. chất còn lại không thử được do kém tan trong nước. Hợp chất 2.2.2. Phương pháp về hóa học isovaleroxyvaltrat hydrin cho thấy không độc trên tế bào NB N18TG2. - Định tính các thành phần bằng phương pháp hóa học thường quy. Isovaleroxyvaltrat hydrin cũng được phân lập từ V. alliriifolia, V. capense - Phân tích thành phần hóa học bằng sắc ký lớp mỏng, HPLC, phân tích và có tác dụng an thần trên súc vật thử nghiệm. và xác định các thành phần bay hơi bằng vi chưng cất kết hợp với GC- Clorovaltrat là hợp chất tự nhiên có clor và được phân lập lần đầu từ V. MS, GC-FID. officinalis bởi S. Popov và cộng sự vào năm 1974. Sau đó clorovaltrat cùng - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong V. hardwickii bằng với 20 hợp chất khác cũng được Sheng Lin và cộng sự phân lập từ V. các kỹ thuật sắc ký. jatamansi công bố năm 2013. - Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập bằng phương pháp phổ học Clorovaltrat đã đuợc báo cáo có tác dụng độc trên dòng tế bào ung thư phổi (MS, NMR). (lung adenocarcinoma (A 549)), ung thư tuyến tiền liệt (metastatic prostate 2.2.3. Phương pháp về định lượng cancer (PC-3M)), ung thư ruột kết (colon cancer (HCT-8)) và ung thư gan - Định lượng phenol toàn phần: dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. (hepatoma (Bel 7402)) ở mức trung bình với IC50 khoảng 0,89–9,76 M. - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid clorogenic và các Hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) trong V. flavonoid trong V. harwickii bằng UPLC-PDA: Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu, pha động, đường tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. hardwickii là chất lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên và đã được thử nghiệm tác dụng độc tế bào Leukemia, HCT 116 (Human colorectal 2.2.4. Phuơng pháp thử nghiệm tác dụng sinh học carcinoma) 116 và MDA MB 231. Kết quả cho thấy THDN không độc trên - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn chiết trên mô hình DPPH và FRAP . các dòng tế bào trên. Hợp chất có cấu trúc tương tự là jatamin A, jatamin G, - Thử nghiệm độc tế bào trên dòng tế bào Neuroblastoma N18TG2 bằng hexahydro-6-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran- phương pháp PI và resazurin, trên các dòng tế Leukemia, HCT 116 và 1(3H)-on, villosid aglycon. Jatamin A, jatamin G, hexahydro-6-hydroxy-7- MDA MB 231 bằng phương pháp XTT. (hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran-1(3H)-on cũng đã có báo - Thử nghiệm độc tính cấp bằng phương pháp mô tả bởi Đỗ Trung Đàm (1996). cáo trong tài liệu về tác dụng trên dòng tế bào ung thư nguời K562 và HepG2 - Thử nghiệm tác dụng an thần và giải lo âu trên chuột trên các mô hình: và cho thấy không có tác dụng ức chế trên các dòng tế bào này. Mô hình mở, mô hình 2 ngăn sáng tối và bơi gắng sức theo Porsolt Trong công trình này, có bốn flavonoid được phân lập là linarin, (2001). neobudofficid, rhoifolin và neodiosmin. Tất cả chúng đều thuộc nhóm flavon và là các glycosid với các đường là glucose gắn với 1 hay 2 đơn vị rhamnose. Trong các flavonoid này, linarin được thử độc tính tế bào trên dòng tế bào
18 7 italica, V. tuberosa, V. edulis, V. faurei. Patchouli alcol, kessyl acetat, Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU kessanyl acetat là thành phần chính trong nhiều loài thuộc chi Valeriana 3.1. Thực vật học của V. hardwickii nhưng không hiện diện trong cả 2 loài ở nghiên cứu này. Hình thái thực vật của cây đã được mô tả chi tiết, các đặc điểm vi phẫu, bột Về phân lập các hợp chất trong V. hardwickii dược liệu đã được làm sáng tỏ. Việc định danh bằng ADN của V. hardwickii Quá trình phân lập bằng các kỹ thuật khác nhau bao gồm sắc ký cột mở, sắc với mã số định danh KX356086.1 được đăng trên trang pubmed.com là giúp ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký rây phân tử đã phân lập được 11 hợp chất cho các nhà nghiên cưú thực vật có cơ sở dữ liệu để so sánh các loài thuộc tinh khiết. Các hợp chất phân lập bao gồm các terpenoid là sitosterol (483 chi Valeriana. mg) (1), daucosterol (463 mg) (2), acid oleanolic (11 mg) (7), và acid ursolic 3.2. Nghiên cứu hóa học (1,72 g) (8); các irodoid là clorovaltrat (73 mg) (9) và isovaleroxyvaltrat 3.2.1. Phân tích thành phần hóa học hydrin (13 mg) (10), và 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton (730 mg) Kết qủa phân tích sơ bộ cho thấy trong V. hardwickii có các hợp chất (11); các flavoinoid là linarin (480 mg) (3), neobudofficid (52 mg) (4), terpenoid (tinh dầu, triterpen, iridoid…), polyphenol. rhoifolin (86 mg) (5) và neodiosmin (8 mg) (6). Trong các hợp chất phân lập, 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton là hợp chất trong tự nhiên lần Sắc ký lớp mỏng cũng đã được dùng để so sánh với dược liệu V. officinalis, đầu được công bố. Cột silica gel được áp dụng để phân lập các hợp chất kết quả cho thấy có 6 thành phần tương tự nhau và có sự khác nhau bởi 2 terpen như sitosterol, daucosterol, acid oleanolic, acid ursolic, clorovaltrat, thành phần. Phân tích bằng HPLC trong lá V. hardwickii chủ yếu có isovaleroxy valtrat hydrin, 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton và cả polyphenol, trong thân và rễ ngoài polyphenol còn có iridoid. Trong rễ V. flavonoid glycosid như linarin. Sắc ký lỏng dưới áp suất trung bình MPLC officinalis chủ yếu chứa các dẫn chất thuộc acid valerenic là sesquiterpen với pha đảo RP-18 cũng đã được áp dụng để phân lập các flavonoid glycosid với hàm lượng lớn trong khi đó rễ V. hardwickii với thành phần iridoid di- như linarin, rhoifolin và neobudofficid. Sephadex LH-20 đã được dùng để en là thành phần chính. tinh chế các phân đoạn trong cao n-BuOH. Iridoid nepetalacton ít bị phân Phân tích bằng GC cho thấy V. hardwickii, ở rễ, thân, lá có 62, 31, 31 thành hủy bởi nhiệt, iridomyrmecin chịu được 30 phút ở 120 oC. Tuy nhiên, phần được xác định và chiếm 90%, 90% và 92% tổng chất bay hơi được xác valepotriat dễ bị hư bởi nhiệt, ánh sáng, acid hay kiềm. Sản phẩm phân hủy định, theo thứ tự. Ở V. officinalis, trong rễ có 55 thành phần được xác định là các homobaldrinal hay baldrinal, chúng có hóa tính và có thể tạo các chiếm 81,6% của tổng số thành phần bay hơi. polymer. Trong nghiên cứu này, 2 iridoid valepotriat đã phân lập thành công, là 2 hợp chất kém bền, khó phân lập ở điều kiện nhiệt đới. Các terpenoid được nhiều báo cáo trong thành phần của chi Valeriana như sitosterol trong V. officinalis, sitosterol và acid ursolic trong V. officinalis. Ngoài ra, acid ursolic, acid oleanolic là những chất khá thường gặp trong thực vật và cũng được phân lập từ V. laxiflora. Acid oleanolic và acid ursolic đã báo cáo trong tài liệu về tính kháng lao trên M. tuberculosis với MIC 29,7 g/ml (acid oleanolic) và 41,9 g/ml (acid ursolic). Hình 3.43. Săc ký đồ GC so sánh lá V. hardwickii và V. officinalis
8 17 var. arnottiana cũng tồn tại 2 kiểu hóa học của tinh dầu. Kiểu I với thành phần chính là valeracetat, 8-epikessyl glycol diacetat, và -kessyl acetat, kiểu II với thành phần chính maaliol, kessanyl acetat. Thành phần tinh dầu của V. hardwickii trong nghiên cứu này không giống với các kiểu hóa học của V. wallichii và V. hardwickii var. arnottiana nêu trên. Tuy nhiên với maaliol chiếm tỷ lệ lớn, kiểu hóa học của V. hardwickii trong nghiên cứu này gần giống với kiểu I của V. wallichii và kiểu II của V. hardwickii var. arnottiana. Thành phần p-anethol có tỷ lệ lớn trong thân V. hardwickii trong nghiên cứu này chỉ tìm thấy trong thành phần tinh dầu ở rễ và thân rễ của V. Hình 3.43. Săc ký đồ GC so sánh thân V. hardwickii và V. officinalis wallichii nhưng với hàm lượng thấp (0,1-0,4%). Các thành phần dễ bay hơi trong V. officinalis Đối với V. officinalis, trong rễ có 55 thành phần được xác định chiếm 81,6% của tổng số thành phần bay hơi. Trong thân, chưa phát hiện có thành phần bay hơi nào và trong lá, vài thành phần được xác định, đó là acid isovaleric, acid hexanoic và neophytadien. Nghiên cứu này cũng cho thấy các thành phần bay hơi có hàm lượng vuợt trội là camphen, bornyl acetat với monoterpen, valerenal với sesquiterpen, điều này tương tự như những tương tự như các công bố trước đó. Theo tài liệu đã công bố, các thành phần bay hơi trong rễ V. officinalis có 3 kiểu hóa học A, B, và C. V. officinalis trong nghiên cứu này có thành phần tinh dầu không thuộc kiểu A, B, C nêu trên. Hình 3.43. Săc ký đồ GC so sánh rễ V. hardwickii và V. officinalis Tuy nhiên do có valerenal với hàm lượng cao, tinh dầu V. officinalis trong 3.2.2. Phân lập và xác định cấu trúc nghiên cứu này gần giống với kiểu B hơn. Từ V. hardwickii, 11 hợp chất, tất cả lần đầu tiên được phân lập, bao gồm Công trình nghiên cứu phân tích các thành phần bay hơi từ V. hardwickii và các hợp chất -sitosterol, daucosterol, linarin, neobudofficid, rhoifolin, V. officinalis đã được đăng trên tạp chí quốc tế nhằm nâng cao giá trị của neodiosmin, acid oleanolic, acid ursolic, chlorvaltrat, isovaleroxy valtrat dược liệu nước nhà. hydrin và 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton. Trong đó, 6,10,11- So sánh các thành phần dễ bay hơi trong V. hardwickii và V. officinalis trihydroxy dihydronepetalacton là hợp chất mới lần đầu được công bố. Thành phần chính trong cả 2 loài trong nghiên cứu này là acid isovaleric, α- pinen, camphen, borneol, bornyl acetat, α-gurjunen, calaren, maaliol, spathulenol, caryophyllen oxid, valeranon, valerenal, neophytadion và valerenyl acetat, các thành phần nêu trên cũng được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Valeriana như V. hardwickii, V. officinalis, V. celtica, V. wallichii, V. pyrolaefolia, V. himalayana, V. pancicii, V. sisymbriifolia, V.
16 9 Về chương trình nhiệt, nghiên cứu này đã đưa ra chương trình nhiệt tối ưu cho phân tách các hợp chất cho cả hai loài V. hardwickii và V. officinalis. Với chương trình nhiệt này, các thành phần đã được phân tích lên tới 90% tổng lượng các hợp chất có trong tinh dầu. Các thành phần dễ bay hơi trong V. hardwickii Ở V. hardwickii, ở rễ có 64 thành phần trong đó có 60 thành phần có hàm lượng lớn hơn 0,05% và 4 thành phần ở dạng vết được xác định chiếm 89,9% tổng lượng chất bay hơi được xác định. Tương tự, ở thân có 32 thành phần và ở lá cũng có 31 thành phần chiếm tỷ lệ lần lượt là 89,8%, và 91,9% trong tổng lượng hợp chất bay hơi. Trong các tài liệu công bố, rễ V. hardwickii ở Ấn độ có 31 thành phần trong tổng 89,6% và 28 thành phần trong tổng 92,1% thành phần được khảo sát. So với 2 tài liệu trên, rễ loài V. hardwickii ở Việt nam có thành phần đa dạng hơn. Trong luận án này, lần đầu tiên công bố về các thành phần bay hơi từ thân và lá của V. hardwickii. Những thành phần tương tự trong rễ của V. hardwickii trong nghiên cứu này Sơ đồ 2.1. Sơ đô chiết phân bố so với tài liệu bao gồm các monoterpen như -pinen, camphen, borneol, đặc biệt là bornyl acetat là thành phần nổi trội. Các thành phần sesquiterpen cũng có sự tương đồng trong loài V. hardwickii ở Việt nam cũng như Ấn độ đó là gurjunen, cadinen, caryophyllen, ar-curcumen, allo-aromadendren. Trong nghiên cứu này, thành phần acid isovaleric cũng đã được phát hiện và nó có nhiều trong nhiều loài thuộc chi Valeriana, tạo ra mùi đặc trưng cho chi này. Tuy nhiên, thành phần dễ bay hơi này cũng không được phát hiện trong vài nghiên cứu gần đây khi nhiệt độ buồng của GC lúc khởi điểm là 50 oC hay thậm chí cao hơn. Ngoài acid isoaleric là thành phần đáng kể, thành phần trong rễ V. hardwickii trong nghiên cứu này cũng tương đối khác biệt với rễ của 2 loài cùng chi đã công bố, đó là V. hardwickii var. hardwickii với thành phần chính là epoxysesquithujen và V. hardwickii var. arnottiana với thành phần chính là valeracetat và methyl linoleat. Trong nghiên cứu về tinh dầu của V. wallichii ở vùng Tây Bắc Hymalaya cho thấy tồn tại 2 kiểu hóa học (chemotype) của tinh dầu. Trong đó, kiểu I với thành phần chính là Sơ đồ 2.2. Sơ đô phân lập hợp chất 1, 2, 3 các oxysesquiterpen bao gồm maaliol và viridiflorol và kiểu II có thành phần chính là patchouli alcohol, viridiflorol. Tài liệu cũng cho thấy V. hardwickii
10 15 Kết quả giải trình tự gen ITS lần đầu được công bố trên trang dữ liệu Mỹ (www.pubmed.com) với mã nhận diện được cấp là KX356086.1. Việc công bố bản đồ gen ITS là đóng góp mới cho cho cơ sở dữ liệu gen của loài này trong chi Valeriana. Các nhà nghiên cứu dựa trên cơ sở dữ liệu này để so sánh và định danh V. hardwickii. Về phân tích bằng HPLC Kết quả phân tích định tính so sánh dịch chiết V. hardwickii và V. officinalis bằng HPLC (Mục 3.2.1.2) cho thấy lá có chứa thành phần là các dẫn chất thuộc acid clorogenic, các flavonoid và các iridoid di-en. Từ kết qủa phân tích, việc phân lập các hợp chất cũng đã được tiến hành. Kết quả phân lập thu được bốn flavonoid chính là linarin, neobudofficid, rhoifolin và neodiosmin, ba iridoid là clorovaltrat, isovaleroxyvaltrat hydrin, 6,10,11- trihydroxy dihydronepetalacton, bốn terpenoid là -sitosterol, daucosterol, acid oleanolic, acid ursolic. Bên cạnh đó, việc phân tích cho thấy có acid Sơ đồ 2.3. Sơ đô phân lập hợp chất 3,4,5 clorogenic đã giúp cho việc định lượng chúng trong cả hai loài V. hardwickii và V. officinalis. Việc phân tích định bằng HPLC cho thấy các thành phần chính trong rễ ở cả hai loài trên có sự khác nhau. Thành phần trong rễ loài V. hardwickii chủ yếu là valepotriat di-en trong khi đó trong loài V. officinalis chủ yếu chứa các dẫn chất khung valeran như acid hydroxyvalerenic, acid acetoxyvalerenic và acid valerenic. Việc phân tích định, tính định lượng các iridoid valepotriat cũng đã được báo cáo với việc dùng HPLC Về phân tích bằng GC Có nhiều phương pháp chuẩn bị mẫu trong phân tích tinh dầu như chưng cất lôi cuốn theo hơi nước, phương pháp chiết bằng dung môi, phương pháp ép, Sơ đồ 2.4. Sơ đô phân lập hợp chất 6 và 11 phương pháp ướp, lấy mẫu trực tiếp từ cơ quan tiết, vi chưng cất hay headspace... Trong nghiên cứu này, phương pháp vi chưng cất được dùng để chiết tinh dầu từ hai loaì V. hardwickii và V. officinalis. Phương pháp này có ưu điểm là dùng lượng nhỏ nguyên liệu từ vài chục mg đến 3 g và bẫy với một lượng ít dung môi (0,3 ml hexan).
14 11 officinalis lần lượt là 1,84; 0,97; 3,43 mg Trolox/g mẫu. Mô hình FRAP trên trên rễ; thân, lá V. hardwickii lần lượt là 1,12; 0,69; 1,87 mg Trolox/g mẫu. 3.4.2. Tác dụng độc tế bào Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin không độc trên dòng tế bào Neuroblastoma N18TG2 với nồng độ 0,01; 0,1; 1 và 10 g/ml. Hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) được thử độc tính trên 3 dòng tế bào MDA-MB 231, HCT 116 và Leukemia, kết quả cho thấy THDN không độc trên các dòng tế bào nêu trên với nồng độ 5 g/ml và 50 g/ml. 3.4.3. Độc tính cấp, tác dụng an thần và giải lo âu Các cao chiết nước, cao chiết EtOH 45% và cao DCM của V. hardwickii không gây độc tính cấp trên chuột với liều Cao DCM, cao EtOH 45% và cao nước lần lượt là 5 000; 11900 và 14640 mg/kg chuột. Kết quả thử nghiệm Sơ đồ 2.5. Sơ đô phân lập hợp chất 7 và 8 các cao trên mô hình môi trường mở, hai ngăn sáng tối và bơi gắng sức đã cho thấy các cao chiết có tác dụng an thần, giải lo âu trên chuột với liều 1/10 và 1/20 liều thử độc tính cấp. BÀN LUẬN Chi Valeriana có nhiều loài được dùng làm thuốc phổ biến ở châu Âu như V. officinalis, ở Trung quốc, Ấn độ như V. jatamansi, hay ở Nhật như V. faurei và nhiều nước khác. Về thực vật học Đã có nhiều nghiên cứu về thực vật học, hóa học và tác dụng dược lý của các loài này trên thế giới. Ở Việt nam, loài V. hardwickii ít được biết và gần như chưa có báo cáo về cây thuốc này. Việc nghiên cứu về thực vật học, hóa học và tác dụng sinh học của duợc liệu này và các hợp chất phân lập được là điều hết sức cần thiết nhằm đóng góp các thông tin và góp phần chứng minh tác dụng của nó. Nghiên cứu này giúp nâng cao giá trị của nguồn dược liệu này trong kho tàng dược liệu nước nhà. Những công bố trong nước và quốc tế của nghiên cứu này là nguồn tham khảo cho những công trình nghiên cứu Sơ đồ 2.6. Sơ đô phân lập hợp chất 9 và 10 tiếp theo và các bài tổng quan các nghiên cứu về Nữ lang V. hardwickii cũng như chi Valeriana.
12 13 3.2.2.1. Hợp chất 1: Sitosterol. Hợp chất 2: Daucosterol 3.2.2.4. Hợp chất 9: Chlorvaltrat. Hợp chất 10: Isovaleroxyvaltrat hydrin. Hợp chất 11: 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton O 1''' H O H 11 H O H 1'' 4 7 6 5 O 9 1 8 O H 10 H H OH O R 1' 3' R=Cl: Clorvaltrat O R=Isovaleryl: Isovaleroxy valtrat hydrin 3.2.2.2. Hợp chất 3: Linarin, hợp chất 4: Neobudofficid, hợp chất 5: Rhoifolin, hợp chất 6: Neodiosmin 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton 3.3. Định lượng các thành phần - Kết quả định lượng phenol toàn phần trong lá, thân và rễ của V. hardwickii tương ứng là 24,3; 17,4; 18,4 mg acid caffeic/g, trong lá, thân và rễ của V. officinalis tương ứng là 43,1; 16,0; 23,4 mg /g. - Định lượng đồng thời linarin, rhoifolin, neobudofficid và acid clorogenic bằng UPLC-PDA với khoảng tuyến tính (R2 > 0,999; 0,05-120 gml), độ lặp lại (RSD < 2%), độ đúng đạt 90 – 107%. Hàm lượng acid 3.2.2.3. Hợp chất 7: Acid oleanolic. Hợp chất 8: Acid ursolic clorogenic, rhoifolin, neobudofficid và linarin trong mẫu lá V. hardwickii 29 30 lần lượt là 1,24; 0,69; 0,05; và 1,26%. Hàm luợng acid clorogenic trong thân và rễ V. hardwickii lần lượt là 5,1% và 0,45%; trong lá và rễ V. 19 20 21 officinalis lần lượt là 0,44% và 0,66%. 12 18 22 13 25 11 26 17 3.4. Thử nghiệm tác dụng sinh học COOH 1 3.4.1. Tác dụng chống oxy hóa 9 14 28 2 16 10 Mô hình DPPH trên rễ, thân, lá V. officinalis là 15,76; 10,25 và 30,85 mg 8 15 3 27 7 HO 4 5 6 Trolox/g mẫu. Mô hình DPPH trên rễ, thân, và lá V. hardwickii lần lượt là 23 24 9,11; 6,53 và 13,71 mg Trolox/g mẫu. Mô hình FRAP trên rễ; thân, lá V. Acid oleanolic Acid ursolic