Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài" được nghiên cứu với mục tiêu: Đánh giá biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột theo thời gian bôi Imiquimod; Khảo sát sự cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thực nghiệm điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------------- TRẦN THỊ THÚY PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ĐIỀU TRỊ THƯƠNG TỔN DA GIỐNG VẢY NẾN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT BẰNG GHÉP TẾ BÀO GỐC TỪ MÔ MỠ CÙNG LOÀI Ngành: Nội khoa Mã số: 9720107 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP. Hồ Chí Minh, năm 2024
Công trình được hoàn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Văn Thế Trung PGS. TS. Lê Thái Vân Thanh Phản biện 1: ............................................................................. Phản biện 2: ............................................................................. Phản biện 3: ............................................................................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP. HCM
1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Lý do và tính cần thiết của nghiên cứu Vảy nến là một bệnh da do viêm mạn tính, ảnh hưởng 2% - 3% dân số toàn thế giới. Hiện nay, nhiều bằng chứng cho thấy trục IL-23/IL-17 đóng vai trò chính trong sinh bệnh học của bệnh. Bệnh gây tổn thương ở da, móng, gây phá hủy khớp và liên quan đến nhiều bệnh đồng mắc, tác động xấu đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và hiện vẫn chưa có phương pháp điều trị hiệu quả lâu dài. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSC) là những tế bào có thể được phân lập từ tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ…, đã được chứng minh có khả năng ức chế tăng sinh, biệt hóa tế bào T CD4+, ức chế trưởng thành tế bào tua gai và tạo điều kiện biệt hóa tế bào T điều hòa. Vì thế, MSC đã được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị nhiều mô hình bệnh lý miễn dịch do tính điều hoà miễn dịch của chúng, trong đó có vảy nến. Trong số các nguồn thu MSC, mô mỡ là nơi có nguồn tế bào gốc dồi dào, việc thu nhận mô mỡ dễ dàng, ít xâm lấn cho người bệnh, cũng như sẵn có khi sử dụng trong ghép đồng loài. Ngoài ra, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (ADSC) có tốc độ tăng sinh cao và ổn định về mặt di truyền. Bên cạnh đó, ADSC cũng được chứng minh là có khả năng tiết ra một lượng lớn các cytokine, yếu tố tăng trưởng ưu việt hơn các nguồn mô khác. Do đó, ADSC trở thành một trong những lựa chọn thu hút nhiều nghiên cứu trong các liệu pháp trị liệu tế bào nói chung hay các trị liệu tế bào
2 dành cho vảy nến nói riêng hiện nay. Theo hiểu biết của chúng tôi, hiện nay có không nhiều các nghiên cứu đánh giá hiệu quả của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong điều trị vảy nến trên thế giới. Một vài nghiên cứu đã thực hiện nhưng chưa so sánh được hiệu quả của các liều tế bào gốc khác nhau và các đường ghép khác nhau. Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá về vấn đề này. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài đánh giá hiệu quả điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc từ mô mỡ cùng loài với các liều tế bào ghép khác nhau và thông qua các đường ghép khác nhau. Mục tiêu nghiên cứu 1. Đánh giá biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột theo thời gian bôi Imiquimod 2. Khảo sát sự cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài Đối tượng và phương pháp nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Chuột BALB/c đực và cái, 8 tuần tuổi, nặng 20-24 gram và tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột BALB/c. - Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiền lâm sàng, can thiệp ngẫu nhiên có đối chứng Những đóng góp mới của nghiên cứu về mặt lý luận và thực tiễn Nghiên cứu đã đánh giá được sự thay đổi theo thời gian bôi Imiquimod của các đặc điểm về thương tổn da, mô bệnh học và
3 biểu hiện cytokine trên da chuột được tạo mô hình vảy nến bằng bôi Imiquimod. Từ đó xác định được thời gian bôi Imiquimod tối ưu nhất khi tạo mô hình mô phỏng vảy nến trên chuột. Đồng thời, xác định các mốc thời gian phù hợp cho can thiệp và đánh giá hiệu quả của điều trị khi sử dụng mô hình này trong nghiên cứu. Nghiên cứu đã chứng minh được ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ cùng loài với các liều lượng và các đường ghép khác nhau giúp cải thiện thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột về mặt biểu hiện da, mô bệnh học và sự thâm nhiễm các cytokine trong da. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu lâm sàng trong tương lai nhằm nghiên cứu sâu hơn về tác động của tế bào gốc trung mô trong vảy nến và ứng dụng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong điều trị vảy nến. Bố cục của luận án Luận án gồm 148 trang với các phần: Đặt vấn đề: 02 trang; Tổng quan tài liệu: 32 trang; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 24 trang; Kết quả: 63 trang; Bàn luận: 25 trang; Kết luận và Kiến nghị: 02 trang. Luận án có 27 hình, 7 bảng, 17 biểu đồ, 01 sơ đồ và 242 tài liệu tham khảo tiếng Anh và 5 tài liệu tham khảo tiếng Việt.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vảy nến Dịch tễ Hiện nay, ước tính có 125 triệu người mắc vảy nến trên toàn thế giới và tỷ lệ hiện mắc thay đổi từ 0,5% đến 3%. Tỷ lệ nam và nữ mắc bệnh ngang nhau. Cơ chế bệnh sinh Cơ chế bệnh sinh của vảy nến phức tạp với sự tham gia của nhiều yếu tố, hiện tại vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Dưới tác động của các yếu tố khởi phát từ môi trường, các cá thể mang gien nhạy cảm sẽ khởi phát bệnh. Các tế bào tua gai lớp bì được hoạt hóa, trình diện kháng nguyên với tế bào T ngây thơ và thông qua việc tiết IL-12 và IL-23 sẽ kích thích biệt hóa T ngây thơ thành tế bào Th1, Th17, và Th22. Các tế bào này sau đó tiết ra IL-17A, IL-22, TNF-a. Các tế bào và các interleukin này được thu hút bởi các chemokines từ tế bào tạo sừng theo bạch huyết và mạch máu đến lớp bì thúc đẩy quá trình miễn dịch tạo thương tổn vảy nến. Trong đó vai trò chính được cho là do trục IL-23/IL-17. Biểu hiện thương tổn da vảy nến Tổn thương da điển hình của vảy nến là mảng hồng ban, giới hạn rõ, bề mặt tróc vảy trắng, thường phân bố đối xứng. Độ nặng của thương tổn vảy nến được đánh giá bằng chỉ số PASI (Psoriasis area severity index). Đây là điểm số tích luỹ cho mức độ hồng ban, tróc vảy, dày da tính theo diện tích bề mặt cơ thể bị ảnh hưởng. Mô bệnh học thương tổn vảy nến đặc trưng bởi sự tăng số
5 lượng các mao mạch xoắn, phù nhú bì, kèm thâm nhiễm tế bào lympho, đại thực bào, bạch cầu đa nhân trung tính ở lớp bì. Thượng bì có hiện tượng tăng sừng, tăng sản dạng vảy nến. Lớp hạt biến mất, hiện tượng á sừng đi kèm tích tụ bạch cầu đa nhân trung tính tạo nên vi áp xe Munro. Điều trị vảy nến Cho đến nay, các thuốc bôi tại chỗ và các điều trị hệ thống cổ điển đều không ngăn ngừa được diễn tiến của vảy nến và có thể để lại các tác dụng phụ nghiêm trọng trên bệnh nhân. Gần đây, các điều trị sinh học như các thuốc ức chế TNF-a, IL-17A và IL- 23 tỏ ra có hiệu quả cao cải thiện thương tổn vảy nến tuy nhiên đây cũng là các thuốc ức chế miễn dịch nên một số bệnh nhân trước nguy cơ gia tăng khả năng nhiễm trùng nghiêm trọng và bùng phát các nhiễm trùng tiềm ẩn. Người bệnh phải chi trả một chi phí cao trong thời dài nhằm duy trì điều trị và đáp ứng ở bệnh nhân cũng thay đổi. Một số người có thể không đáp ứng hoặc phổ biến hơn là có đáp ứng ban đầu nhưng sau đó mất đi đáp ứng, có thể do sinh kháng thể kháng thuốc. 1.2. Mô hình vảy nến trên chuột Hiện nay, các mô hình mô phỏng vảy nến ở chuột gồm có mô hình tự phát, biến đổi gien, cấy ghép dị loài và cảm ứng trực tiếp. Trong đó, mô hình thuận tiện và được ứng dụng nhiều nhất là mô hình cảm ứng trực tiếp bằng bôi IMQ. Mô hình này được xây dựng trên chuột bôi kem IMQ 5%. Mô hình này mô phỏng được thương tổn da giống vảy nến thông qua một số cơ chế trong đó cơ chế chính là thông qua con đường IL-23/IL-17.
6 1.3. Tổng quan về tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Tế bào gốc trung mô (MSC) là những tế bào gốc trưởng thành, đa năng của cơ thể. Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Trị liệu Tế bào Quốc tế năm 2006, MSC phải bám dính vào bề mặt nuôi cấy, có khả năng biệt hóa đa dạng thành ba dòng trung mô chính invitro (xương, mỡ và sụn), và biểu hiện các dấu ấn bề mặt đặc trưng. MSC hiện nay có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác như mô mỡ, dịch ối, cuống rốn, nhau thai, máu kinh và tủy răng. Trong đó, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (ADSC) có thể được dễ dàng thu nhận từ nguồn mô mỡ dồi dào, ít xâm lấn cho người bệnh, cũng như sẵn có khi sử dụng trong ghép đồng loài. Ngoài ra, ADSC có tốc độ tăng sinh cao và ổn định về mặt di truyền. Bên cạnh đó, ADSC cũng được chứng minh là có khả năng tiết ra một lượng lớn các cytokine, yếu tố tăng trưởng ưu việt hơn tế bào gốc trung mô từ các nguồn mô khác. ADSC có tính sinh miễn dịch thấp vì biểu hiện ở mức độ thấp các kháng nguyên MHC loại I, không biểu hiện MHC loại II. MSC có khả năng điều hòa miễn dịch thông qua tương tác trực tiếp với các tế bào hoặc gián tiếp qua cơ chế cận tiết. MSC nuôi cấy cùng với tế bào T CD4+ làm ức chế tăng sinh tế bào T, kích hoạt con đường Notch1/FOXP3 và tăng tỷ lệ tế bào T điều hoà. MSC ức chế sự biệt hóa của tế bào T giúp đỡ 17 (Th17) bằng cách tạo ra IL-10, PGE2 và ức chế tạo IL-17, IL-22 và IFN-γ. Do đó, ADSC đã được nghiên cứu trong điều trị các bệnh lý trên mô hình chuột như viêm ruột mạn tính, lupus ban đỏ hệ thống, viêm não tuỷ tự miễn.
7 1.4. Các nghiên cứu ứng dụng MSC trong điều trị vảy nến 1.4.1. Nghiên cứu ngoài nước Hiện nay theo hiểu biết của chúng tôi, trên thế giới chỉ có hai nghiên cứu đánh giá hiệu quả của ghép ADSC trong điều trị vảy nến trên mô hình chuột nhưng các nghiên cứu này không so sánh hiệu quả giữa các mức liều khác nhau và đường ghép khác nhau. Tác giả Rokunohe dùng ADSC tiêm dưới da vào ngày 0, 2, 4. Khi đó ADSC ức chế sự phát triển của thương tổn giống vảy nến, giảm IL-17 và IL-23 trong máu chuột. Tác giả Shi đã sử dụng 106 tế bào ADSC tiêm dưới da vào ngày 1 và 4. ADSC trong nghiên cứu này ức chế sự phát triển thương tổn da giống vảy nến và làm giảm IL-6 và IL-17 ở da chuột. Với thời điểm tiêm là ngày 0 hay ngày 1, các nghiên cứu này đánh giá tác động phòng ngừa xuất hiện thương tổn vảy nến hơn là điều trị thương tổn vảy nến. Bên cạnh đó, ADSC cũng đã được sử dụng trên người thông qua các báo cáo trường hợp. Tác giả Yoon báo cáo 2 trường hợp bệnh nhân có vảy nến mảng điều trị bằng ADSC. Triệu chứng giảm đáng kể và không tái phát trong 3 năm theo dõi. Tác giả Miguel cũng báo cáo về hai trường hợp sử dụng ADSC tự thân trong điều trị vảy nến thông thường và vảy nến khớp. Kết quả cho thấy độ nặng của vảy nến giảm trên bệnh nhân trước đó bị lệ thuộc methotrexate. 1.4.2. Nghiên cứu trong nước Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả của ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ cùng loài trong điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình động vật và trên người.
8 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu tiền lâm sàng, can thiệp ngẫu nhiên có đối chứng 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: Từ tháng 9 năm 2019 đến tháng 5 năm 2024 - Địa điểm: Viện Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3. Đối tượng nghiên cứu - Chuột BALB/c đực và cái, 8 tuần tuổi, cân nặng 20-24 gram - Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột 2.4. Cỡ mẫu: v Mục tiêu 1: 90 chuột (30 con/lô x 3 lô) o Lô bình thường: chuột khoẻ mạnh o Lô IMQ 6N: chuột bôi IMQ trong 6 ngày o Lô IMQ 12N: chuột bôi IMQ trong 12 ngày v Mục tiêu 2.1: Định danh ADSC được phân lập sử dụng trong nghiên cứu - Biệt hoá xương, sụn, mỡ : Mỗi thí nghiệm biệt hoá được lặp lại 3 lần nghiệm thức sau, mỗi lô 3 giếng o Lô 1: ADSC nuôi trong môi trường nuôi ADSC o Lô 2: ADSC nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hoá - Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt tế bào: lặp lại 3 lần v Mục tiêu 2.2: 240 chuột (30 con/lô x 8 lô) o Lô Bình thường: chuột khoẻ mạnh o Lô IMQ: chuột bôi IMQ
9 o Lô IMQ+TCS: chuột bôi IMQ + corticosteroid bôi o Lô IMQ+PBS: chuột bôi IMQ + tiêm dưới da 200 µL PBS o Lô IMQ+ADSC 106: chuột bôi IMQ + tiêm dưới da ADSC với liều 106 tế bào/con/lần o Lô IMQ+ADSC 2,5 x 106: chuột bôi IMQ + tiêm dưới da ADSC với liều 2,5 x 106 tế bào/con/lần o Lô IMQ+PBS IV: chuột bôi IMQ + tiêm tĩnh mạch đuôi 200 µL PBS o Lô IMQ+ADSC 2,5 x 106 IV: chuột bôi IMQ + tiêm tĩnh mạch đuôi ADSC với liều 2,5 x 106 tế bào/con/lần 2.5. Các biến số chính và phương pháp đo lường 1. Biểu hiện thương tổn da và điểm số độ nặng: Ghi nhận mỗi 24 giờ. Đánh giá thực hiện bởi nghiên cứu viên và một bác sĩ da liễu khác. o Điểm số độ nặng (điểm): xác định thông qua đánh giá thương tổn da lưng chuột dựa trên thang điểm tương tự thang điểm PASI về hồng ban, tróc vảy, độ dày da. Thang điểm từ 0 tới 4: 0, không có thương tổn; 1, nhẹ; 2, trung bình; 3, nặng; 4, rất nặng. Tổng điểm của 3 thành phần này được tính là độ nặng của thương tổn (dao động từ 0 – 12). 2. Mẫu da chuột sau thu nhận được gửi cắt lát mô, nhuộm H&E và chụp hình bằng kính hiển vi với phần mềm Axiovision, đo độ dày thượng bì và đánh giá điểm số mô bệnh học vảy nến PHS trên hình chụp. Với mỗi mẫu, tiến hành đo độ dày thượng bì trên 3 lam; trên mỗi lam, chọn ra 3 vùng ngẫu nhiên, tiến hành đo độ dày thượng bì trên 3 vị trí ngẫu nhiên
10 tại mỗi vùng. Các đánh giá được xác nhận lại bởi bác sĩ giải phẫu bệnh tại Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh o Độ dày thượng bì (µm): được xác định bằng khoảng cách từ lớp tế bào sừng đầu tiên tới lớp tế bào đáy trên mẫu da sinh thiết nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E). o Đặc điểm mô học: gồm các đặc điểm § Hiện tượng á sừng: các tế bào lớp sừng còn nhân § Tăng sản thượng bì dạng vảy nến: tăng độ dày thượng bì, mào thượng bì kéo dài. § Vi áp xe Munro: thấm nhập bạch cầu đa nhân trung tính trong lớp sừng § Thâm nhiễm tế bào viêm trong lớp bì: thấm nhập tế bào neutrophil và lymphocyte trong lớp bì nông § Mạch máu xuất hiện ở đỉnh nhú bì o Điểm số mô bệnh học (Psoriasis Histopathology Score – PHS) được tính là tổng điểm các thành phần sau: sự xâm nhập của tế bào viêm, á sừng, tăng sản thượng bì dạng vảy nến, độ dày của thượng bì và áp xe Munro, với thang điểm từ 0 đến 3: 0 = không có, 1 = nhẹ, 2 = trung bình, 3 = nặng 3. Mức độ biểu hiện IL-17A, IL-23 trong da trên mẫu nhuộm miễn dịch huỳnh quang (IF): được đánh giá định tính bằng hình ảnh phát quang trên mẫu nhuộm và định lượng tương đối bằng mức độ phát huỳnh quang (CTCF). 4. Mức độ biểu hiện mARN của IL-17 và Il-23 trong mẫu da: được đánh giá định lượng so với mARN của gien GAPDH thông qua công thức Livak
11 5. Tình trạng sức khoẻ của chuột sau tiêm ADSC: được đánh giá mỗi 24 giờ bởi nghiên cứu viên và xác nhận bởi kỹ thuật viên quản lý động vật. o Diện mạo bên ngoài của chuột: tình trạng xù lông của chuột o Trạng thái hoạt động của chuột: Chuột bình thường hoặc giảm hoạt động o Tình trạng sống chết của chuột o Sưng nề vị trí tiêm: vùng có biểu hiện sưng, gồ cao, phù nề 2.6. Các bước tiến hành nghiên cứu 2.6.1. Đánh giá biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột theo thời gian bôi IMQ - Bôi kem IMQ 5% 62,5 mg (3,125 mg hoạt chất) mỗi ngày ở vùng lưng cạo lông (2x3 cm2) trong 6 ngày liên tục với nhóm IMQ6N hoặc 12 ngày liên tục với nhóm IMQ12N - Chuột được đánh giá các chỉ tiêu theo bảng tóm tắt sau, các mốc thời gian được xác định dựa trên kết quả nghiên cứu pilot Bảng 2.1 Bảng theo dõi đánh giá tạo mô hình vảy nến Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 18 24 PASI + + + + + + + (n=30) H&E (n=5) + + + + + RT-PCR + + + (n=5) IF (n=5) + + 2.6.2. Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột theo quy trình đã thiết lập
12 Thu thập mô mỡ chuột từ vùng bụng, sinh dục, nuôi cấy và đánh giá hình dạng tế bào, khả năng biệt hoá và các dấu ấn bề mặt tế bào theo quy trình đã được công bố. 2.6.3. Đánh giá hiệu quả của tiêm tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trong điều trị thương tổn da giống vảy nến trên mô hình chuột Chuột được chia làm 8 lô, mỗi lô 30 con, theo dõi và đánh giá các chỉ tiêu theo bảng tóm tắt sau Bảng 2.2 Bảng theo dõi đánh giá ghép mADSC Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bôi IMQ + + + + + + Bôi TCS + + + Tiêm ADSC/PBS + PASI (n=30) + + + + H&E (n=5) + + RT-PCR (n=5) + + IF (n=5) + + Các mốc thời gian được chọn dựa trên kết quả của mục tiêu 1 2.7. Phương pháp phân tích thống kê - Số liệu được nhập mã hóa và xử lí bằng phần mềm SPSS 20.0 và Prism Graphpad 9.5.1 - Sự khác biệt được xem có ý nghĩa thống kê khi p ≤0,05 với độ tin cậy 95%. 2.8. Y Đức: Nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu trên động vật quyết định số 210105/SCI-AEC (22/01/2021) và 220102/SCI-ACE (05/01/2022).
13 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Biểu hiện da và cytokine ở thương tổn da giống vảy nến của chuột theo thời gian bôi Imiquimod Hình 3.1 Biểu hiện da lưng chuột theo thời gian bôi IMQ Ở nhóm bôi IMQ 6 ngày, biểu hiện da giống vảy nến trên mô hình chuột xuất hiện vào ngày 3. Biểu hiện này điển hình nhất vào ngày 6 với mảng hồng ban màu đỏ tươi, không tẩm nhuận, bề mặt có nhiều vảy trắng, khô, dễ tróc thành mảng, da dày, điểm số độ nặng PASI đạt cực đại. Biểu hiện trên mô học của thương tổn da vào ngày 6 cũng đặc trưng cho vảy nến với hình ảnh tăng sản thượng bì dạng vảy nến, mào thượng bì kéo dài vào lớp bì, tăng sừng, á sừng, vi áp xe Munro, trong lớp bì có thâm nhiễm tế bào viêm mức độ nhiều, tăng sinh mạch máu ở đỉnh nhú bì, độ dày thượng bì và điểm số mô bệnh học tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chuột bình thường. Sau đó, các biểu hiện này giảm dần nếu ngưng bôi IMQ rồi trở về bình thường vào ngày 24.
14 Nếu kéo dài thời gian bôi IMQ đến 12 ngày ở nhóm IMQ12N, các biểu hiện da, độ nặng thương tổn, biểu hiện mô học của thương tổn da giống vảy nến trên chuột giảm nhẹ vào ngày 12. Ngày 24, da chuột trở về bình thường ngoại trừ chỉ số độ dày da. Về biểu hiện IL-17 và IL-23 tại thương tổn, sự biểu hiện mARN của 2 interleukin này tăng dần từ ngày 3 đến ngày 6 sau bôi IMQ, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường. Đến ngày 12, biểu hiện mARN IL-17A và IL-23 giảm dần ở cả nhóm tiếp tục bôi IMQ và nhóm ngưng bôi IMQ, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chuột bình thường. Tương tự, trên mẫu da nhuộm IF vào ngày 6, có sự thâm nhiễm mức độ nhiều IL-23 ở cả lớp bì và thượng bì, IL-17 thâm nhiễm mức độ nhiều ở lớp bì và mức độ vừa ở lớp thượng bì. Vào ngày thứ 12, biểu hiện IL-17 và IL-23 giảm đáng kể ở cả lớp bì và thượng bì, dù có tiếp tục bôi IMQ hay đã ngừng IMQ từ ngày 6. 3.2. Hiệu quả cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài 3.2.1. Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột được phân lập sử dụng trong nghiên cứu Trong quá trình nuôi cấy từ thế hệ 0 đến thế hệ 7, mADSC trong nghiên cứu của chúng tôi thể hiện đặc tính bám dính trên bề mặt nhựa của bình nuôi cấy, hình thoi thuôn dài ở hai đầu, ở giữa phình to chứa nhân. Các tế bào này có tỉ lệ dương tính cao với các dấu ấn bề mặt CD44 (99,5%), CD73 (94,40%), dương tính thấp với CD90 (7,2%), trong khi âm tính với tỉ lệ rất thấp
15 CD45 (0,1%), CD34 (0,02%), CD19 (4,2%), CD105 (0,05%). Đồng thời, cũng có khả năng biệt hoá thành tế bào xương, tế bào sụn và tế bào mỡ trong môi trường nuôi chọn lọc. 3.2.2. Hiệu quả cải thiện thương tổn da giống vảy nến do cảm ứng với Imiquimod trên mô hình chuột bằng ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ đồng loài 3.2.2.1. Tác động của tiêm ADSC dưới da với các liều tế bào khác nhau Hình 3.2 Biểu hiện da lưng chuột theo thời gian trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC dưới da Vào ngày 6, nhóm điều trị với tiêm ADSC dưới da giảm biểu hiện hồng ban tróc vảy so với nhóm IMQ và IMQ+PBS. Da lưng chuột biểu hiện mảng hồng ban đỏ nhẹ, tróc vảy nhẹ, mịn, trắng rải rác ở nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106. So với nhóm này, mức độ cải thiện hồng ban, tróc vảy ở nhóm IMQ+ADSC 106 ít hơn. Điểm số PASI của 2 nhóm điều trị với ADSC là IMQ+ADSC 106 và nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 thấp hơn có ý nghĩa thống kê so
16 với nhóm mô hình IMQ và nhóm điều trị bằng giả dược IMQ+PBS. Về mô học, ở nhóm IMQ+ADSC 106, các hiện tượng tăng sừng, á sừng ở lớp thượng bì và sự thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp bì được cải thiện so với nhóm IMQ và IMQ+PBS. Tuy nhiên, rải rác trên lớp thượng bì vẫn còn hình hình ảnh á sừng và tăng sản thượng bì, rải rác các mạch máu giãn ở đỉnh nhú bì. Trong khi đó, nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 có biểu hiện tăng sừng nhẹ và không có hiện tượng á sừng, vi áp xe Munro, giảm rõ rệt hiện tượng tăng sản thượng bì, mật độ thâm nhiễm tế bào viêm và giãn mạch máu ở lớp bì ít hơn đáng kể so với nhóm IMQ và IMQ+PBS. Nhóm điều trị với điều trị chuẩn là corticosteroid bôi IMQ+TCS cũng giảm đáng kể biểu hiện vảy và hồng ban so với các nhóm IMQ và IMQ+PBS, tuy nhiên da mỏng và có nhiều mao mạch giãn trên biểu hiện đại thể và mô học. Vào ngày 6, mức độ biểu hiện gien và protein của IL-17A và IL-23 ở các nhóm điều trị với ADSC và với TCS đều thấp hơn ở nhóm không điều trị và nhóm điều trị với giả dược. Hình ảnh nhuộm IF của nhóm IMQ+TCS, IMQ+ADSC 106 và IMQ+ADSC 2,5 x 106 cho thấy IL-17A và IL-23 biểu hiện thấp ở lớp bì và không biểu hiện ở lớp thượng bì. Sự biểu hiện này ở nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 tương tự như nhóm IMQ+TCS và thấp hơn so với nhóm IMQ+ADSC 106. Ngày 12 của thí nghiệm, hồng ban, tróc vảy ở các nhóm chuột giảm đáng kể ở tất cả các nhóm, chỉ còn tróc vảy rất nhẹ ở các nhóm gồm IMQ, IMQ+PBS và IMQ+ADSC 106. Nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 có da trơn láng, không còn hồng ban và
17 tróc vảy. Các biểu hiện mô học đặc trưng của vảy nến biến mất dần. Mức độ biểu hiện của IL-17A và IL-23 trên da hầu như tương tự nhau ở các nhóm chuột với sự biểu hiện nhẹ ở lớp bì và không biểu hiện ở lớp thượng bì. Đa số chuột tiêm ADSC hoặc PBS dưới da đều có hiện tượng phù nề nhẹ ở vùng da lưng sau tiêm, hết hẳn sau 24 giờ. 100% chuột ở các nhóm sống, khoẻ mạnh đến hết 12 ngày theo dõi. 3.2.2.2. Tác động của tiêm ADSC đường tĩnh mạch Vào ngày 6, nhóm điều trị với tiêm ADSC đường tĩnh mạch giảm biểu hiện hồng ban tróc vảy so với nhóm IMQ và IMQ+PBS IV. Da lưng chuột biểu hiện mảng hồng ban đỏ nhẹ, tróc vảy nhẹ, mịn, trắng rải rác ở nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 IV. Điểm số PASI của nhóm điều trị với ADSC đường tiêm tĩnh mạch thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm mô hình và nhóm điều trị bằng giả dược. Nhóm điều trị với corticosteroid bôi cũng giảm đáng kể biểu hiện da giống vảy nến so với các nhóm IMQ và IMQ+PBS IV, tuy nhiên da mỏng và có nhiều mao mạch giãn. Nhóm IMQ+ADSC 2,5 x 106 IV sau 6 ngày bôi có biểu hiện mô học tăng sừng nhẹ và không có hiện tượng á sừng, các tế bào sừng không còn nhân, không có các vùng vi áp xe Munro, giảm rõ rệt hiện tượng tăng sản thượng bì. Mật độ thâm nhiễm tế bào viêm và giãn mạch máu ở lớp bì ít hơn đáng kể so với nhóm mô hình IMQ và nhóm điều trị bằng giả dược IMQ+PBS IV. Ngày 12, hồng ban, tróc vảy ở các nhóm chuột giảm đáng kể, chỉ còn tróc vảy rất nhẹ ở nhóm IMQ. Nhóm chuột IMQ+TCS da giảm mỏng hơn so với mốc ngày 6. Ở tất cả các nhóm chuột, các
18 biểu hiện mô học đặc trưng của vảy nến biến mất. Mức độ biểu hiện IL-17A và IL-23 trên da cũng tương ứng với biểu hiện da và mô học ở các nhóm chuột. Ở tất cả nhóm chuột tiêm ADSC và PBS tĩnh mạch, chuột không có hiện tượng xù lông, giảm hoạt động hay phù nề vùng tiêm. 100% chuột ở các nhóm này sống, khoẻ mạnh đến hết 12 ngày theo dõi. Hình 3.3 Biểu hiện da lưng chuột theo thời gian trong thí nghiệm đánh giá tác động của tiêm ADSC tĩnh mạch 3.2.2.3. So sánh tác động của tiêm ADSC dưới da và tiêm ADSC đường tĩnh mạch Hiệu quả cải thiện biểu hiện da, độ nặng thương tổn, bất thường trên mô học, điểm số mô bệnh học trên thương tổn da giống vảy nến và sự biểu hiện mARN IL-17A và IL-23 hay mức độ thâm nhiễm IL-17A và IL-23 trên da ở mẫu nhuộm miễn dịch huỳnh quang tương tự nhau khi sử dụng ADSC tiêm dưới da và tiêm tĩnh mạch với cùng liều tiêm 2,5 x 106 tế bào/con/lần tiêm.