Tóm tắt Luận án tiến sĩ Y học: Thực trạng nhiễm vi nấm, Aflatoxin trong một số mẫu thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc của cán bộ y tế tại tỉnh Nghệ An, hiệu quả can thiệp (2016 – 2017)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

52
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là xác định tỷ lệ nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược tại một số bệnh viện tỉnh Nghệ An năm 2016. Mô tả thực trạng về môi trường, trang thiết bị bảo quản thuốc và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dược của các cán bộ y tế tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An. Đánh giá hiệu quả can thiệp phòng chống vi nấm cho thuốc đông dược.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Y học: Thực trạng nhiễm vi nấm, Aflatoxin trong một số mẫu thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc của cán bộ y tế tại tỉnh Nghệ An, hiệu quả can thiệp (2016 – 2017)

O Ụ V OT O T V ỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - ÔN TRÙN TRUN ƢƠN THỰ TR N NH ỄM V NẤM, AFLATOX N TRON M T SỐ MẪU THUỐ ÔN ƢỢ V K N THỨ , TH , THỰ H NH ẢO QUẢN THUỐ ỦA N T T TỈNH N HỆ AN, H ỆU QUẢ AN TH ỆP (2016 – 2017) hu n ng nh ịch tễ học M số 972 01 17 TÓM TẮT LUẬN N T N SỸ HỌ Cán bộ hướng dẫn khoa học 1. PGS. TS.Nguyễn Văn Ba 2. PGS. TS.Phạm Văn Thân H N - 2018
ông trình ho n th nh tại V ỆN SỐT RÉT– KÝ SINH TRÙNG– ÔN TRÙN TRUN ƢƠN Cán bộ hướng dẫn khoa học 3. PGS. TS.Nguyễn Văn Ba 4. PGS. TS.Phạm Văn Thân Phản biện 1:................................................................................................. Phản biện 2:................................................................................................. Phản biện 3:................................................................................................. Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương Vào hồi .....giời ....ngày.....tháng ......năm 2018 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia; - Thư viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương
ANH MỤ TỪ V T TẮT AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome – Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải BV Bệnh viện BYT Bộ Y tế CS Cộng sự FAO Foods of Agriculture Organization -Tổ chức Nông Lương Thế giơi FB1 Fumonisin B 1 HIV Human Immunodeficiency Virus - Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi Polymerase PV Preventive value (hiệu quả can thiệp) QCVN Quy chuẩn Việt Nam RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) TB Trung bình TL Tỷ lệ TT Tình trạng WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới VPQ Viêm phế quản XN Xét nghiệm YTNC Yếu tố nguy cơ
1 TÍNH KHOA HỌ , TÍNH MỚ VÀ Ý N HĨA THỰ T ỄN ỦA Ề T 1. Tính khoa học, tính mới của đề t i Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như: - Phương pháp nghiên cứu mô tả có phân tích với các đợt điều tra cắt ngang, phương pháp nghiên cứu can thiệp giáo dục kiến thức, thái độ, thực hành cho đối tượng nghiên cứu. - Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu là những kỹ thuật thường quy hiện đang được áp dụng cho toàn ngành Y tế như: Phương pháp nước muối sinh lý, nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud. Đặc biệt đề tài đã sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định loài nấm, đây là kỹ thuật mới chưa được áp dụng rộng rãi tại Việt Nam. Đây cũng là lần đầu kỹ thuật định lượng aflatoxin trong các vị thuốc đông dược. - Đề tài đã sử dụng phương pháp xử lý số liệu chuẩn mực đáng tin cậy như: Stata, E-piinfo... Vì vậy các kết quả rất có giá trị, có độ tin cậy cao. 2. Ý nghĩa thực tiễn của đề t i Kết quả của đề tài đã cho thấy một bức tranh tổng thể về thực trạng nhiễm nấm và độc tố do nấm sinh ra trong các vị thuốc đông dược. Mặt khác, kết quả của đề tài cũng phản ánh thực trạng về mặt bằng chuyên môn cũng như kiến thức, thực hành của đội ngũ cán bộ y tế hoạt động chuyên môn y học cổ truyền. Đây là những con số có nhiều ý nghĩa trong công tác định hướng can thiệp nâng cao trình độ chuyên môn cho cán bộ y tế tại các bệnh viện. Qua thí điểm can thiệp tai các bệnh viện thụ hưởng dự án cũng cho thấy hiệu quả rất cao của sự kết hợp đồng bộ giữ “tăng cường xây dựng cơ bản” với đầu tư các “trang thiêt bị bảo quản thuốc đông dược ẤU TRÚ ỦA LUẬN N Luận án dày 114 trang, gồm: Đặt vấn đề 2 trang; Tổng quan 32 trang; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 30 trang; Kết quả nghiên cứu 30 trang; Bàn luận 27 trang; Kết luận 2 trang; Kiến nghị 1 trang. Luận án có 14 hình, 26 bảng sô liệu, 3 phụ lục. Có 104 tài liệu tham khảo, 54 tài liệu tham khảo tiếng việt, 60 tài liệu tham khảo tiếng Anh, trong đó 56/104 tài liệu trong thời gian 5 năm gần đây, chiếm 54%.
2 ẶT VẤN Ề Nấm là những sinh vật có nhân và thành tế bào thực sự, dị dưỡng, sinh sản bằng bào tử. Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên, phần lớn sống hoại sinh trong đất, số ít có khả năng ký sinh gây bệnh cho người và động vật. Ước tính trên thế giới có trên 1 triệu loài nấm. Có loại nấm có lợi, có loại có hại cho sức khỏe con người. Với sự đa dạng và phong phú của nấm người ta còn xếp nấm thành 1 giới riêng là “giới nấm”. Hiện nay, khoa học đã phát hiện khoảng trên 400 loài nấm gây bệnh cho người. Các vị thuốc đông dược thường được chế biến theo phương pháp cổ truyền như phơi, sấy, tẩm đường, mật... Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của nước ta và quá trình bảo quản không tốt do thiếu thốn phương tiện và kỹ thuật bảo, các vị thuốc đông dược rất dễ bị ẩm mốc. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy các vị thuốc đông dược, các sản phẩm nông nghiệp sau thu hoạch thường nhiễm các loài nấm Aspergillus spp như: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus niger... trong đó có vai trò y học quan trọng nhất là Aspergillus flavus (A. flavus). Tại Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng, cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu sâu về sinh bệnh học, dịch tễ học về nấm nhất là vi nấm ký sinh trên các vị thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản của người hành nghề y học cổ truyền nhưng các yếu tố nguy cơ ô nhiễm mầm bệnh vi nấm thì rất cao... đã làm cho một tỷ lệ không nhỏ chế phẩm đông dược ô nhiễm mầm bệnh vi nấm, đây là căn nguyên nhân cơ bản gây ra các bệnh ung thư gan nguyên phát, suy gan, xơ gan, u phổi do nấm... do các chất độc sinh ra trong quá trình phát triển của nấm như aflatoxin. Với tính cấp thiết của vấn đề chúng tôi thực hiện đề tài: “Thực trạng nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc của cán bộ y tế tại tỉnh Nghệ An, hiệu quả can thiệp (2016 - 2017)”, với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1.Xác định tỷ lệ nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược tại một số bệnh viện tỉnh Nghệ An năm 2016. 2. Mô tả thực trạng về môi trường, trang thiết bị bảo quản thuốc và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dược của các cán bộ y tế tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An. 3. Đánh giá hiệu quả can thiệp phòng chống vi nấm cho thuốc đông dược.
3 hƣơng 1 TỔN QUAN T L ỆU Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh do vi nấm thường gặp ở các nước kém phát triển có điều kiện vệ sinh kém, môi trường sống chật chội ẩm ướt, tỷ lệ mắc từ 5 -10%, có nơi > 10%. Một số bệnh nấm diễn biến rất phức tạp khó chẩn đoán như bệnh nấm phổi, bệnh nấm máu, bệnh nấm dịch não tủy và đặc biệt là ung thư gan nguyên phát do độc tố aflatoxin. Tổ chức Y tế Thế giới đưa aflatoxin vào danh mục chất gây ung thư mạnh năm 1988 và Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) khuyến cáo aflatoxin cần được kiểm soát chặt trẽ trong các sản phẩm nông nghiệp và các sản phẩm sau thu hoạch. Các nước cần có bộ công cụ đủ mạnh giám sát hàm lượng aflatoxin về khung pháp lý, về kỹ thuật phát hiện,đến sản xuất và lưu thông phân phối, nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. hƣơng 2 Ố TƢỢN V PHƢƠN PH P N H ÊN ỨU 2.1. ối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1. ối tƣợng nghiên cứu - Các mẫu thuốc đông dược trong các kho thuốc tại các khoa y học cổ truyền tại các bệnh viện công lập thuộc tỉnh Nghệ An. - Các nhà kho và trang thiết bị bảo quản thuốc đông dược trong các kho của các khoa y học cổ truyền tại các bệnh viện công lập. - Cán bộ y tế làm công tác chuyên môn về y học cổ truyền bao gồm: Làm công tác bảo quản, cấp phát thuốc đông dược ở các khoa dược trong các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An. Ghi chú: “Thuốc đông dược” là bao gồm các vị thuốc của y học cổ truyền phương đông, bao gồm: Thuốc nam và thuốc bắc. Thuốc bắc là thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc. Thuốc nam là các vị thuốc sản xuất và chế biến tại Việt Nam. 2.1.2. ịa điểm nghiên cứu - Điều tra cắt ngang: Địa điểm lấy mẫu thuốc đông dược và phỏng vấn cán bộ y tế tại các bệnh viện: Chọn ngẫu nhiên 10/29 bệnh viện đại diện đầy đủ các vùng khác nhau của tỉnh Nghệ An - Nuôi cấy nấm: Tại labo vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Đa khoa Nghệ An, đây là an toàn sinh học cấp II. - Thực hiện kỹ thuật định lượng aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao: Tại Viện Công nghệ Dược liệu Trung ương. - Thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen: Tại Labo kỹ thuật cao Học viện Quân y . - Thực hiện kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao: Tại Viện công nghệ Dược liệu Trung ương. 2.1.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 5/2016 – tháng 12/2017
4 2.2. Phƣơng pháp nghi n cứu - Thiết kế nghiên cứu: Đề tài được thiết kế bằng 2 phương pháp nghiên cứu: Dịch tễ học mô tả có phân tích. Dịch tễ học can thiệp không đối chứng. - Cỡ mẫu nghiên cứu: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu tối thiểu cho một p (1  p ) tỷ lệ nhiễm nấm: n = Z 21 / 2 d2 Trong đó: n: Cỡ mẫu tối thiểu; p: Tỷ lệ nhiễm nấm ước tính của quần thể, chọn p = 0,50, do chưa có nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm nấm ở các vị thuốc đông dược trên địa bàn tỉnh Nghệ An; Z1-/2: Hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% thì Z1-/2 = 1,96; d: Sai số tuyệt đối mong muốn của p, chọn d = 5%, d² = 0,025. Với các giá trị đã chọn, cỡ mẫu tính nghiên cứu là 384. Để đảm bảo độ tin cậy chúng tôi cộng thêm 20% vào cỡ mẫu → cỡ mẫu tính toán là 462. Thực tế đề tài thực hiện được 505 mẫu thuốc đông dược. - Nội dung nghiên cứu mô tả thực trạng nhiễm nấm và aflatoxin trong các vị thuốc đông dược: Sử dụng kỹ thuật trực tiếp trong môi trường KOH 20%; Nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 100% số mẫu; Chọn 50 mẫu nấm (+) thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh loài và xác định tỷ lệ thành phần loài nấm. 100% số mẫu có nhiễm nấm (+) để thực hiện kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao xác định hàm lượng aflatoxin. - Cỡ mẫu nghiên cứu mô tả kiến thức, thái độ, thưc hành bảo quản thuốc đông dược của cán bộ y tế: Cỡ mẫu tính toán là 60, chọn toàn bộ các cán bộ y tế trực tiếp làm công tác chuyên môn về bảo quản và cấp phát thuốc đông dược ở 10 bệnh viện nghiên cứu. - Nghi n cứu mô tả thực trạng nh kho, môi trƣờng bảo quản thuốc v kiến thức, thái độ, thực h nh bảo quản thuốc thuốc đông dƣợc của cán bộ tế + Chọn ngẫu nhiên 10/29 bệnh viện trong tỉnh có hoạt động chuyên môn về y học cổ truyền, đánh giá: Kết cấu nhà kho bằng nhà loại gì: Cấp 4 có mái lợp ngói hoặc tôn, nhà mái bằng, nhà cao tầng, tường quét vôi ve hay sơn, diện tích bao nhiêu m². Có cửa sổ, cửa thông gió hay không, có giá để thuốc hay không, trên các giá có hộp đựng thuốc có ghi nhãn không... + Kho đạt tiêu chuẩn có diện tích ≥ 50 m², mái lợp tôn, ngói..nhưng không dột, nền bằng xi măng hoặc lát gạch men, có cửa sổ thông gió và lấy ánh sáng. Có hay không có các trang thiết bị gồm điều hòa nhiệt độ, máy hút ẩm, đồng hồ đo nhiệt độ - độ ẩm, túi hút ẩm bằng hóa chất, quạt thông gió, giá để thuốc, bổ sung hộp nhựa đựng thuốc, bổ sung nhãn hộp đựng thuốc... + Điều kiện vi khí hậu trong kho đạt tiêu chuẩn là: Nhiệt độ ổn định < 25°C, độ ẩm trung bình < 70%, tốc độ gió từ 0,5 m/s đến < 1 m/s. + Các yếu tố về kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dược của cán bộ y tế. - Nghiên cứu can thiệp + Can thiệp thông qua nâng cấp trang thiết bị bảo quản thuốc. + Thực hiện lấy mẫu và nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud xác định tỷ lệ nhiễm nấm sau can thiệp 12 tháng.
5 + Can thiệp bằng truyền thông nâng cao kiến thức, thái độ, thực hành phòng chống nhiễm nấm cho thuốc của cán bộ y tế 2.3. ác kỹ thuật sử dụng trong nghi n cứu - Kỹ thuật chẩn đoán nhiễm nấm gồm: Kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH20%; Kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud với pH = 4,5 và có kháng sinh được thực hiện với 100% số mẫu thuốc đông dược; Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh loài nấm. - Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (AOAC Official Method 990.33) định lượng aflatoxin trong các vị thuốc đông dược. - Kỹ thuật phỏng vấn cộng đồng. 2.4. Các chỉ số nghiên cứu - Các chỉ số đánh giá tình trạng nhiễm nấm và aflatoxin + Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng xét nghiệm trực tiếp trong môi trường KOH 20%, nuôi cấy trong môi trường Sabouraud và sử dụng kỹ thuật PCR định loài nấm. Bao gồm: Tỷ lệ nhiễm nấm chung, tỷ lệ nhiễm nấm từng loại nấm, tỷ lệ nhiễm từng loài nấm, tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc và thuốc nam... + Đánh giá tình trạng nhiễm aflatoxin B1 theo tiêu chuẩn QCVN 8- 1:2011/BYT, cụ thể như sau: - Các chỉ số đánh giá thực trạng nhà kho, trang thiết bị trong kho, môi trƣờng trong kho bảo quản thuốc đông dƣợc - Các chỉ số về hiệu quả can thiệp: Bao gồm trang bị máy điều hòa nhiệt độ, quạt thông gió, máy hút ẩm, túi chống ẩm bằng hóa chất, giá để thuốc, tủ đựng thuốc, hộp nhựa đựng thuốc có ghi nhãn. Tất cả các mẫu sau khi xét nghiệm, nếu xác định có nhiễm nấm đều được đánh giá hiệu quả can thiệp sự thay đổi các chỉ số về nhiễm nấm trước và sau can thiệp 12 tháng. 2.5. Phƣơng pháp xử lý và phân tích số liệu Số liệu định lượng thu thập được qua xét nghiệm, qua phỏng vấn quan sát sẽ được nhập và phân tích bằng phần mềm Epi - Info 6.04 và Stata. 2.6. ạo đức nghiên cứu Tuân thủ nghiêm ngặt các quy định trong nghiên cứu y-sinh học như: Tuân thủ các quy trình nghiên cứu, thông báo và nói rõ mục đích nghiên cứu đối với đối tượng là cán bộ y tế được tham gia vào mẫu nghiên cứu phỏng vấn kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc. Chỉ được nghiên cứu ở người tự nguyện. Giữ bí mật về ý kiến của người phỏng vấn về các ván đề của cơ sở y tế liên quan đến bảo quản thuốc. Đề tài được thông qua Hội đồng Y đức của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Hội đồng Y đức của Sở y tế tỉnh Nghệ An và được sự chấp thuận của: Sở Y tế tỉnh Nghệ An và các cơ sở y tế trong tỉnh.
6 hƣơng 3 K T QUẢ N H ÊN ỨU 3.1. Thực trạng nhiễm nấm v aflatoxin trong dƣợc liệu đông dƣợc tại các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An năm 2016 3.1.1. Thực trạng nhiễm nấm trong các vị thuốc đông dƣợc - Tỷ lệ nhiễm nấm bằng kỹ thuật soi tươi Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm nấm chung ở các mẫu thuốc đông dƣợc bằng kỹ thuật soi tƣơi (n = 505) Nguồn gốc thuốc Số xét nghiệm Số nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Các mẫu thuốc bắc (1) 380 96 25,26 Các mẫu thuốc nam (2) 125 78 62,40 Tổng 505 174 34,46 Giá trị p (1: 2) < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH 20% là 34,46%. Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc và thuốc nam, với các tỷ lệ 25,26% so với 62,40%, p < 0,01 - Kết quả nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 100% số mẫu nghiên cứu đều được nuôi cấy nấm trong môi trường Sauboraud. Kết quả nuôi cấy như Bảng 3.5 và Bảng 3.6, Hình 3.1 sau: Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm nấm chung ở các vị thuốc bắc và nam dƣợc bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trƣờng Saboraud (n = 505) Số mẫu nhiễm Nhóm vị thuốc Số mẫu xét nghiệm Tỷ lệ (%) nấm Các vị thuốc bắc (1) 380 173 45,53 Các vị thuốc nam (2) 125 91 72,80 Tổng 505 262 51,80 Giá trị p (1: 2) < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud là 51,8%. Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc bắc và các vị thuốc nam (45,53% so với 72,80%, với p < 0,01). ảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc đông dƣợc l thân - rễ, lá, củ quả bằng nuôi cấ nấm trong môi trƣờng Sauboraud Nguồn gốc thuốc Số xét nghiệm Số nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Thuốc bắc Hoa, quả (1) 60 30 50,00 Thân, lá (2) 155 70 45,16 Củ (3) 165 73 44,24 Giá trị p (1: 2; 3) > 0,05 Thuốc nam Hoa, quả (1) 40 27 67,50 Thân, lá (2) 55 38 69,09 Củ (3) 30 26 86,67 Giá trị p (3: 1; 2) < 0,05 Nhận xét
7 Không có khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc bắc có nguồn gốc từ hoa, quả so với thân, lá và củ, với các giá trị 50,00% so với 45,16% và 44,24% với p > 0,05. Có khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc nam có nguồn gốc từ củ so với hoa, quả và thân lá với các giá trị 86,67% so với 67,50% và 69,09%, p < 0,05. ảng 3.8. Tổng hợp kết quả xác định tỷ lệ nhiễm nấm bằng kỹ thuật soi tƣơi v nuôi cấ trong môi trƣờng Saboraud (n = 505) Số xét Số nhiễm Tỷ lệ Kỹ thuât xét nghiệm phát hiện nấm nghiệm nấm (%) Soi tươi 505 174 34,46 Nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 505 262 51,80 Giá trị p < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn tỷ lệ phát hiện nấm bằng kỹ thuật soi tươi, với các tỷ lệ 51,80% so với 34,46%. 3.1.2. Kết quả định danh loài nấm ở các mẫu thuốc đông dƣợc bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Chọn 50/262 mẫu nhiễm nấm để thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, trong đó có 46 mẫu nấm sợi, 04 mẫu nấm men kết quả như sau: - Kết quả nhân gen, xác định trình tự và định danh các mẫu nấm Các mẫu nấm được tách chiết ADN bằng bộ kít Fungi/Yeast Genomic DNA Isolation Kit (Cat. # 27300, Norgen Biotek Corp, Canada) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA của nấm sau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn (template) cho phản ứng PCR. Cặp mồi ITS5 và NL4 khuếch đại đoạn gen chứa 1 phần gen 18S rDNA; Toàn bộ đoạn gen 5.8S rDNA; Toàn bộ các đoạn giao gen ITS1, ITS2 và một phần gen 28S rDNA của vi nấm, kích thước khoảng 1000-1200bp, tùy từng loài nấm. Kết quả tách chiết PCR và chạy điện di trên gel thạch như sau:
8 Hình 3.4. Kết quả giải trình tự gen Nhận xét Hình 3.4 cho thấy, đồ thị chạy PCR của các mẫu nấm phân lập từ dược liệu tại các bệnh viện của tỉnh Nghệ An là các đường liên tục, khớp với đồ thị chạy PCR của các mẫu gen chuẩn quốc tế. Trình tự các nucleotide thu được ở các mẫu đều có chất lượng tốt. Kết quả này cho thấy gen mồi lựa chọn, điều kiện cho phản ứng PCR là hoàn toàn phù hợp và đạt mức tối ưu. - Kết quả giải trình tự so sánh với ngân hàng gen chuẩn quốc tế Sau khi nhân bội gen, chạy điện di, sản phẩm PCR tinh sạch được kiểm định so sánh với ngân hành genbank chuẩn quốc tế là các chủng chuẩn đã được đăng ký mã số trên ngân hàng genbank quốc tế với sự kiểm định của các labo có uy tín trên thế giới. Trong đề tài này chúng tôi sử dụng mã số genbank KF617362.1 . Kết quả kiểm định độ tương đồng như Hình 3.4 và Bảng 3.9 sau: Đồ thị hiển thị trên máy chạy PCR là các đường liên tục, rõ nét rất điển hình với các mẫu gen chuẩn quốc tế KF617362.1 đã được đăng ký bản quyền của các labo chuẩn quốc tế có uy tín. Bảng 3.9. Tỷ lệ tƣơng đồng của một số mẫu nấm so với ngân hàng genbank Ký hiệu Mã số trên Chủng so sánh, mã Tỷ lệ (%) Nơi phân lập mẫu genbank số tương đồng BV. Huyện Rhizopus oryzae, NA-DL17 MF599708.1 99,7% Đô Lương KJ650335.1 BV. Đông Y Aspergillus flavus, NA-DY34 MF599709.1 99,9% tỉnh Nghệ An HQ856223.1 NA- BV Hữu nghị A. tubingensis, MF599710.1 99,7% HNDK10 Đa khoa KX664401.1 BV. Huyện Corynespora NA-QC31 MF599711.1 Quỳ Châu smithii, 97, 5% KY984300.1 BV. Huyện Fungal sp., NA-QC29 MF599712.1 92% Quỳ Châu KF617362.1 BV. Huyện Kodamaea ohmeri, NA-TL06 MF599713.1 99,8% Thanh Chương KY103876.1 BV. Huyện A. tubingensis, NA-TL10 MF599714.1 100% Thanh Chương KX664317.1 BV. Đa khoa Aspergillus niger, NA-TP34 MF599715.1 99,9 Tp. Vinh KJ365316.1 Nhận xét Kết quả tại Hình 3.4 và Bảng 3.9 cho thấy, hầu hết các mẫu được xác định loài đều có tỷ lệ tương đồng cao với ngân hàng gen, trên 99%. Riêng mẫu NA- QC29 chưa rõ loài do tỷ lệ tương đồng với nấm trên ngân hàng gen chỉ đạt 92%. Chủng này được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số KF617362.1, tạm gọi là (loài nấm chưa xác định).
9 - Tổng hợp thành phần loài nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dược được thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Bảng 3.10. Thành phần loài nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dƣợc n = 50 Loài nấm Dạng hình thái Số lượng Tỷ lệ (%) Aspergillus niger Nấm sợi 30 60,0 Aspergillus tubingensis Nấm sợi 9 18,0 Rhizopus oryzae Nấm sợi 3 6,0 Aspergillus oryzae Nấm sợi 1 2,0 Aspergillus flavus Nấm sợi 1 2,0 Corynespora smithii Nấm sợi 1 2,0 Alternaria tenuissima Nấm sợi 1 2,0 K. ohmeri Nấm men 1 2,0 C. parapsilosis Nấm men 1 2,0 Fungal spp Nấm men 1 2,0 Chưa xác định Nấm men 1 2,0 Nhận xét Kết quả từ Bảng 3.10. cho thấy: Có 11 loài nấm khác nhau phân lập từ các mẫu thuốc đông dược. A. niger chiếm tỷ lệ cao nhất 60,0%(30/50); Tiếp đến A. tubingensis 18,0%(9/50); 1 mẫu(2,0%) chưa xác định loài. 3.1.3. H m lƣợng aflatoxin trong các vị thuốc đông dƣợc tại các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An năm 2016 262 mẫu thuốc đông dược nhiễm nấm được xét nghiệm định lượng aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao, kết quả như sau: Bảng 3.11. Tỷ lệ nhiễm aflatoxin chung (n = 505) Tình trạng nhiễm nấm ở thuốc đông Tình trạng nhiễm aflatoxin dược Số xét Số nhiễm Tỷ lệ nghiệm aflatoxin (%) Các mẫu dược liệu nhiễm nấm 262 24 9,10 Các mẫu dược liệu không nhiễm nấm 243 0 0,00 Tổng 505 24 4,75 Giá trị p (1: 2) < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong các vị thuốc đông dược nhiễm vi nấm là 9,10%(24/505). Bảng 3.12. Tỷ lệ mẫu thuốc đông dƣợc nhiễm aflatoxin vƣợt tiêu chuẩn QCVN 8-1:2011/BYT (n = 24) Số mẫu Tình trạng nhiễm aflatoxin xét Số mẫu có hàm lượng Tỷ lệ Số mẫu có hàm lượng Tỷ lệ nghiệm aflatoxin < 0,5bpp (%) aflatoxin từ ≥ 0,5bpp (%) 24 8 33,34 16 66,66 Nhận xét Tỷ lệ mẫu thuốc đông dược nhiễm nấm mốc có hàm lượng aflatoxin vượt tiêu chuẩn QCVN 8-1:2011/BYT ( ≥ 0,5bpp) là 66,66%(16/24).
10 3.2. Thực trạng về môi trƣờng, trang thiết bị và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dƣợc của cán bộ y tế 3.2.1. Thực trạng về môi trƣờng, trang thiết bị bảo quản thuốc Kết quả đánh giá về nhà kho, trang thiết bị bảo quản như sau: Bảng 3.13. Thực trạng các nhà kho bảo quản thuốc đông dƣợc (n =10) TT ặc điểm nh kho v thiết bị bảo quản Số Tỷ lệ ánh lƣợng (%) giá 1 Diện tích kho: - > 50 m² 10/10 100 Đạt - < 50 m² 0/10 0,0 2 Nhà kho làm bằng nhà: - Kiên cố (cấp 1, 2, 3) 10/10 100 Đạt - Nhà cấp 4 lợp mái ngói hoặc lợp tôn 0/10 0,0 3 Nền nhà kho: - Bê tông, lát nền gạch 10/10 100 Đạt - Bê tông, không lát nền 0/10 0,0 4 Tường nhà kho: - Sơn chống thấm, quét vôi, ve 10/10 100 Đạt - Không sơn, không quét vôi ve, bong tróc.. 0/10 0,0 5 Có hệ thống cửa lấy ánh sáng, thông gió: - Có 10/10 100 Đạt - Không 0/10 0,0 6 Môi trường xung quanh kho: - Sạch (có rãnh thoát nước, không bụi rậm) 10/10 100 Đạt - Không sạch sẽ, không có rãnh thoát nước, nhiều bụi rậm) 0/10 0,0 Nhận xét Với 6 tiêu chí kiểm tra thì có 6/6 (100%) tiêu chí đạt yêu cầu. Bảng 3.14. Trang thiết bị bảo quản thuốc đông dƣợc (n = 10) TT Đặc điểm nhà kho và thiết bị bảo quản Số Tỷ lệ Đánh lượng (%) giá 1 Có giá để thuốc không - Có 10/10 100 Đạt - Không 0/10 0,0 2 Co giá, hộp đựng thuốc, có ghi nhãn không? - Có 10/10 100 Đạt - Không 0/10 0,0 3 Có dụng cụ hút ẩm (túi hóa chất, điều hòa): - Có 0/10 0,0 Không - Không có 10/10 100 đạt 4 Môi trường không khí: - Nhiệt độ TB ở 4 góc và giữa kho (C°) < 25°C 0/10 0,0 Không - Độ ẩm tương đối trung bình (%): < 70% 0/10 0,0 đạt - Tốc độ gió: 0,5 - 1 m/s 0/10 0,0
11 Nhận xét - Số bệnh viện có thiết kế giá để thuốc và trên các giá để thuốc đều có hộp đượng có lắp kín và ghi nhãn 4/4(100% đạt). - Không có dụng cụ hút ẩm (100% không đạt). Các điều kiện vi khí hậu như: Nhiệt độ (100% vị trí ở các kho có nhiệt độ trung bình > 25°C (không đạt), 100% vị trí của các kho có độ ẩm tương đối > 70% (không đạt), 100% số vị trí đo ở các kho có tốc độ gió < 0,5 m/s và > 1m/s (không đạt). 3.2.2. Kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dƣợc của các bộ y tế hành nghề đông dƣợc tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An Bảng 3.16. Kiến thức của cán bộ y tế về nguyên nhân thuốc đông dƣợc bị nấm và tác hại của nấm với sức khỏe con ngƣời (n = 60) Yếu tố khảo sát các điều kiện môi trường thuận lợi Số trả lời Tỷ lệ cho nấm ký sinh và phát triển đúng (%) Hiểu nguyên nhân nấm do: - Nhiệt độ (t°) cao, độ ẩm cao, độ thông gió kém 48/60 80 - Thiếu ánh sáng 42/60 80 - Không được định kỳ kiểm tra, phơi, sao, sấy 54/60 90 - Thiếu dụng cụ, phương tiện bảo quản (giá để thuốc, tủ 60/60 100 có ngăn, hộp có lắp kín, tem, nhãn, máy hút ẩm, quạt thông gió, kho chứa không đúng kỹ thuật...) Hiểu người sử dụng thuốc đông dược mốc sẽ bị bệnh 57/60 95 Hiểu đường lây nhiễm bệnh do nấm 51/60 85 Biết các tác hại với sức khỏe con người do nấm 60/60 100 Kể tên được một số tác hại do nấm với sức khỏe 45/60 75 Mô tả được một số triệu chứng do nấm gây ra 45/60 75 Hiểu có thể phòng chống được nhiễm nấm 60/60 100 Kể tên được một số cách phòng chống nấm 45/60 75 Hiểu được một số bệnh do nấm có thể điều trị khỏi 15/60 25 Kể tên được một số bệnh do nấm 15/30 25 Mô tả được một số cách phòng bệnh do nấm 60/60 100 Nhận xét - Có từ 80,0% đến 100,0% hiểu biết nguyên nhân thuốc đông dược bị nhiễm nấm (bị mốc) là do: Nhiệt độ (t°) cao, độ ẩm cao, độ thông gió kém, thiếu ánh sáng, không được định kỳ kiểm tra và thiếu phương tiện bảo quản. - Có 95% hiểu người sử dụng thuốc đông dược nhiễm nấm (bị mốc) sẽ bị bệnh. Chỉ có 25% kể tên được một số nấm trong các vị thuốc đông dược, 25% hiểu được một số bệnh do nấm có thể điều trị khỏi. Bảng 3.17. Kiến thức của cán bộ y tế về tác nhân gây nấm v các điều kiện bảo quản thuốc đông dƣợc không bị nấm (n = 60) Yếu tố khảo sát Số lượng Tỷ lệ
12 (%) - Không kể tên được loài nấm nào (1) 45/60 75 - Kể tên được 1 loài nấm (2) 12/60 20 - Kể tên được từ 2 loài nấm trở lên (3) 3/60 5 Hiểu các điều kiện để bảo quản thuốc đông dược không bị nấm (có giá để thuốc, tủ có ngăn, hộp có lắp kín) 60/60 100 Hiểu nhiệt độ tối đa cho phép trong kho thuốc là < 25°C 40/60 66,67 Hiểu đúng độ ẩm cho phép trong kho là < 70% 30/60 50 Hiểu được thuốc đông dược cần được hấp, sấy, phơi nắng định kỳ tránh nhiễm nấm 60/60 100 Hiểu đúng tốc độ gió trong kho 0,5 - 1 m/s 6/60 10 Nhận xét Có 75% (45/60) số cán bộ được hỏi không kể tên được loài nấm nào có trên dược liệu mốc, chỉ có 20% (12/60) kể được tên 1 loài nấm và 5%(3/60) kể tên được 2 loài nấm trở lên. Bảng 3.18. Thực hành của cán bộ y tế về phòng chống nhiễm nấm cho thuốc đông dƣợc (n = 60) Yếu tố khảo sát Số lượng Tỷ lệ (%) Kiểm tra định kỳ nhà kho, thiết bị bảo quản thuốc và thuốc - Có kiểm tra (1) 60 100 - Không kiểm tra (2) 0 0 Thời gian định kỳ kiểm tra nhà kho, thiết bị bảo quản thuốc và thuốc - Mỗi ngày/1 lần (1) 0 0 - 1 tuần/1 lần (2) 15 25 - >1 tuần/1 lần (3) 45 75 Khi phát hiện thấy dược liệu có dấu hiệu bi mốc hoặc mốc nhẹ thì anh chị làm gì? - Thực hiện bảo quản thuốc: Sấy, phơi, hấp...(1) 45 75 - Làm thủ tục hủy bỏ thuốc (2) 15 25 Khi phát hiện thấy thuốc có dấu hiệu bi mốc nặng (nấm đã mọc thành đám), anh chị làm gì? - Thực hiện bảo quản thuốc sấy, phơi, hấp...(1) 15 25 - Làm thủ tục hủy bỏ thuốc (2) 45 75 Nhận xét 100% số người được phỏng vấn trả lời có kiểm tra định kỳ nhà kho, thiết bị bảo quản thuốc và tình trạng thuốc. Tuy nhiên tỷ lệ cán bộ có kiểm tra thuốc hằng ngày là 0,0%. 3.3. Hiệu quả can thiệp phòng chống nấm cho thuốc đông dƣợc
13 3.3.1. Tha đổi về kiến thức và thực hành của cán bộ y tế phòng chống nhiễm nấm cho thuốc sau 12 tháng can thiệp Có 2 nhóm can thiệp truyền thông nâng cao kiến thức về nấm cho cán bộ y tế và tăng cường trang thiết bị bảo quản thuốc cho bệnh viện: Bảng 3.20. Kiến thức của cán bộ y tế về vi nấm v các điều kiện vi khí hậu bảo quản thuốc đông dƣợc không bị nhiễm nấm (n = 60) Yếu tố đánh giá Trước can Sau can Giá trị Hiệu quả thiệp thiệp p can thiệp Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ (%) lượng (%) lượng (%) Kể được tên tối thiểu 1 loài 12 20,0 60 100,0 < 0,05 300,0 nấm Hiểu đúng các điều kiện 48 80,0 60 100,0 < 0,05 25,0 bảo quản thuốc Nhiệt độ tối đa cho phép trong kho thuốc < 25°C 40/60 66,67 60/60 100,0 < 0,05 50,0 Hiểu đúng độ ẩm tương đối cho phép trong kho < 70% 30/60 50,0 60/60 100,0 < 0,05 100,0 Hiểu tốc độ gió 0,5 - 1 m/s 6/60 10,0 60/60 100,0 < 0,05 900,0 Nhận xét: Hiệu quả can thiệp bằng truyền thông làm thay đổi kiến thức của cán bộ y tế rất cao, cụ thể: Kể được tên tối thiểu 1 loài nấm tăng từ 20,0% lên 100%, hiệu quả là 300,0%; Hiểu đúng các điều kiện bảo quản thuốc tăng từ 80,0% lên 100,0%, hiệu quả đạt 25,0%; Hiểu đúng nhiệt độ tối đa cho phép trong kho thuốc là < 30°C, tăng từ 66,67% lên 100,0%, hiệu quả 50,0%; Hiểu đúng độ ẩm tương đối cho phép trong kho < 70% từ 50,0% tăng lên 100,0%, hiệu quả đạt 100,0%; Hiểu đúng tốc độ gió từ 0,5 -1 m/s từ 10,0% tăng lên 100,0%, hiệu quả đạt 900,0%. 3.3.2. Tình trạng nhà kho, thiết bị bảo quản thuốc trƣớc và sau can thiệp 12 tháng Với 100% (10/10) nhà kho của bệnh viện đề đạt các tiêu chí đánh giá mức tốt nhất, chỉ thiếu các thiết bị bảo quản trong kho. Vì vậy, đề tài lựa chọn cả 10 bệnh viện để đánh giá hiệu quả can thiệp bằng tăng cường các thiết bị bảo quản thuốc như: Điều hòa nhiệt độ, quạt thông gió, máy hút ẩm, trang bị đồng hồ đo nhiệt độ, độ ẩm, túi hóa chất hút ẩm....Kết quả như sau: Bảng 3.21. Hiệu quả bổ sung trang thiết bị l m tha đổi vi khí hậu (n = 10) Thời gian Thiết bị bảo quản (điều Tỷ lệ Đánh Giá trị Số lượng đánh giá hòa vi khí hậu...) (%) giá p Trước can - Có 0/10 0,0 Không thiệp - Không có 10/10 100 đạt
14 Sau can thiệp - Có 10/10 100 Đạt < 0,05 12 tháng - Không có 0/10 0,0 Nhận xét Trước can thiệp 100% kho thuốc không đạt yêu cầu. Sau can thiệp đạt yêu cầu 100%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Bảng 3.22. Hiệu quả l m tha đổi các yếu tố vi khí hậu trong kho sau can thiệp 12 tháng ( n =10) Thời gian Đặc điểm nhà kho và thiết bị bảo Số lượng Tỷ lệ (%) Đánh giá đánh giá quản Trước can Môi trường không khí: thiệp - Nhiệt độ trung bình ở 4 góc và 0 0,0 Không giữa kho (C°): < 25°C đạt - Độ ẩm tương đối (%): < 70% 0 0,0 - Tốc độ gió 0,5 -1m/giây 0 0,0 Sau can Môi trường không khí: thiệp 12 - Nhiệt độ trung bình ở 4 góc và 10 100 tháng giữa kho (C°): < 25°C Đạt - Độ ẩm tương đối (%): < 70% 10 100 - Tốc độ gió 0,5 -1 m/giây 10 100 Nhận xét Khác biệt có ý nghĩa thống kê về các yếu tố vi khí hậu trong kho thuốc trước và sau can thiệp 12 tháng với p < 0,05. Cụ thể: - Nhiệt độ trung bình ở 4 góc và giữa kho (C°) < 30°C, trước can thiệp 0%(0/10) kho đạt, sau can thiệp 100%(10/10) đạt yêu cầu. - Độ ẩm tương đối < 70%, trước can thiệp 0%(0/10) số kho đạt được, sau can thiệp 100%(10/10) đạt yêu cầu. - Tốc độ gió (m/s) < 0,5m/giây, trước can thiệp 0%(0/10) có kho nào đạt, sau can thiệp 100%(10/10) đạt yêu cầu. 3.3.3. Hiệu quả giảm tình trạng nhiễm nấm ở các vị thuốc đông dƣợc sau can thiệp 12 tháng Bảng 3.23. Hiệu quả giảm tỷ lệ nhiễm vi nấm chung ở các mẫu thuốc đông dƣợc sau 12 tháng can thiệp Trước can thiệp (1) Sau can thiệp 12 tháng (2) Số mẫu xét Số(+) Tỷ lệ Số mẫu xét Số (+) Tỷ lệ Giá trị p nghiệm (%) nghiệm (%) 505 262 51,80 507 96 18,99 < 0,01 Hiệu quả can thiệp = 63,34% Nhận xét Khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc đông dược trước can thiệp và sau can thiệp 12 tháng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (51,8% so với 18,99%, với p < 0,05). Hiệu quả can thiệp giảm tỷ lệ nhiễm nấm là 63,34%. Bảng 3.24. Hiệu quả giảm tỷ lệ nhiễm nấm trong thuốc đông dƣợc tại các bệnh viện sau can thiệp 12 tháng Tên bệnh viện (BV) Trước can thiệp Sau can thiệp 12 tháng Giá trị p
15 Số xét Số Tỷ lệ Số xét Số Tỷ lệ nghiệm (+) (%) nghiệm (+) (%) Bệnh viện Đa khoa 43 26 60,47 43 13 30,23 < 0,05 Thành phố Vinh (1) Hiệu quả can thiệp = 50,00% Bện viện Đông y tỉnh 68 33 48,53 68 9 13,23 < 0,05 Nghệ An (2) Hiệu quả can thiệp = 72,73% Bệnh viện Đa khoa 62 33 53,23 62 12 19,35 < 0,05 Qùy Châu (3) Hiệu quả can thiệp = 63,65% Bệnh viện Đa khoa 64 32 50,00 64 11 17,19 < 0,05 Quỳnh Lưu (4) Hiệu quả can thiệp = 65,62% Bệnh viện Hữu nghị 56 29 51,79 56 15 26,78 < 0,05 Đa khoa Nghệ An (5) Hiệu quả can thiệp = 48,30% Bệnh viện Đa khoa 46 23 50,00 46 7 15,22 < 0,05 Cửa Lò (6) Hiệu quả can thiệp = 69,56% Bệnh viện Đa khoa 50 26 52,00 50 9 18,00 < 0,05 Quế Phong (7) Hiệu quả can thiệp = 65,38 Bệnh viện Đa khoa 60 30 50,00 60 9 15,00 < 0,05 Yên Thành (8) Hiệu quả can thiệp = 70,00% Bệnh viện Đa khoa 41 22 53,66 41 7 17,07 < 0,05 Đô Lương (9) Hiệu quả can thiệp = 68,19% Bệnh viện Đa khoa 15 8 53,33 17 4 23,53 < 0,05 Thanh Chương (10) Hiệu quả can thiệp = 55,88% Nhận xét Hiệu quả can thiệp làm giảm tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc tại các bệnh viện tương đối cao từ 48,30% đến 72,73%, trung bình 63,34%. hƣơng 4: N LUẬN 4.1. Thực trạng nhiễm nấm, aflatoxin trong các mẫu thuốc đông dƣợc tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An năm 2016 4.1.1. Thực trạng nhiễm nấm - Tỷ lệ nhiễm nấm
16 Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH20% tại Bảng 3.3 là 34,65%, tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc nam cao hơn thuốc bắc, với các tỷ lệ 63,20% so với 25,26%, với p < 0,01. Mặt khác, kết quả tại Bảng 3.5, Bảng 3.6 và Hình 3.1 cho thấy tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn kỹ thuật soi trực tiếp trong môi trường KOH20%, cụ thể tỷ lệ nhiễm nấm chung là 51,80%, trong đó tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc là 45,53%, ở các mẫu thuốc nam là 72,80%. Kết quả này cho phép nhận định: + Tỷ lệ nhiễm nấm trong các mẫu thuốc nam tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An nói chung là cao, cao hơn tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc, với các tỷ lệ nhiễm nấm tương ứng (63,20% so với 25,26%, p < 0,01) và (72,80% so với 45,53%, p < 0,01). + Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp trong môi trường KOH20% (51,80% so với 25,26%, p < 0,01). Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với thực tiễn là hiện nay là phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm bằng nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, vì có nhiều ưu điểm sau: Kết quả tại Bảng 3.6, cho thấy các mẫu thuốc bắc có nguồn gốc là hoa, quả có tỷ lệ nhiễm nấm cao hơn các mẫu thuốc có nguồn gốc từ thân, lá và củ (50,00% so với 45,16% và 44,24%), tuy nhiên sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê vơi p > 0,05. Điều này khác với các mẫu thuốc nam, các mẫu thuốc có nguồn gốc từ củ có tỷ lệ nhiễm nấm cao hơn các mẫu thuốc có nguồn gốc từ hoa, quả và thân lá (86,67% so với 67,50% và 69,09%) sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả nghiên của đề tài này cũng phù hợp với thực tế là: + Các mẫu thuốc nam hầu hết là khai thác sơ chế bằng phơi khô, sao, sấy không hề có các biện pháp bảo quản gì khác. Khi gặp điều kiện thời tiết nóng, ẩm thì rất dễ bị nhiễm nấm. + Đối với các mẫu thuốc bắc hầu hết có sử dụng từ 1 đến nhiều hình thức bảo quản vật lý, hóa học... như: Tẩm, sao, sấy, sông khói, một số vị thuốc còn có thể có cả kim loại nặng để bảo quản, vì vậy tỷ lệ nhiễm nấm thấp hơn thuốc nam là hợp lý. Tuy nhiên vấn đề kiểm soát các chất bảo quản còn nhiều điều cần nghiên cứu sâu hơn, trong giới hạn đề tài không đi sâu nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng phù hợp với một số nghiên cứu trong và ngoài nước như: Nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga (2012), nghiên cứu khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trong một số dược liệu bán ở Quận 5 – Thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp định danh loài nấm bằng khóa định loài và định lượng aflatoxin bằng Kit ELISA, kết quả cho thấy: Tỷ lệ nhiễm nấm trong dược liệu là 61%(86/141). Lý Thu Hương (2012), nghiên cứu tình trạng nhiễm vi nấm và ochratoxin A trong đất và rễ cây trồng tại Tây Nguyên, kết quả cho thấy: Tỷ lệ nhiễm vi nấm là 43,75%, tỷ lệ nhiễm nhiễm vi nấm thay đổi từ 11,1% đến 62,5%.
17 Tại Việt Nam cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu sâu và bài bản về thành phần loài nấm ký sinh trên thuốc đông dược. Vấn đề sử dụng dược liệu là cây, con làm thuốc là nét văn hóa đặc trưng của các nước Châu Á, trong đó có Việt Nam. Với thuốc đông dược có nhiều cách chế biến và dù chế biến bằng cách nào đi nữa thì người sử dụng vẫn phải ăn, uống...vì vậy, có thể coi “sử dụng thuốc đông dược như sử dụng thực phẩm như của các nước Âu, Mỹ và trên thế giới”. Như chúng ta đã biết, hầu hết các vị thuốc nam dược được thu mua trong nước, đó là cây, con khai thác tự nhiên, hoặc canh tác như những cây nông nghiệp khác, chỉ sơ chế qua bằng phơi, sấy...không sử dụng bất cứ hình thức bảo quản bằng hóa chất nào khác và các điều kiện bảo quản sau thu hoạch ở nước ta còn rất nhiều hạn chế, vì vậy nguy cơ nhiễm nấm cao hơn các vị thuốc bắc là phù hợp với thực tiễn. Kết hợp với điều kiện thời tiết nước ta là nhiệt đới, nóng, ẩm, mưa nhiều cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển. Mặt khác, đa số các vị thuốc bắc được trồng, khai thác, chế biến, sao tẩm và sử dụng các phương pháp bảo quản bằng hóa học như hơi lưu huỳnh, giem sa, sử dụng các kim loại nặng bảo quản... vì vậy, tỷ lệ nhiễm nấm thấp hơn các vị thuốc nam dược là phù hợp với thực tiễn. - Kết quả định danh loài nấm ở các mẫu thuốc đông dược bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Kết quả của đề tài tại Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5 cho thấy: + Sản phẩm PCR của các mẫu nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dược tại các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An chỉ có 1 band duy nhất, rõ nét, kích thước 1200bp. Đồ thị chạy PCR là các đường liên tục rõ nét, rất điển hình và phù hợp với trình tự các nucleotid của các mẫu gen mồi chuẩn quốc tế KF617362.1 đã đăng ký bản quyền tại các labo có uy tín trên thế giới. Kết quả này cũng phản ánh: + Gen mồi, các điều kiện cho phản ứng PCR, quy trình kỹ thuật thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen mà đề tài sử dụng và thực hiện là phù hợp và tối ưu. Kết quả tại Bảng 3.9 các mẫu xác định loài có độ tương đồng rất cao > 99,00% với ngân hành gen chuẩn Quốc tế, chỉ có 1 mẫu NA-QC29 có độ tương đồng chỉ đạt 92,00% và tạm gọi là chủng nấm chưa xác định, cần có nghiên cứu sâu hơn để xác định chính xác tên loài nấm. Kết quả của đề tài tại các Bảng 3.9, Bảng 3.10 cho thấy đã phát hiện 11 loài nấm khác nhau được phân lập từ các mẫu dược liệu tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An. Kết quả này cũng phản ánh sự đa dạng về thành phần loài nấm cũng như vai trò quan trong của Aspergillus như Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Aspergillus flavus và một số loài nấm khác trong quá trình gây nhiễm nấm ở thuốc đông dược. Đây là các loài nấm có tỷ lệ cao nhất Aspergillus niger chiếm tới 60,0%, Aspergillus tubingensis chiếm 18,0%. + Andre El Khoury và CS (2011), đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP của vùng đệm (vùng giao gen aflJ và aflR), sau đó các sản phẩm được sử dụng enzyme phân cắt giới hạn (RFLPs) để nghiên cứu thành phần loài nấm gây nhiễm độc aflatoxin ở nho. Kết quả các sản phẩm sinh ra từ Aspergillus flavus