Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Một số đặc tính của các chủng Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

74
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm mô tả thực trạng kháng kháng sinh và một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện ở Hà Nội bao gồm bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn. Sau đây là bản tóm tắt của luận văn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Một số đặc tính của các chủng Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM1 KHÁNG CARBAPENEM BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN
Hà Nội 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM1 KHÁNG CARBAPENEM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN HUY HOÀNG PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ
Hà Nội – 2015
MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) hiện nay đang là một thách thức lớn đối với các bệnh viện trong việc điều trị bởi tỷ lệ nhiễm khuẩn ngày càng cao. NKBV là một trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến tính mạng người bệnh, là nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ mắc, tử vong cao cho các bệnh nhân tại các bệnh viện trên thế giới [76]. NKBV thường gây nên bởi các vi khuẩn kháng đa kháng sinh, gây rất nhiều khó khăn cho công tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, tăng biến chứng, tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật qua đó tăng mức sử dụng kháng sinh, tăng chi phí dùng thuốc và là gánh nặng bệnh tật cho cả người bệnh và hệ thống y tế. Hiện nay Acinetobacter baumannii (A. baumannii) là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng hàng đầu tác động đến các cơ sở điều trị trên thế giới. Tuy nhiên sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng lại các kháng sinh thuộc nhóm βlactam, bao gồm cả các kháng sinh nhóm carbapenem thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng”. Đặc biệt là sự xuất hiện của các chủng Acinetobacter mang gen New Delhi Metallobetalactamase1 (NDM1) kháng carbapenem được ghi nhận ở một số quốc gia như Đức và Vương quốc Anh. Trong nghiên cứu gần đây của chúng tôi tại một số bệnh viện ở Hà Nội, A. baumannii chiếm 53,33% (320/600) trong tổng số chủng vi khuẩn gram âm gây NKBV và hơn 95% số chủng kháng lại cephalosporin thế hệ 3, với ít nhất 1 kháng sinh nhóm carbapenem. Câu hỏi nghiên cứu được đặt ra là liệu các chủng A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại các bệnh viện có mang gen NDM1 hay không? Chính sự cấp thiết và ý nghĩa thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Một số đặc tính của các chủng Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM1 kháng carbapenem” với mục tiêu: Mục tiêu cụ thể: 1. Mô tả thực trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn. 2. Phát hiện tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 phân lập được trong nghiên cứu.
3. Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nhiễm khuẩn bệnh viện Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospitalacquired infection hay nosocomial infection) là “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà thời điểm nhập viện không thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào. Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện”. Hiện nay nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới về nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho các quốc gia có thu nhập cao nằm trong khoảng từ 5% đến 12%. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện ở các quốc gia có thu nhập trung bình và thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% và tỷ lệ tính chung là khoảng 10,1/100 bệnh nhân. 1.2. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Kháng sinh được phát hiện ở thế kỷ 20 và lập tức đóng vai trò quan trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng. Cho đến nay nhiều thế hệ kháng sinh khác nhau đã được nghiên cứu và chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị. Tuy nhiên hiện nay do sự gia tăng tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng là một vấn đề quan trọng hàng đầu trên thế giới cần được nghiên cứu và tìm ra các giải pháp phòng chống một cách hiệu quả. 1.2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh Năm 1929 Alexander Fleming là người đầu tiên nghiên cứu và phát minh ra loại thuốc kháng sinh đầu tiên có tên là Penicillin. Tuy nhiên phải đến năm 1939, Ernst Chain và Howard Florey mới tách chiết thành công hoạt chất penicillin và được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trong chiến tranh thế giới lần thứ
II. Năm 1946, penicillin bắt đầu được sử dụng trong lâm sàng và có đóng góp to lớn cho y học. Bác sỹ người Đức Gerhard Domagk đã công bố phát minh tổng hợp được hoạt chất kháng sinh mới prontosil. Đây là thế hệ đầu tiên của các kháng sinh thuộc dòng sulfonamides được sử dụng trong lâm sàng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu hô hấp và một số bệnh nhiễm trùng khác. Thập kỷ 50 đến 70 của thế kỷ 20 được coi là thời kỳ hoàng kim của kháng sinh, nhiều loại kháng sinh mới đã được giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol và tetracycline được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. 1.2.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 1.2.2.1. Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng kháng sinh. Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh được đưa vào sử dụng. 1.2.2.2. Phân loại đề kháng Đề kháng được chia làm hai loại đề kháng giả và đề kháng thật. Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất không phải do di truyền. Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được + Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn + Đề kháng thu được: Có rất nhiều cơ chế đã được vi khuẩn phát triển để kháng lại kháng sinh. 1.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Vi khuẩn có rất nhiều cơ chết kháng khang sính Thay đổi đích tác động Tạo ra các enzyme
Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất 1.2.4. Các yếu tố nguy cơ gây kháng kháng sinh Lạm dụng sử dụng kháng sinh trong cộng đồng Sử dụng kháng sinh trong bệnh viện Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Chất lượng kháng sinh kém Gia tăng sự đi lại quốc tế 1.3. Kháng sinh nhóm carbapenem Carbapenem là nhóm kháng sinh được coi là “lựa chọn cuối cùng” dùng để điều trị NKBV. Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng sinh enzym betalactamase (ESBL) bằng cách ức chế quá trình tổng hợp vỏ ngoài của tế bào vi khuẩn. 1.4. Thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm hiện nay Thực trạng đa kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm hiện nay là một trong những vấn đề mang tính toàn cầu, đặc biệt ở tại các quốc gia đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn. Bằng chứng mới nhất là sự lây lan của các chủng vi khuẩn Gram âm như Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, A. baumannii... mang gen New Delhi Metalloβ lactamase 1 (NDM1) kháng carbapenem “thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng” ở một số quốc gia. Hậu quả của vi khuẩn kháng đa kháng sinh để lại rất nặng nề, nó tác động đến nhiều lĩnh vực khác nhau như sức khỏe con người, kinh tế, dịch tễ học, ngành công nghiệp dược phẩm và các biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh. 1.5. Đặc điểm vi sinh vật học và tình trạng kháng kháng sinh của A. baumannii 1.5.1. Đặc điểm vi sinh vật học của A. baumannii 1.5.1.1. Đặc điểm chung A. baumannii là một trong các chủng Acinetobacter spp. có cấu trúc của một cầu trực khuẩn Gram âm, có nguồn gốc từ trong thiên nhiên như trong đất, nước,
thực phẩm. Ngày nay, người ta đã phát hiện chúng như là một tác nhân thường trú trong bệnh viện và có khả năng phát tán và lây lan thành các vụ dịch. A. baumannii là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối và dễ mọc trên các môi trường thông thường ở nhiệt độ 20 30oC, nhiệt độ tối ưu là 35oC. 1.5.1.2. Đặc điểm sinh học của A. baumannii A. baumannii có tính chất sinh học thay đổi tùy theo điều kiện và môi trường sống, chính tính chất này giúp vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong môi trường, dụng cụ dùng chăm sóc và điều trị bệnh nhân của bệnh viện, đặc biệt là khả năng kháng với hầu hết các loại kháng sinh thông thường và cả với kháng sinh điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn này như là kháng sinh nhóm carbapenem. 1.5.2. Cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii A. baumannii có khả năng kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, trong đó nó có thể đề kháng với chính kháng sinh dùng để điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn này. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này cũng khác nhau theo loài, địa phương A. baumannii với đặc tính là loài có khả năng tích lũy nhiều gen kháng kháng sinh dẫn đến sự phát triển của các chủng đa kháng. Có bốn cơ chế thường gặp gây hiện tượng đa kháng thuốc ở A. baumannii được nói đến nhiều nhất là: (i) Thay đổi vị trí đích tác động (thay đổi đích PBP) (ii) Đột biến mất kênh porin không cho kháng sinh qua màng vào bên trong vi khuẩn, (iii) Bất hoạt kháng sinh qua các bơm đẩy kháng sinh ra ngoài và (iv) tiết enzyme để phá hủy kháng sinh. 1.5.3. Tình hình A. baumannii kháng carbapenem trên Thế giới Hiện nay, vi khuẩn A. baumannii được biết đến như là một tác nhân quan trọng hàng đầu gây nhiễm khuẩn trong bệnh viện ở trên toàn thế giới. Đặc biệt trong 15 năm trở lại đây có nhiều phát hiện quan trọng về khả năng thích ứng của loại vi khuẩn này nhằm kháng lại các kháng sinh đã được báo cáo, điều này cho thấy loại vi khuẩn này đang đe dọa đến thời đại kháng sinh hiện nay của chúng ta. Hiện nay một số chủng A. baumannii kháng lại tất cả các kháng sinh hiện có cũng đã được báo cáo, do vậy cần phải giám sát chặt chẽ thậm chí phải đưa ra ngay các hành động cụ thể nhằm ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này trên hệ thống y tế toàn thế giới.
1.5.4. Tình hình A. baumannii kháng carbapenem tại Việt Nam Ở trong bệnh viện các vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức độ cao. Theo tổng kết về thực trạng kháng kháng sinh của hiệp hội kháng kháng sinh toán cầu (GARP) tại Việt Nam từ các nghiên cứu khác nhau tại các bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy từ năm 20002001 có 25% các vi khuẩn Gram âm phân lập được kháng lại cephalosporin, tuy nhiên cho đến năm 2009 thì 42% số chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại cefftazidime, gentamicin 63% và nalidixic acid 74% [1]. Nghiên cứu gần đây nhất do nhóm nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trong 2 năm từ 20102011 nhằm phát hiện tỷ lệ kháng carbapenem của các vi khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn tại 3 bệnh viện của Hà Nội. Kết quả ban đầu cho thấy A. baumannii chiếm một tỷ lệ nhiễm khuẩn cao nhất 53,33% (320/600) trong tổng số chủng vi khuẩn Gram âm thu thập được và hơn 95% đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và với ít nhất 1 kháng sinh thuộc nhóm carbapenem. Đặc biệt chúng tôi phát hiện được 5% (16/320) số chủng A. baumannii mang gen NDM1 tại cả 3 bệnh viện. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng A. baumannii phân lập được từ 3 bệnh viện ở Hà Nội bao gồm: bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Xanh Pôn giai đoạn 20102014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tư tiêu hao Trang thiết bị, sinh phẩm và dụng cụ tiêu hao đầy đủ và đạt tiêu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu.
2.3. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu hồi cứu – mô tả cắt ngang 2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu được tiến hành từ: năm 2014 đến 2015 Địa điểm nghiên cứu: Tại phòng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu toàn bộ bao gồm 582 chủng A. baumannii thu thập được từ 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn từ năm 2010 đến năm 2014. Các chủng A. baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm nhiễm khuẩn như: máu, đờm khí quản, nước tiểu, dịch vết mổ … 2.6. Các phương pháp nghiên cứu 2.6.1. Các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh 2.6.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Đường kính các vòng vô khuẩn thu được sẽ được ghi lại và tính toán dựa theo tiêu chuẩn CLSI, năm 2010. Các loại khoanh giấy kháng sinh sử dụng bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm. 2.6.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller hinton có nồng độ kháng sinh khác nhau theo tiêu chuẩn của CLSI và được ủ ở 37 oC qua đêm (khoảng 18 giờ). Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc 3. Các kháng sinh được thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) và colistin (CS). Chủng
chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC25922 được tiến hành song song với các chủng vi khuẩn thử nghiệm. 2.6.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử 2.6.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn mang gen NDM1 Trình tự mồi để phát hiện gen NDM1 của vi khuẩn TT Tên Trình tự mồi Kích thước (bp) Ndm1F 5’atgcacccggtcgcgaagctgag3’ 499 Ndm1R 5’ttcgacccagccattggcggcga3’ Vi khuẩn sau khi được xác định là chủng thuần sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng và được tách triết DNA để làm khuân mẫu cho phản ứng PCR. Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di agarose nồng độ 1,5% trong đệm TAE 1X trong 30 phút. Sau khi điện di xong gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromine nồng độ 10mg/ml trong 10 phút, rửa trong nước cất 15 phút. Gel được mang đi quan sát và chụp lại bằng máy chụp ảnh gel. 2.6.2.2. Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật multilocus sequence typing (MLST) Kỹ thuật MLST sử dụng PCR để khuếch đại 7 đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi và rpoD) sau đó tiến hành giải trình tự và phân tích kết quả trên cơ sở dữ liệu về MLST của Acinetobacter baumannii http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_abaumannii_oxford_seqdef Bảng 2.2. Các trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật MLST đối với chủng A. baumannii Kích Tài liệu TT Tên Trình tự mồi thước tham khảo (bp)
AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG gltA F TCC C 1 772 GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA gltA R CAC G gyrB F TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT 2 594 gyrB R GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA gdhB F GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C 3 774 A. baumannii gdhB R GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C MLST recA F CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC 4 425 website recA R GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC cpn60F GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA 5 640 cpn60R CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA gpiF GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA 6 456 gpiR TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC rpoD F ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG 7 672 rpoD R TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT 2.6.2.3. Phân tích mối liên hệ kiểu gen các chủng A. baumannii bằng kỹ thuật PFGE [39] Tách DNA vi khuẩn trong đệm thạch: Rửa plug sau khi ly giải: Cắt DNA vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn: Cắt chromosomal DNA của vi khuẩn đã tách chiết trong thạch bằng Enzym giới hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) và ApaI (cho A. baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch ở 370C trong vòng 1216 giờ. Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEFDR III (BioRad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1%, ở hiệu điện thế
6V/cm trong 19 giờ ở nhiệt độ 140C, thời gian một xung từ 25 đến 60s và góc điện trường là 120 độ. 2.6.2.4. Phát hiện plasmid mang gen NDM1 bằng kỹ thuật Southern Blotting [39] Tạo mẫu dò cho gen NDM1: Tách chiết DNA vi khuẩn trong đệm thạch (giống với phương pháp PFGE ở phần 2.6.2.3) Thực hiện kỹ thuật S1PFGE: Cắt loại bỏ DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn bằng enzym S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm enzym S1, Ủ 37 0C trong 1 giờ. Sản phẩm cắt DNA sẽ được điện di bằng bộ điện di CHEFDR III (BioRad laboratories, Richmond, Calif) trên thạch Seakem gold 1% để tách plasmid. Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và chụp ảnh để xác định số lượng và kích thước plasmid của các chủng vi khuẩn. Chuyển DNA plasmid sang màng lai HybondN, Amersham: Rửa gel bằng dung dịch HCL 0,25M lạnh trong 7 phút, dung dịch biến tính (NaCl 1,5M; NaOH 0,5M) lạnh trong 20 phút và dung dịch trung hòa (TrisHCl 0,5M; NaCl 1,5M; pH 7.5) lạnh trong 20 phút. Chuyển các plasmid sang màng lai Hybond N của hãng Amersham bằng dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 300 mM Natri Citrate, pH 7.0) bằng hệ thống chuyển màng Biometraanalytic (của hãng Jena, Cộng hòa Pháp). Thực hiện phản ứng lai: Màng lai đặt ủ trong dung dịch tiền lai (gold hydridization buffer của hãng ECLTM Amersham) ở 42oC trong 1 giờ. Loại bỏ dung dịch tiền lai đưa vào dung dịch lai đã được bổ sung 30 µl mẫu dò NDM 1. Lai qua đêm ở 42oC (khoảng 16 giờ) bằng lò lai UPV HL2000 HybriLinker (Đức). Dừng phản ứng lại và rửa màng lai bằng dung dịch SSC 0,5X chứa 0,4% SDS và dung dịch SSC 2X ở 55oC. Hiện màng (sử dụng bộ Kit ECl, Hãng ECLTM Amersham): Hiện màng trên hyper film bằng hỗn hợp detection 1 và detection 2 ECLTM Amersham.
Phân tích kết quả: Sử dụng ảnh chụp gen các plasmid trước khi và ảnh plasmid sau khi lai để phát hiện số lượng và kích thước các plasmid mang gen. 2.7. Quản lý và phân tích số liệu Số liệu thu thập được từ phiếu điều tra và bệnh án sẽ được nhập 2 lần độc lập vào máy tính và kiểm tra đối chiếu để tránh sai sót trong quá trình nhập số liệu. Số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm excel. Kết quả được trình bày dưới dạng bảng, đồ thị, biểu đồ Phần mềm Bioedit và website của đơn vị nghiên cứu Oxford http://pubmlst.org được sử dụng để đọc và phân tích kết quả MLST. Phân tích mối liên hệ kiểu gen của các chủng A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM1 bằng phần mềm Bionumeric 6.5 để tạo cây phả hệ.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mô tả thực trạng kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại 3 bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn Trong 5 năm, từ năm 2010 đến năm 2014 nghiên cứu đã thu thập được 582 chủng A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện ở Hà Nội (Hình 3.1). 250 217 200 153 150 ốCủ n h g 100 S 49 50 31 36 35 15 14 13 12 5 0 1 0 1 0 2010 2011 2012 2013 2014 Việt Đức Tha nh Nhà n Xa nh Pôn Hình 3.1. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem tại 3 bệnh viện theo năm (n=582) Trong 582 chủng A. baumannii phân lập được tại 3 bệnh viện, có 428 chủng được phát hiện ở nam giới chiếm khoảng 74% và 154 chủng phát hiện ở nữ giới chiếm khoảng 26% tổng số trường hợp (tỷ suất chênh Nam/nữ=2,78) (Hình 3.2). 26 % 154 428 74 % Nam Nữ
Hình 3.2. Tỷ lệ phân bố của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem 3 bệnh viện theo giới (n=582) Tỷ lệ về giới được thể hiện rõ hơn đối với từng bệnh viện trong biểu đồ tỷ lệ phân bố theo giới phát hiện các chủng A. baumannii kháng carbapenem (Hình 3.3). 350 320 300 250 200 150 101 100 69 37 39 50 16 0 Việt Đức Thanh Nhàn Xanh Pôn Nam Nữ Hình 3.3. Phân bố theo giới của các chủng A. baumannii kháng carbapenem trong từng bệnh viện (n=582) Tỷ lệ bệnh nhân nam nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem cao hơn nhiều so với bệnh nhân nữ ở từng bệnh viện (Hình 3.3). 3.2. Phát hiện tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM1 phân lập được trong nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NDM1 (Ndm1F: 5’atgcacccggtcgcgaagctgag3’; Ndm1R: 5’ ttcgacccagccattggcggcga3’) để phát hiện các chủng A. baumannii kháng carbapenem mang gen NDM1 [79].
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 P N Size (bp) 3000 1500 500 499bp 300 200 100 Hình 3.4. Hình ảnh đại diện cho các chủng vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 trong nghiên cứu. P: positive; N: negative; M: thang chuẩn 100bp Kết quả cho thấy 23/582 chủng A. baumannii, được phát hiện dương tính với gen NDM1 chiếm khoảng 3,95% tổng số chủng thu thập được. Dương tính:23; 3.95% Âm tính: 559; 96.05% Dương tính Âm tính Hình 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 kháng carbapenem trong nghiên cứu (n=582) 3.2.1. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 phân lập tại 3 bệnh viện Trong 23 chủng A. baumannii mang gen NDM1, có 7 chủng được phân lập từ bệnh viện Việt Đức, 5 chủng phân lập được ở bệnh viện Thanh Nhàn và 11 chủng phân lập tại bệnh viện Xanh Pôn.
7; 30% 11; 48% 5; 22% Việt Đức Thanh Nhàn Xanh Pôn Hình 3.6. Tỷ lệ phân bố A. baumannii mang gen NDM1 ở 3 bệnh viện (n=23) 3.2.2. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 theo khoa Sự phân bố theo khoa của các chủng A. baumannii mang gen NDM1 được thể hiện trong biểu đồ ở Hình 3.7. BV Việt Đức BV Thanh Nhàn 1; 14% 1; 20% 2; 29% 4; 57% 4; 80% Hồi sức tích cực Phẫu thuật tiết niệu Phẫu thuật nhiễm khuẩn Hồi sức tích cực Thận BV Xanh Pôn 2; 18% 9; 82% H ồi sức tích cực Nhi
Hình 3.7. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 theo khoa ở 3 bệnh viện (n=23) Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 ở Khoa Nhi bệnh viện Xanh Pôn là cao nhất trong các khoa ở cả 3 bệnh viện, liệu rằng có xuất hiện nhiễm khuẩn chéo xảy ra ở bệnh viện Xanh pôn do công tác phòng chống nhiễm khuẩn chưa hiệu quả. 3.2.3. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 theo nhóm tuổi và theo giới Trong 23 trường hợp phát hiện nhiễm khuẩn mang gen NDM1 có độ tuổi từ 1 đến 77 tuổi. Trong đó nhóm tuổi
dẫn đến tình trạng quá tải trong bệnh viện. Điều này sẽ được chứng minh bằng các kỹ thuật sinh học phân tử thực hiện ở dưới đây. 3.2.4. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 theo giới Trong 23 ca phân lập được vi khuẩn A. baumannii mang gen NDM1 có 3 trường hợp là nữ giới (13%) và 20 trường hợp là nam giới (87%). Tỷ xuất về giới tính Nam/Nữ là 6.67/1 (Hình 3.9) 3, 13% 20, 87% Nam Nữ Hình 3.9. Tỷ lệ các chủng A. baumannii mang gen NDM1 theo giới (n=23) 3.2.5. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng A. baumannii mang gen NDM1 Kết quả thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) của các chủng A. baumannii dương tính với NDM1 cho thấy: tất cả các chủng này đều kháng lại kháng sinh Cefotaxime (>64mg/L), Ceftazidime (>32mg/L). Hầu như các chủng này đều kháng với kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (nhóm kháng sinh được cho là lựa chọn cuối cùng để điều trị nhiễm khuẩn) bao gồm: Imipenem, Meropenem. Chỉ có 1 chủng kháng imipenem và meropenem ở mức độ trung gian (