zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học

Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:43

Báo xấu

61
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn thực hiện với 2 mục tiêu chính sau đây: Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm người; xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. suis. Sau đây là tóm tắt của luận văn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG
Hà Nội 2013
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair C () Chứng âm C (+) Chứng dương Cps Capsular polysaccharide DNA Deoxyribonucleic acid DNT Dịch não tủy Ef Extracellular factor Mrp Muramidasereleased protein NCPL Nuôi cấy phân lập PCR Polymerase chain reaction Pư Phản ứng Sly Suilysin S.suis Streptococcus suis VMN Viêm màng não VK Vi khuẩn Đặng Thị Kiều Oanh Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch. Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S. suis đã và đang được coi là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao. Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn như Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trung ương Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở người lớn tại Việt Nam. Ở các nước có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S. suis bởi các kỹ thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến. Ở Việt Nam, vì sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng như sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác, phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả thi hơn cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng (Real time PCR). Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phương pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao. Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người” với 2 mục tiêu chính sau đây: Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm người; Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. suis. Đặng Thị Kiều Oanh 1 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ S.suis 1.1.1. Giới thiệu chung Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, kích thước khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào. Trong bệnh phẩm, chúng thường xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hình 1.1). S.suis có yếu tố quyết định kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R, S và T tương ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [Error: Reference source not found]. Nhưng đến năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu được S.suis có tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [Error: Reference source not found] nhưng typ 32 và 34 vừa được chứng minh là Streptococcus orisratti. Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho người đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [ Error: Reference source not found]. Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ít trường hợp gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14. Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5 10% CO 2, mọc trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như môi trường thạch máu, thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thích hợp 370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 45 0C, pH thích hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy. S. suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trường thạch máu cừu và tan huyết dạng beta trên môi trường thạch máu ngựa Đặng Thị Kiều Oanh 2 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Mặc dù chức năng của 2030% bộ gen chưa được biết nhưng nhiều gen đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã được nghiên cứu. Đó là những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. Có 17 chủng S. suis đã được giải trình tự gen. Tùy từng chủng, bộ ben có kích thước từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán *Vỏ polysacarit của vi khuẩn S. suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide cps). Việc định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này. Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 được cho là có liên quan nhiều hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra. Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đường: Galactose, glucose, N acetyl glucosamine, Nacetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, Nacetyl glucosamine được thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ khác chưa được nghiên cứu sâu. *Suilysin Suilysin là một yếu tố gây tan huyết được mã hóa bởi gen sly của S. suis. Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tương đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae). Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thương tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm được tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra, suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trình sản xuất và tác động của các cytokine. Thí nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hưởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến. Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn. *Hệ thống Arginine deminase Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định được 2 protein bề mặt vi khuẩn có kích thước 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ tương đồng Đặng Thị Kiều Oanh 3 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. pyogenes. Protein 47 kDa tương đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tương đồng với streptococcal acid glycoprotein (SAGP). ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp. Hệ thống ADS có mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis *Protein được giải phóng do muramidase (muramidasereleased protein; mrp) và yếu tố ngoại bào (extracellular factor ef) Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động vật bị bệnh nhưng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên người, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số chủng phân lập được mang gen mrp. Mrp và ef cũng được coi là các yếu tố chỉ thị cho S. suis typ 2. Các chủng vi khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã được xác định. Biến thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef. Đã có nghiên cứu gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực chẳng khác gì vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần được làm sáng tỏ bằng các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. 1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis Quá trình xâm nhập Sự tồn tại của vi khuẩn trong máu và sự lây nhiễm Hiện tượng viêm và sốc nhiễm trùng Sự xâm nhập hệ thần kinh trung ương và viêm màng não 1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis S. suis lần đầu tiên được báo cáo bởi các bác sĩ thú y năm 1954, sau khi bùng phát dịch viêm màng não, viêm khớp nhiễm khuẩn huyết, và có mủ xảy ra ở lợn con [Error: Reference source not found]. Sau đó, vào năm 1968, bệnh do S. suis được ghi nhận ở người qua mô tả lần đầu tiên về 2 trường hợp viêm màng não mủ và một trường hợp nhiễm trùng huyết nặng tại Đan Mạch. Từ đó, bệnh được ghi nhận ở các nước khác thuộc Châu Âu (Anh, Hà lan,…) và Hồng kông [Error: Reference source not found]. Đặng Thị Kiều Oanh 4 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Tại Anh, trong khoảng từ năm 1975 đến năm 1990, có tất cả 35 trường hợp nhiễm Streptococcus suis được báo cáo, trong số đó, 34 trường hợp bệnh nhân nam. 25 bệnh nhân đã được xác nhận bị nhiễm Streptococcus suis từ năm 1984 và 1993 ở Hồng Kông. Trong số đó, 15 trường hợp (60%) đã có một tiếp xúc với lợn hoặc thịt lợn. Xét nghiệm dịch não tủy của 21 bệnh nhân đã xác nhận sự hiện diện của viêm màng não, 4 bệnh nhân còn lại bị viêm khớp, viêm phế quản phổi, viêm nội tâm mạc và sốt [Error: Reference source not found]. Có 7 trường hợp nhiễm S. suis ở Nhật Bản từ năm 1994 đến 2006. Tất cả các trường hợp có tiếp xúc với lợn và 5 người trong số họ đã có tổn thương da tay trong quá trình tiếp xúc. 5 trường hợp trên có các triệu chứng của viêm màng não, nhiễm trùng huyết, và có 1 trường hợp đã tử vong. Tất cả S. suis được phân lập thuộc nhóm D theo phân loại của Lancefield và týp huyết thanh 2. Chúng nhạy cảm với penicillin G, ampicillin, cefotaxim, và ciprofloxacin. Tuy nhiên, sáu trong số chúng có khả năng kháng cả erythromycin và clindamycin, và cũng đề kháng với minocycline [Error: Reference source not found]. Từ ngày 1/1/200331/7/2005, có 21 trường hợp được xác định là nhiễm S. suis , trong đó có 1 trường hợp (5%) tử vong, 18 trường hợp (86%) là nam giới và 3 trường hợp (14%) là nữ . Độ tuổi trung bình là 62 tuổi (từ 2689 tuổi), 12 trường hợp (57%) khởi phát bệnh trong tháng 5, tháng 6, tháng 7 hoặc tháng 8. Họ sống ở các huyện khác nhau ở Hồng Kông và không có phân nhóm địa lý [Error: Reference source not found]. Gần đây, trong tháng 78/2005, tại t ỉnh Sichuan, Trung Qu ốc đã xảy ra một vụ dịch lớn do S. suis lây truyền từ lợn sang người. Tổng s ố 215 ng ười mắc, trong đó, 61 (người) 28% trường h ợp nhi ễm khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng nhiễm độc, 38 người chết (62%), 48% viêm màng não mủ ...Tỷ lệ tử vong trung bình của tất cả các trường hợp > 20%. M ột s ố trường h ợp sau khi khỏi bệnh nhiễm khuẩn S. suis cấp tính bị những di chứng nh ư điếc không hồi phục, mất thăng bằng...[Error: Reference source not found]. Tổng số người nhiễm S. suis báo cáo cho đến khi tháng 8 năm 2006 ≈ 400, và gần 90% các trường hợp này xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan, Hồng Kông, Đài Loan, và Hà Lan. Tất cả các trường hợp người nhiễm S. suis đã báo cáo hầu hết là typ 2, ngoại trừ 1 trường hợp typ huyết thanh 1, 1 trường hợp typs huyết thanh 4, và 1 trường hợp typ kiểu huyết thanh 14 [Error: Reference source not found]. Số lượng trường hợp lây nhiễm S. suis ở người báo cáo đã tăng đáng kể. Trong một bài báo xuất bản năm 2007, 409 trường hợp nhiễm S. suis ở người được báo cáo, hầu hết trong số đó xảy ra ở Trung Quốc, Thái Lan và Hà Lan, 73 trường hợp bị tử vong [Error: Reference source not found]. Đặng Thị Kiều Oanh 5 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Từ 20002011, 8 bệnh nhân bị nhiễm S. suis đã được xác định ở Đài Loan. Sáu trường hợp ban đầu được xác định nhầm là Streptococcus acidominimus, nhưng sau khi giải trình tự gen 16S rRNA của chủng phân lập được thì chúng được xác định là S. suis. Đa số các trường hợp trên được xác định là S.suis typ 2 [Error: Reference source not found]. Trong số 116 trường hợp viêm màng não do S. suis ở Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh từ năm 1997 đến năm 2005, 115 trường hợp dotyp huyết thanh 2 và 1 trường hợp do typ huyết thanh 14 [Error: Reference source not found]. Trong hai năm 2005 2006, có 72 trường hợp nhiễm S.suis nhập Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, 58 bệnh nhân (81%) là nam giới. Phần lớn bệnh nhân là nông dân, 38% bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với lợn hay thịt lợn, tuy nhiên chỉ có 6 bệnh nhân (8%) có tổn thương da nghi ngờ. 69 bệnh nhân (96%) biểu hiện bệnh cảnh viêm màng não như: sốt, nhức đầu, ói, cổ cứng, rối loạn tri giác là những triệu chứng thường gặp. 68% trường hợp viêm màng não mủ có triệu chứng ù tai, điếc. Một bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết bị sốc do nhiễm độc tố liên cầu. Sau 10 đến 14 ngày dùng kháng sinh Ceftriaxone, hầu hết bệnh nhân đều hồi phục. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được còn nhạy cảm với penicillin và ceftriaxone [1, Error: Reference source not found] Từ tháng 1/2007 đến tháng 09/2008 : 68 trường hợp tại Bệnh viện Nhiệt đới trung ương. Từ tháng 1/2006 đến tháng 12/2010 có hơn 140 trường hợp viêm màng não và nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Trung ương Huế. 1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG 1.3.1. Đường lây truyền Streptococcus suis có thể lây truyền qua người khi tiếp xúc với lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn qua các tổn thương nhỏ, trầy xước trên da của những người giết mổ, chế biến và ăn thịt lợn bệnh hay lợn mang vi khuẩn nấu không chín. Hiện nay, chưa có bằng chứng bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ người sang người. Lợn mang vi khuẩn là nguồn lây nhiễm chính. Bệnh có thể truyền qua đường hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm khuẩn.Vi khuẩn có thể vẫn có mặt ở hạch hạnh nhân của lợn sau khi đã được điều trị bằng kháng sinh penicillin. Lợn nái có thể mang vi khuẩn trong tử cung và âm đạo. Lợn có thể bị nhiễm vi khuẩn ở bất kỳ tuổi nào. Khả năng nhiễm và gây bệnh của vi khuẩn ở lợn con cao hơn Đặng Thị Kiều Oanh 6 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học ở lợn trưởng thành. Các đàn lợn non trong trạng thái chịu stress và tiếp xúc với nguồn bệnh sẽ có khả năng phát bệnh cao. 1.3.2. Triệu chứng Thể lâm sàng thường gặp nhất ở người mắc bệnh nhiễm trùng S. suis là viêm màng não mủ (72,5%), nhưng một tỷ lệ đáng kể (24,2%) thường gặp là thể nhiễm khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng nhiễm độc, có biểu hiện suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc (1,1%), viêm khớp (1,1%), viêm phổi (0,8%) và viêm phúc mạc (0,3%). Ở thể viêm màng não mủ, bệnh nhân bị sốt cao, đau đầu, ớn lạnh, buồn nôn, nôn và chóng mặt. Tiếp theo có thể có một hay nhiều triệu chứng sau: điếc, mất thăng bằng, hôn mê, cứng gáy, xuất huyết, đau khớp, liệt ngoại vi hoặc liệt mặt, đau cơ nghiêm trọng, bầm tím ban đỏ. Ở thể sốc nhiễm trùng nhiễm độc, bên cạnh sốt cao, ớn lạnh, đau đầu, nôn, chóng mặt, đau bụng còn thêm các dấu hiệu khác như hạ huyết áp, tim đập nhanh, suy gan, chảy máu dưới da, đông máu nội mạch rải rác, suy thận cấp, hội chứng suy hô hấp cấp. Tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc thể này rất cao (>60%). 1.3.3. Biện pháp phòng bệnh Tuyên truyền trên các phương tiện thông tin truyền thông để người dân biết và chủ động phòng tránh bệnh liên cầu khuẩn lợn [1]: Nên chọn mua thịt lợn đã qua kiểm định của cơ quan thú y. Tránh mua thịt lợn có màu đỏ khác thường, xuất huyết hoặc phù nề. Nấu chín thịt lợn là điều rất quan trọng (Tổ chức Y tế Thế giới WHO khuyến cáo trên 700C). Không ăn lợn chết, không ăn các món ăn tái, đặc biệt là tiết canh lợn trong thời gian có dịch. Những người có vết thương hở phải đeo găng tay khi tiếp xúc với thịt lợn tái hoặc sống. Phải giữ các dụng cụ chế biến ở nơi sạch sẽ, rửa sạch tay và các dụng cụ chế biến sau khi tiếp xúc,chế biến thịt lợn. Dùng riêng các dụng cụ chế biến thịt sống và thịt chín. 1.3.4. Biện pháp chống dịch Khi nhận thấy có dịch liên cầu khuẩn, xảy ra thì phải xử lý đúng như xử lý một ổ dịch truyền nhiễm [1]: Tăng cường giám sát phát hiện các trường hợp bị bệnh nghi nhiễm liên cầu khuẩn lợn ở người, nên đưa ngay đến bệnh viện để tổ chức cứu chữa kịp thời. Đặc biệt chú ý giám sát những đối tượng có tiếp xúc gần với lợn bị bệnh như người chăn nuôi, giết mổ và buôn bán lợn. Đặng Thị Kiều Oanh 7 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Nghiêm cấm hoàn toàn việc di chuyển và giết mổ lợn. Không giết mổ,vận chuyển lợn bệnh, lợn chết phải tiêu huỷ đúng cách. 1.3.5. Nguyên tắc điều trị Lưu ý phát hiện sớm các trường hợp có biểu hiện viêm màng não và có tiếp xúc với lợn bị bệnh, chẩn đoán và điều trị kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong do biến chứng gây ra. Điều trị kháng sinh đặc hiệu Penicilline li ều cao: u ống, tiêm bắp hoặc truyền tĩnh mạch, thường phải điều trị trên 10 ngày. Có thể dùng các kháng sinh khác cũng hiệu quả như: Ampicilline, Erythromycine ho ặc nhóm Cephalosporine. Điều trị triệu chứng và áp dụng các biện pháp hồi sức tích cực. Lọc máu nếu có điều kiện. 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM Nuôi cấy phân lập Nhuộm Gram Phản ứng catalase Xét nghiệm định danh, định typ: Phát hiện vi khuẩn S. suis bằng phản ứng Realtime PCR 1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR 1.5.1. Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction – PCR) PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA, tạo ra hàng ngàn, hàng triệu bản sao của một đoạn DNA có trình tự cụ thể. Kỹ thuật PCR đã được phát triển vào năm 1984 bởi một nhà hóa sinh người Mỹ tên là Kary Mullis. Mullis nhận được giải Nobel và giải thưởng của Nhật Bản phát triển PCR 1993. Tuy nhiên nguyên lý cơ bản của việc sao chép một phần của DNA bằng cách sử dụng hai mồi đã được Gobind Khorana mô tả vào năm 1971. Hiện nay, kỹ thuật PCR được sử dụng rất phổ biến trong y tế, phòng thí nghiệm sinh học và nhiều ứng dụng khác . Kỹ thuật PCR có tiềm năng trở thành một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi nhất vì nó cho kết quả nhanh, chi phí rẻ và đơn giản. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể ngay cả khi số lượng DNA đích rất thấp. Phát triển kỹ thuật PCR được coi là một trong những bước đột phá trong sự phát triển của nền khoa học thế giới [Error: Reference source not found]. Đặng Thị Kiều Oanh 8 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR PCR là một phản ứng dây chuyền: Phân tử DNA được sử dụng để tạo ra 2, 4, 8… bản sao. Sự nhân lên liên tục của DNA được thực hiện bởi các protein cụ thể là polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp các chuỗi DNA từ các nucleotit. Để thực hiện tổng hợp DNA cần có 4 loại nucleotit là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) và guanine (G). PCR là một phương pháp được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của bất kỳ sợi axit nucleic nào. Đây là một phương pháp khuếch đại một cách chọn lọc một đoạn DNA của hệ gen. Trong quy trình PCR gốc của Mullis, DNA sợi kép được tách thành hai sợi đơn của DNA bằng cách nung nóng nó đến 96 ° C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase của E.Coli bị phá hủy, cần phải bổ sung các enzyme mới sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR này không hiệu quả vì nó đòi hỏi nhiều thời gian, số lượng DNA polymerase lớn, và sự theo dõi liên tục trong suốt quá trình PCR [Error: Reference source not found]. 1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi 1.5.3.1. Giới thiệu chung PCR đa mồi là một loại phản ứng khuếch đại gen nhưng không phải chỉ khuếch đại một trình tự gen đích mà có thể cùng một lúc khuếch đại hai hay nhiều hơn hai trình tự gen đích khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại mồi khác nhau (primers) với cùng một quy trình khuếch đại trong cùng một ống phản ứng. Do đó, sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm được thời gian, công sức xét nghiệm và có khả năng phát hiện được hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc. Phân tích được các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể (hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phương pháp PCR đa mồi trở thành một phương pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả lâm sàng và nghiên cứu. Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. 1.5.3.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi Để có được hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen đích người ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khía cạnh của kỹ thuật PCR như mồi (vị trí, trình tự, hàm lượng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lượng Taq polymerase; nồng độ MgCl2; sự tương quan giữa các thành phần phản ứng và gen đích… thêm nữa là các loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp. Đặng Thị Kiều Oanh 9 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồikhuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer). Lựa chọn mồi: Chiều dài của mỗi mồi ở khoảng 1824 bp, nếu mồi có độ dài lớn hơn (30 35bp) thì dường như cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tương tự như mồi có độ dài ngắn, tuy vậy mồi ở độ dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chính, ngăn các sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi. Nếu có thể, trình tự của mỗi mồi nên được ‘bắt đầu’ và ‘kết thúc’ bởi 12 cặp GC. Hai mồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau. Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp primer để việc khuếch đại các vùng đích được đặc hiệu. Nồng độ mồi Thông thường, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ phân tử dùng cho mỗi mồi từ 100 – 500 nM. Trong phản ứng PCR đa mồi, lượng mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhìn thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ít…và sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nên tránh sử dụng lượng mồi quá cao hoặc quá thấp. Lượng mồi quá cao có thể gây ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhưng ngược lại lượng mồi quá ít thì không đủ để có sản phẩm khuếch đại. Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản phẩm ít nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ưu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thì việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng lượng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lượng mồi cho sản phẩm mạnh hơn (vùng mạnh). Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 500nM) có thể thay đổi đáng kể trong vòng vùng này và thường được thiết lập theo kinh nghiệm [Error: Reference source not found]. Với DNA có số copy thấp hoặc có tính phức tạp cao thì nồng độ mồi nên dùng từ 300nM 500nM (0,3 – 0,5µM). Đối với DNA có số copy cao hoặc tính phức tạp Đặng Thị Kiều Oanh 10 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học thấp nồng độ mồi được khuyên là từ 40nM – 400nM (0,040,4µM) [ Error: Reference source not found]. Sự cân xứng giữa lượng mồi và lượng DNA khuôn (DNA đích) Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồikhuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer). Nồng độ mồi và nồng độ DNA đích : Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng PCR. Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng được coi như một cách tối ưu phản ứng PCR. Đặng Thị Kiều Oanh 11 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu Chủng vi khuẩn Streptococcus suis Để hoàn thiện và chuẩn hoá các điều kiện của phản ứng PCR, trong đề tài đã sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng của người (từ máu và dịch não tủy) được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm “ Vi khuẩn Hô hấp” khoa Vi khuẩn, Viện VSDTTW để tạo bệnh phẩm mô phỏng phục vụ thực nghiệm. Vi khuẩn S. suis gây bệnh được kiểm tra dựa trên: Tính chất bắt màu trong nhuộm Gram; Thử nghiệm Catalaze; Phân nhóm huyết thanh Lancefield: S. suis phải thuộc liên cầu nhóm D; Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh phẩm ‘API 20 Strep’ (Bio Mérieux); Xác định typ huyết thanh phổ biến gây bệnh cho người: ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2. Một số chủng vi khuẩn khác để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện Một số chủng vi khuẩn gây viêm màng não mủ điển hình như Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typ b và một số vi khuẩn khác cùng nhóm liên cầu nhưng không phải S. suis (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae) và tế bào bạch cầu người. 2.1.2. Dịch não tủy nền Là loại dịch não tủy được thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu được từ bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã được khẳng định âm tính với vi khuẩn để tạo bệnh phẩm nền và sử dụng như mẫu chứng âm tính thật với S. suis. 2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não mủ do S. suis. Đặng Thị Kiều Oanh 12 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học + 44 mẫu đã được khẳng định chắc chắn là vi khuẩn S. suis bằng nuôi cấy phân lập. + 09 mẫu âm tính trong NCPL nhưng dương tính với S. suis trong PCR đơn mồi 100 mẫu bệnh phẩm âm tính thực sự với vi khuẩn S. suis (cả bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR), gồm: + 29 mẫu từ bệnh nhân người lớn có các dấu hiệu thần kinh – liệt chi không rõ nguyên nhân/ hội chứng não cấp). + 71 mẫu DNT của TE ≤ 24 tháng tuổi không có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/có chẩn đoán xác định VN vi rút hoặc vi khuẩn khác không phải S. suis như Hib, phế cầu và não mô cầu (được lấy trong CT giám sát VMN mủ ở TE của PTN VKHH). 2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: Môi trường và sinh phẩm nuôi cấy định danh vi khuẩn S. suis: Môi trường thạch máu cừu 5% (Columbia sheep blood agar plate, BD [Cat. 251165]). Dung dịch H2O2 3% Bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux). Bộ kháng huyết thanh Lancefield (BioMérieux)/Streptex (Remel Cat: 30950501]) Kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2 (serology, Đan Mạch) Bộ nhuộm Gram (DIFCO Becton Dickinson, USA) Lam kính và lá kính phủ Sinh phẩm tách chiết DNA của vi khuẩn: High pure PCR Purification Kit (Roche Co.,) Lysozyme (MP Biomedicals, Inc. Cat 100834). Mutanolysin (Sigma Co.,). Triton X 100 Sinh phẩm PCR: ReadyToGo PCR Mastermix Kit (Amersham Co.,) hoặc Hotstartaq Master Mix Kit (QIAgen), mỗi phản ứng bao gồm: Taq poly 2,5 units; 200µM mỗi loại dNTP; 1,5mM MgCl2; 10mM TrisHCl [pH9,0]; 50mM KCl; BSA [Bovine Serum Albumine]. 25 mM MgCl2 (Invitrogen/Fermentas) Nước tinh sạch (Sartorius). Thạch Seakem GTG Agarose và Nusieve GTG Agarose (Cambrex Bio Science Rockland, Inc. USA). Đệm điện di: TAE 10x (Promega Corporation USA) Đặng Thị Kiều Oanh 13 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chất nhuộm sản phẩm điện di: ethidiumbromide Loading buffer (Novagen Co.) 100bp ladder (Markers) Novagen Co.. Các cặp mồi: Đề tài sử dụng các cặp mồi từ tài liệu tham khảo, đánh giá lại từng cặp, tạo tổ hợp các cặp mồi thoả mãn các yêu cầu nghiên cứu. Bảng 1 trình bày tên và trình tự các cặp mồi được sử dụng. Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên cứu [Error: Reference source not found,Error: Reference source not found,Error: Reference source not found,Error: Reference source not found] Loại gen Ký hiệu Trình tự Vị trí Sản phẩ m PCR (bp) 16SrDNA 195s & 5′ CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT 3′ 172195 294 489as2 5′ GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A3′ 469490 Gdh gdh1 &gdh2 5’AAG TTC CTC GGT TTT GAG CA3’ 631650 5’GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG3’ 11961177 566 Gdh Str2F 5’GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG3’ 11771196 Str2R 5’CCA TGG ACA GAT AAA GAT GG3’ 508527 688 Epf epfF 5’CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA3’ 24012419 744 epf –R 5’ AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG3’ 31433124 Suilysin SlyF 5’GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA3’ 115134 248 SlyR 5’CCG CGC AAT ACT GAT AAG C3’ 344362 Arginine arcAF 5’TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC3’ 12251244 118 deminase arcAR 5’GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG3’ 13421324 Protein được mrpF1 5’GAC AGA TGG TGA GGA AAA TGG3’ 188 giải phóng mrpF2 5’ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG3’ 36363655 bởi Đặng Thị Kiều Oanh 14 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học muramidase – mrpR 3823 3804 5’TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT3’ MRP Cấu trúc vỏ cps2JF 5’TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG3’ 1391813937 polysaccharide cps2JR 5’TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC3’ 1441514396 498 (typ HT) cps2JJF 5’ GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T3’ 498 cps2JJR 5’ CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C3’ 2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ Tủ ấm CO2; Máy đo DNA (nanodrop); Máy ủ nhiệt (Wise Therm) PCR Mastercycler epgradient S (Eppendorf) Máy điện di (Weal Tec) Máy chụp ảnh điện di (UVP) Các loại máy ly tâm: Máy ly tâm lạnh 14000 vòng (BioFuge)… Spin down (của Eppendorf và Nhật Bản) Lam kính và lá kính phủ Ống nghiệm 1.5 ml Eppendorf; ống chạy PCR 0,2ml Các loại đâu tip có màng lọc chuyên dụng cho SHPT Micropipet, Pipet Pasteur Que cấy 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm chứng dương và tạo mô hình thử nghiệm. 2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu: Cấy mới Tính chất bắt màu Gram Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield Xác định tính chất sinh học Đặng Thị Kiều Oanh 15 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mô hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis: Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng não cấp (được khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại (đây là dịch não tủy nền) Gặt vi khuẩn S. suis (đã được cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trường thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên. Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tính lại số vi khuẩn/ml (vì theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thì 1,5 x 108 tương đương độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5 Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp nhất (thường tương đương 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn S. suis tương đương là 1,21 x 107 vk/ µl Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc: + Chia nhỏ thể tích huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (0,1ml/1ống): để thực hiện mục đích“Xây dựng phương pháp xử lý dịch não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”. Pha các nồng độ vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần như sau + Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm ‘High Pure PCR product purification’ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lượng DNA thu được bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trình PCR đa mồi. 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn Yêu cầu về tổ hợp mồi: Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ít nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis Kích thước sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt được Có cùng nhiệt độ bắt cặp Khả năng cạnh tranh thấp Đạt độ nhạy và đặc hiệu Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác. Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm Tổ hợp Các loại mồi Đặng Thị Kiều Oanh 16 Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Đặc hiệu Typ huyết Enzym ly giải Enzym khác Protein ngoại bào cho S. suis thanh 2 tế bào Tổ hợp 1 16S rDNA Cps2J Sly Tổ hợp 2 16S rDNA Cps2J Sly arcA Tổ hợp 3 16S rDNA Cps2J Sly Mrp Tổ hợp 4 16SrDNA Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 5 Gdh Cps2J Sly Tổ hợp 6 Gdh Cps2J Sly arcA Tổ hợp 7 Gdh Cps2J Sly Mrp Tổ hợp 8 Gdh Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 9 Strep2 Cps2J Sly Tổ hợp 10 Strep2 Cps2J Sly arcA Tổ hợp 11 Strep2 Cps2J Sly Mrp Tổ hợp 12 Strep2 Cps2J Sly arcA mrp Tổ hợp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly Tổ hợp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA Tổ hợp 15 16S rDNA Cps2JJ Sly Mrp Tổ hợp 16 16SrDNA Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 17 Gdh Cps2JJ Sly Tổ hợp 18 Gdh Cps2JJ Sly arcA Tổ hợp 19 Gdh Cps2JJ Sly Mrp Tổ hợp 20 Gdh Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 21 Strep2 Cps2JJ Sly Tổ hợp 22 Strep2 Cps2JJ Sly arcA Tổ hợp 23 Strep2 Cps2JJ Sly Mrp Tổ hợp 24 Strep2 Cps2JJ Sly arcA Mrp Kỹ thuật sử dụng để đánh giá: Kỹ thuật PCR thông thường (đơn mồi và đa mồi đượ c xây dự ng trong đề tài) Kỹ thuật điện di 2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tính, thời gian biến tính, nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu trình nhiệt phụ... để chọn ra chương trình PCR đa mồi thích hợp với mục tiêu “phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến” Đặng Thị Kiều Oanh 17 Cao học K18

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.09: Bộ Luận Văn Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Quản Trị Kinh Doanh

81 tài liệu

1643 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.