intTypePromotion=1

Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC

Chia sẻ: ViAres2711 ViAres2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

0
14
lượt xem
0
download

Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15 exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năng của protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ cDNA GEN APC<br /> Đoàn Nam Khánh*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15<br /> exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năng<br /> của protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích<br /> thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC.<br /> Đối tượng và phương pháp: RNA tổng số được tách chiết bằng chloroform, isopropanol có bổ sung isogen<br /> và tổng hợp thành cDNA bằng phương pháp MMLV – RT. Sử dụng 10 cặp mồi để khuếch đại 15 exon của gen<br /> APC và giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.<br /> Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 61oC,<br /> độ nhạy của quy trình là 5 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự tương đồng với trình tự gen APC.<br /> Kết luận: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC.<br /> Từ khóa: Gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.<br /> ABSTRACT<br /> ESTABLISH THE PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING OF APC GENE<br /> Doan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 19 - No 5 - 2015: 189 - 193<br /> <br /> Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons located at<br /> 5q21-q22. The 2843 amino-acid APC protein plays an important role in regulating the Beta-catein growth signal<br /> factor. Mutations in APC gene make Beta-catenin accumulate and translocate from the cytoplasm to the nucleus,<br /> where it might serve as a transcriptional factor to stimulate tumour formation.<br /> Aim: Establish the protocol for sequencing cDNA APC gene.<br /> Materials and Methods: RNA was extracted by chloroform, isopropanol anh isogen. cDNA synthesized<br /> using MMLV –RT method. Fifteen exons of APC gene were ampliflied and sequenced using 10 pairs of primer<br /> and ABI system, respectively. Results were analysed with professsional software.<br /> Results: PCR for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at 61oC and<br /> the method has sensitivity of 5 ng /μL. Sequenced products are identical to standard sequence database of APC<br /> gene from NCBI genbank.<br /> Conclusion: We have successfully established the protocol for amplifying and identifying all sequences of<br /> APC gene.<br /> Key words: APC gene, RT-PCR, sequencing protocol.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ nằm tại vị trí 5q21-q22, trong đó exon 15 có<br /> kích thước rất lớn, bao gồm 6574 bp (base<br /> Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là pair), chiếm 75% của trình tự mã hóa protein.<br /> một gen ức chế khối u có tổng cộng 15 exon<br /> <br /> * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh<br /> ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com<br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 189<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Sản phẩm dịch mã của gen là protein APC, tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình giải<br /> gồm 2843 acid amin, kích thước khoảng 310 trình tự gen này.<br /> kDa. Protein APC tham gia vào phức hợp ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> phân hủy β-catenin. Các đột biến dòng mầm<br /> làm mất chức năng của protein APC sẽ làm β- Đối tượng nghiên cứu<br /> catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến<br /> kích hoạt yếu tố phiên mã TCF/LEF hoạt động, hành giải trình tự cDNA gen APC của 10 người<br /> kích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bình thường khỏe mạnh. Nội soi đại trực tràng<br /> bào dẫn đến ung thư5,1,4. Người mang gen không phát hiện polyp.<br /> APC bị đột biến sẽ mắc bệnh đa polyp tuyến Phương pháp nghiên cứu<br /> gia đình (hereditary familial adenomatous<br /> Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu<br /> polyposis: FAP) – là căn bệnh di truyền với biểu<br /> hiện lâm sàng là sự xuất hiện hàng trăm đến Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong<br /> hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, nếu ống chống đông bằng EDTA và được ly trích<br /> không được điều trị thì 100% bệnh nhân sẽ bị trong vòng 24 giờ. Sử dụng quy trình tách chiết<br /> ung thư đại trực tràng. Bên cạnh nguy cơ ung RNA tổng số bằng chloroform, isopropanol có<br /> thư đại trực tràng, bệnh còn làm gia tăng nguy bổ sung isogen nhằm tách chiết được mRNA có<br /> cơ mắc nhiều loại ung thư khác như ung thư chất lượng tốt. Tiến hành kiểm tra sản phẩm thu<br /> dạ dày, tá tràng, ung thư nguyên bào gan, ung được bằng phương pháp điện di trên gel agarose<br /> thư tụy, ung thư tuyến giáp. 0,8%, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy<br /> NanoDrop 2000.<br /> Các nghiên cứu trên thế giới đã tìm thấy<br /> khoảng trên 1000 đột biến khác nhau trên gene Kĩ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số<br /> APC gây bệnh FAP. Đa số là các đột biến điểm Sản phẩm RNA toàn phần sau khi tách chiết<br /> nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gene APC(3,7. được tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA<br /> Do đó, khi muốn xác định đột biến trên gen APC bằng phương pháp MMLV –RT. Sản phẩm<br /> ở mức độ DNA, chúng ta cần phải thiết kế 37 cặp cDNA sau đó được kiểm tra bằng cách thực hiện<br /> mồi. Việc này gây tốn kém cả về tài chính lẫn phản ứng PCR với cặp mồi của gen GADPH.<br /> thời gian. Trong khi đó, nếu chẩn đoán ở mức độ Phản ứng PCR khuếch đại các exon<br /> mRNA thì chỉ cần 10 cặp mồi đã có thể khuếch Các điều kiện cần tối ưu hóa là: nhiệt độ<br /> đại được toàn bộ chiều dài đoạn gene APC. lai, lượng bản mẫu/phản ứng để đạt kết quả<br /> Ngoài ra, ở mức độ mRNA cũng có thể phát hiện nhân bản tốt.<br /> cả những đột biến mất hay chèn toàn bộ exon,<br /> Kỹ thuật giải trình tự gen và phân tích kết quả<br /> cũng như không bỏ sót các đột biến xảy ra trong<br /> quá trình hoàn thiện mRNA. Sản phẩm PCR được tinh sạchvà giải trình tự<br /> từng đoạn gen được khuếch đại. Kết quả giải<br /> Việc phát hiện các đột biến ở gen APC rất<br /> trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC<br /> cần thiết để phát hiện và điều trị sớm ung thư.<br /> Main Workbench v5.5.<br /> Đột biến ở gen APC là đột biến gen trội di truyền<br /> nên người nhà của bệnh nhân bị đột biến gen KẾT QUẢ<br /> APC cũng cần xét nghiệm kiểm tra có bị đột biến Kết quả tách chiết RNA tổng số và kiểm tra<br /> gen này hay không để phòng tránh nguy cơ ung<br /> chất lượng cDNA<br /> thư và thực hiện các tư vấn di truyền nhằm hạn<br /> Nhận xét: khi điện di kiểm tra RNA tổng số<br /> chế sự lan truyền của gen đột biến trong cộng<br /> tách chiết trên gel agarose 0,8%, thấy rõ 2 vạch<br /> đồng. Hiện nay, ở Việt Nam, chưa có quy trình<br /> sáng của 28S rRNA và 18S rRNA tương đương<br /> giải trình tự cDNA gen APC. Do đó chúng tôi<br /> <br /> <br /> 190 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> với vạch 5kb và 2kb trên thang. Kết quả tỷ số Ở hai nhiệt độ bắt cặp 55 và 58oC đều có<br /> A260/A280 của các mẫu đều trong khoảng 2,0 – băng sản phẩm kí sinh chỉ ở amplicon 1. Từ<br /> 2,1 chứng tỏ chất lượng RNA tổng số tách bằng 61oC đã không còn sản phẩm kí sinh nhưng ở<br /> kit PAXgene Blood RNA Tubes đạt yêu cầu cho nhiệt độ 63 oC trở lên độ sáng của băng sản<br /> các thí nghiệm tiếp theo. Khi sử dụng cặp mồi phẩm giảm rõ rệt ở tất cả các mồi chứng tỏ<br /> GADPH F/R để kiểm tra chất lượng cDNA tổng lượng sản phẩm khuếch đại thấp. Chúng tôi<br /> hợp. Ta nhận thấy các mẫu cDNA được dùng lựa chọn nhiệt độ bắt cặp 61oC bởi vì đây là<br /> làm khuôn mẫu cho phản ứng đều cho sản nhiệt độ tối ưu đảm bảo độ đặc hiệu ở tất cả<br /> phẩm khuếch đại kích thước 350 bp. Băng sản các mồi trong phản ứng PCR, đồng thời đạt<br /> phẩm GADPH sáng rõ chứng tỏ cDNA tổng hợp được lượng sản phẩm PCR cao (Hình 2).<br /> tốt đảm bảo có thể sử dụng làm khuôn mẫu cho<br /> sản phẩm PCR giải trình tự (Hình 1).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di RNA tách chiết và kiểm tra<br /> chất lượng cDNA bằng mồi GADPH. 1A: Giếng T:<br /> Thang 1 Kb DNA; Giếng 1-3: Các mẫu RNA tách chiết.<br /> 1B: Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng 1-5: Sản phẩm Hình 2: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp. Giếng T:<br /> PCR gen GADPH Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1:<br /> Nhiệt độ 55oC; Giếng 2: Nhiệt độ 58oC; Giếng 3: Nhiệt độ<br /> Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp 61oC; Giếng 4: Nhiệt độ 63oC<br /> Chúng tôi khảo sát nhiệt độ bắt cặp ở 55oC, Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng<br /> 58oC, 61oC, 63oC cùng với một số điều kiện<br /> PCR<br /> như sau:<br /> Để khảo sát độ nhạy của quy trình chúng<br /> - Các thành phần phản ứng bao gồm: 1µl<br /> tôi sử dụng lần lượt các nồng độ cDNA bản<br /> mồi xuôi 10pmol, 1µl mồi ngược 10pmol, 2µl<br /> mẫu như sau 1,5,10,30,50,80,100ng/µl và tiến<br /> đệm PCR 10X, 2µl dNTP 2,5 mM, TakaraTaq<br /> hành lần lượt các phản ứng PCR với nhiệt độ<br /> 0,5U, cDNA genome bản mẫu 5µl trong tổng thể<br /> bắt cặp 61oC.<br /> tích 20 µl.<br /> Từ giếng 2 bắt đầu xuất hiện băng sản phẩm<br /> - Chu trình nhiệt: Biến tính ở 94oC trong 5<br /> mục tiêu và băng sản phẩm sáng rõ nét nhất ở<br /> phút, sau đó là 35-40 chu kỳ gồm 94oC trong 10<br /> giếng 7, điều đó chứng tỏ ngưỡng cDNA bản<br /> giây; 55oC/ 58oC/61oC/63oC trong 30 giây; 72oC<br /> mẫu mà quy trình có thể khuếch đại là 5ng/µl<br /> trong 1 phút, và giai đoạn kết thúc gồm 72oC<br /> (Hình 3).<br /> trong 5 phút.<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 191<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng.<br /> Hình 4: Kết quả PCR các exon Giếng T: Thang 1 Kb<br /> Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm;<br /> Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1-10: Sản phẩm<br /> Giếng 1: Nồng độ 1 ng/μl; Giếng 2: Nồng độ 5 ng/μl; Giếng<br /> PCR 15 exon<br /> 3: Nồng độ 10 ng/μl; Giếng 4: Nồng độ 30 ng/μl;Giếng 5:<br /> Nồng độ 50 ng/μl; Giếng 6: Nồng độ 80 ng/μl; Giếng 7: Kết quả giải trình tự<br /> Nồng độ 100 ng/μl; Sau khi đã có sản phẩm PCR, chúng tôi tiến<br /> Kết quả PCR các exon hành tinh sạch và giải trình tự. Kết quả giải trình<br /> Chúng tôi tiến hành thực hiện các phản ứng tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main<br /> PCR với 10 cặp mồi khuếch đại 15 exon của gen Workbench v5.5.<br /> APC với nhiệt độ bắt cặp 61oC. Kết quả giải trình tự và trình tự gen APC từ<br /> 10 băng sản phẩm PCR đều sáng rõ nét cơ sở dữ liệu NCBI có độ tương đồng 100%,<br /> chứng tỏ quy trình PCR khuếch đại các exon tốt, chứng tỏ chúng tôi đã xây dựng thành công quy<br /> có thể sử dụng sản phẩm PCR để tiến hành giải trình giải trình tự gen APC (Hình 5).<br /> trình tự (Hình 4).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Kết quả giải trình tự amplicon 6 thuộc exon 15 của gen APC<br /> BÀN LUẬN trong cơ thể, phổ biến là các bệnh ung thư<br /> đường tiêu hóa(1,4,6). Các nghiên cứu về đột biến<br /> APC là một gen ức chế khối u, gồm15 exon,<br /> gen APC đã tìm ra trên 1000 đột biến được công<br /> sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin(1,2,4). Đột<br /> bố trên cơ sở dữ liệu Leiden Open Variations<br /> biến dòng mầm trong gene sẽ làm mất chức<br /> Database (http://www.LOVD.nl). Hầu hết các<br /> năng protein APC, dẫn đến các bệnh liên quan<br /> <br /> <br /> 192 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> đột biến này là đột biến điểm nên giải trình tự là cứu tiếp theo để tìm kiếm và phân tích các đột<br /> phương pháp hiệu quả nhất để phát hiệu đột biến gen APC ở người Việt Nam.<br /> biến trên gen APC(5). KẾT LUẬN<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế<br /> Chúng tôi đã xây dựng thành công quy<br /> 10 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 15<br /> trình giải trình tự cDNA gen APC.Từ đó có<br /> exon của gen APC. Các mồi đều đảm bảo yêu<br /> thể ứng dụng trong phát hiện các đột biến ở<br /> cầu về các thông số lý thuyết. Trong quy trình<br /> gen APC ở bệnh nhân Việt Nam. Đây là bước<br /> giải trình tự cDNA thì bước tách chiết RNA và<br /> quan trọng không chỉ trong chẩn đoán mà còn<br /> tổng hợp cDNA là khâu quan trọng nhất. Khi sử<br /> trong tầm soát những đối tượng có yếu tố<br /> dụng quy trình tách chiết RNA tổng số thông<br /> nguy cơ cao.<br /> thường có bổ sung isogen trong việc phá vỡ tế<br /> bào và quy trình MMLV – RT trong tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> cDNA thì cho sản phẩm mRNA tách chiết, sản 1. Benchabane H, Ahmed Y (2009), “The adenomatous polyposis<br /> coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of<br /> phẩm cDNA có chất lượng cao. apoptosis”, Adv Exp Med Biol, 656:75-84. 2<br /> Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp cũng là một 2. Half E, Bercovich D and Rozen P (2009), “Familial<br /> adenomatous polyposis”, Orphanet J Rare Dis, 4: 22. 3<br /> thông số vô cùng quan trọng cho phản ứng PCR. 3. Laurent-Puig P, Béroud C, Soussi T (1998), “APC gene:<br /> Vì thế chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm các database of germline and somatic mutations in human tumors<br /> and cell lines”, Nucleic Acids Res, 26:269–270 4<br /> nhiệt độ bắt cặp theo dải nhiệt độ từ 55 đến 63oC,<br /> 4. Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY,<br /> kết quả chúng tôi đã lựa chọn được nhiệt độ bắt Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987),<br /> cặp tối ưu là 61oC đảm bảo yêu cầu về độ đặc “The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of<br /> chromosome 5”, Science, 238(4832):1411-3. 5<br /> hiệu của phản ứng PCR và lượng sản phẩm 5. Plawski A, Slomski R (2009), “APC gene mutations causing<br /> khuếch đại. Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát familial adenomatous polyposis in Polish patients”, J Appl<br /> độ nhạy của quy trình, kết quả PCR cho thấy Genet, 49(4): 407–414. 1<br /> 6. Powell SM., Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton<br /> quy trình của chúng tôi có độ nhạy khá cao, có SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992), “APC<br /> thể thực hiện với nồng cDNA từ 5ng/µl trở lên. mutations occur early during colorectal tumorigenesis”,<br /> Nature, 359: 235-237. 6<br /> Khi so sánh kết quả sản phẩm giải trình tự 7. Yang J, Zhang W, Evans PM, Chen X, He X, Liu C (2006),<br /> với trình tự gen APC lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI, “Adenomatous polyposis coli (APC) differentially regulates<br /> beta-catenin phosphorylation and ubiquitination in colon<br /> kết quả các trình tự này hoàn toàn tương đồng<br /> cancer cells”, J. Biol. Chem, 281: 17751-17757. 7<br /> với nhau. Điều này khẳng định quy trình giải<br /> trình tự cDNA gen APC đã được chúng tôi xây<br /> dựng thành công. Với quy trình đã xây dựng Ngày nhận bài báo: 17/8/2015<br /> được, chúng tôi có thể thực hiện các bước nghiên Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/9/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 20/10/2015<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 193<br />
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2