Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ cDNA GEN APC<br /> Đoàn Nam Khánh*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15<br /> exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năng<br /> của protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích<br /> thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC.<br /> Đối tượng và phương pháp: RNA tổng số được tách chiết bằng chloroform, isopropanol có bổ sung isogen<br /> và tổng hợp thành cDNA bằng phương pháp MMLV – RT. Sử dụng 10 cặp mồi để khuếch đại 15 exon của gen<br /> APC và giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.<br /> Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 61oC,<br /> độ nhạy của quy trình là 5 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự tương đồng với trình tự gen APC.<br /> Kết luận: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC.<br /> Từ khóa: Gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.<br /> ABSTRACT<br /> ESTABLISH THE PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING OF APC GENE<br /> Doan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 19 - No 5 - 2015: 189 - 193<br /> <br /> Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons located at<br /> 5q21-q22. The 2843 amino-acid APC protein plays an important role in regulating the Beta-catein growth signal<br /> factor. Mutations in APC gene make Beta-catenin accumulate and translocate from the cytoplasm to the nucleus,<br /> where it might serve as a transcriptional factor to stimulate tumour formation.<br /> Aim: Establish the protocol for sequencing cDNA APC gene.<br /> Materials and Methods: RNA was extracted by chloroform, isopropanol anh isogen. cDNA synthesized<br /> using MMLV –RT method. Fifteen exons of APC gene were ampliflied and sequenced using 10 pairs of primer<br /> and ABI system, respectively. Results were analysed with professsional software.<br /> Results: PCR for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at 61oC and<br /> the method has sensitivity of 5 ng /μL. Sequenced products are identical to standard sequence database of APC<br /> gene from NCBI genbank.<br /> Conclusion: We have successfully established the protocol for amplifying and identifying all sequences of<br /> APC gene.<br /> Key words: APC gene, RT-PCR, sequencing protocol.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ nằm tại vị trí 5q21-q22, trong đó exon 15 có<br /> kích thước rất lớn, bao gồm 6574 bp (base<br /> Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là pair), chiếm 75% của trình tự mã hóa protein.<br /> một gen ức chế khối u có tổng cộng 15 exon<br /> <br /> * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh<br /> ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com<br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 189<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Sản phẩm dịch mã của gen là protein APC, tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình giải<br /> gồm 2843 acid amin, kích thước khoảng 310 trình tự gen này.<br /> kDa. Protein APC tham gia vào phức hợp ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> phân hủy β-catenin. Các đột biến dòng mầm<br /> làm mất chức năng của protein APC sẽ làm β- Đối tượng nghiên cứu<br /> catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến<br /> kích hoạt yếu tố phiên mã TCF/LEF hoạt động, hành giải trình tự cDNA gen APC của 10 người<br /> kích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bình thường khỏe mạnh. Nội soi đại trực tràng<br /> bào dẫn đến ung thư5,1,4. Người mang gen không phát hiện polyp.<br /> APC bị đột biến sẽ mắc bệnh đa polyp tuyến Phương pháp nghiên cứu<br /> gia đình (hereditary familial adenomatous<br /> Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu<br /> polyposis: FAP) – là căn bệnh di truyền với biểu<br /> hiện lâm sàng là sự xuất hiện hàng trăm đến Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong<br /> hàng ngàn polyp trong đại trực tràng, nếu ống chống đông bằng EDTA và được ly trích<br /> không được điều trị thì 100% bệnh nhân sẽ bị trong vòng 24 giờ. Sử dụng quy trình tách chiết<br /> ung thư đại trực tràng. Bên cạnh nguy cơ ung RNA tổng số bằng chloroform, isopropanol có<br /> thư đại trực tràng, bệnh còn làm gia tăng nguy bổ sung isogen nhằm tách chiết được mRNA có<br /> cơ mắc nhiều loại ung thư khác như ung thư chất lượng tốt. Tiến hành kiểm tra sản phẩm thu<br /> dạ dày, tá tràng, ung thư nguyên bào gan, ung được bằng phương pháp điện di trên gel agarose<br /> thư tụy, ung thư tuyến giáp. 0,8%, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy<br /> NanoDrop 2000.<br /> Các nghiên cứu trên thế giới đã tìm thấy<br /> khoảng trên 1000 đột biến khác nhau trên gene Kĩ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số<br /> APC gây bệnh FAP. Đa số là các đột biến điểm Sản phẩm RNA toàn phần sau khi tách chiết<br /> nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gene APC(3,7. được tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA<br /> Do đó, khi muốn xác định đột biến trên gen APC bằng phương pháp MMLV –RT. Sản phẩm<br /> ở mức độ DNA, chúng ta cần phải thiết kế 37 cặp cDNA sau đó được kiểm tra bằng cách thực hiện<br /> mồi. Việc này gây tốn kém cả về tài chính lẫn phản ứng PCR với cặp mồi của gen GADPH.<br /> thời gian. Trong khi đó, nếu chẩn đoán ở mức độ Phản ứng PCR khuếch đại các exon<br /> mRNA thì chỉ cần 10 cặp mồi đã có thể khuếch Các điều kiện cần tối ưu hóa là: nhiệt độ<br /> đại được toàn bộ chiều dài đoạn gene APC. lai, lượng bản mẫu/phản ứng để đạt kết quả<br /> Ngoài ra, ở mức độ mRNA cũng có thể phát hiện nhân bản tốt.<br /> cả những đột biến mất hay chèn toàn bộ exon,<br /> Kỹ thuật giải trình tự gen và phân tích kết quả<br /> cũng như không bỏ sót các đột biến xảy ra trong<br /> quá trình hoàn thiện mRNA. Sản phẩm PCR được tinh sạchvà giải trình tự<br /> từng đoạn gen được khuếch đại. Kết quả giải<br /> Việc phát hiện các đột biến ở gen APC rất<br /> trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC<br /> cần thiết để phát hiện và điều trị sớm ung thư.<br /> Main Workbench v5.5.<br /> Đột biến ở gen APC là đột biến gen trội di truyền<br /> nên người nhà của bệnh nhân bị đột biến gen KẾT QUẢ<br /> APC cũng cần xét nghiệm kiểm tra có bị đột biến Kết quả tách chiết RNA tổng số và kiểm tra<br /> gen này hay không để phòng tránh nguy cơ ung<br /> chất lượng cDNA<br /> thư và thực hiện các tư vấn di truyền nhằm hạn<br /> Nhận xét: khi điện di kiểm tra RNA tổng số<br /> chế sự lan truyền của gen đột biến trong cộng<br /> tách chiết trên gel agarose 0,8%, thấy rõ 2 vạch<br /> đồng. Hiện nay, ở Việt Nam, chưa có quy trình<br /> sáng của 28S rRNA và 18S rRNA tương đương<br /> giải trình tự cDNA gen APC. Do đó chúng tôi<br /> <br /> <br /> 190 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> với vạch 5kb và 2kb trên thang. Kết quả tỷ số Ở hai nhiệt độ bắt cặp 55 và 58oC đều có<br /> A260/A280 của các mẫu đều trong khoảng 2,0 – băng sản phẩm kí sinh chỉ ở amplicon 1. Từ<br /> 2,1 chứng tỏ chất lượng RNA tổng số tách bằng 61oC đã không còn sản phẩm kí sinh nhưng ở<br /> kit PAXgene Blood RNA Tubes đạt yêu cầu cho nhiệt độ 63 oC trở lên độ sáng của băng sản<br /> các thí nghiệm tiếp theo. Khi sử dụng cặp mồi phẩm giảm rõ rệt ở tất cả các mồi chứng tỏ<br /> GADPH F/R để kiểm tra chất lượng cDNA tổng lượng sản phẩm khuếch đại thấp. Chúng tôi<br /> hợp. Ta nhận thấy các mẫu cDNA được dùng lựa chọn nhiệt độ bắt cặp 61oC bởi vì đây là<br /> làm khuôn mẫu cho phản ứng đều cho sản nhiệt độ tối ưu đảm bảo độ đặc hiệu ở tất cả<br /> phẩm khuếch đại kích thước 350 bp. Băng sản các mồi trong phản ứng PCR, đồng thời đạt<br /> phẩm GADPH sáng rõ chứng tỏ cDNA tổng hợp được lượng sản phẩm PCR cao (Hình 2).<br /> tốt đảm bảo có thể sử dụng làm khuôn mẫu cho<br /> sản phẩm PCR giải trình tự (Hình 1).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di RNA tách chiết và kiểm tra<br /> chất lượng cDNA bằng mồi GADPH. 1A: Giếng T:<br /> Thang 1 Kb DNA; Giếng 1-3: Các mẫu RNA tách chiết.<br /> 1B: Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng 1-5: Sản phẩm Hình 2: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp. Giếng T:<br /> PCR gen GADPH Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1:<br /> Nhiệt độ 55oC; Giếng 2: Nhiệt độ 58oC; Giếng 3: Nhiệt độ<br /> Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp 61oC; Giếng 4: Nhiệt độ 63oC<br /> Chúng tôi khảo sát nhiệt độ bắt cặp ở 55oC, Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng<br /> 58oC, 61oC, 63oC cùng với một số điều kiện<br /> PCR<br /> như sau:<br /> Để khảo sát độ nhạy của quy trình chúng<br /> - Các thành phần phản ứng bao gồm: 1µl<br /> tôi sử dụng lần lượt các nồng độ cDNA bản<br /> mồi xuôi 10pmol, 1µl mồi ngược 10pmol, 2µl<br /> mẫu như sau 1,5,10,30,50,80,100ng/µl và tiến<br /> đệm PCR 10X, 2µl dNTP 2,5 mM, TakaraTaq<br /> hành lần lượt các phản ứng PCR với nhiệt độ<br /> 0,5U, cDNA genome bản mẫu 5µl trong tổng thể<br /> bắt cặp 61oC.<br /> tích 20 µl.<br /> Từ giếng 2 bắt đầu xuất hiện băng sản phẩm<br /> - Chu trình nhiệt: Biến tính ở 94oC trong 5<br /> mục tiêu và băng sản phẩm sáng rõ nét nhất ở<br /> phút, sau đó là 35-40 chu kỳ gồm 94oC trong 10<br /> giếng 7, điều đó chứng tỏ ngưỡng cDNA bản<br /> giây; 55oC/ 58oC/61oC/63oC trong 30 giây; 72oC<br /> mẫu mà quy trình có thể khuếch đại là 5ng/µl<br /> trong 1 phút, và giai đoạn kết thúc gồm 72oC<br /> (Hình 3).<br /> trong 5 phút.<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 191<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng.<br /> Hình 4: Kết quả PCR các exon Giếng T: Thang 1 Kb<br /> Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm;<br /> Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1-10: Sản phẩm<br /> Giếng 1: Nồng độ 1 ng/μl; Giếng 2: Nồng độ 5 ng/μl; Giếng<br /> PCR 15 exon<br /> 3: Nồng độ 10 ng/μl; Giếng 4: Nồng độ 30 ng/μl;Giếng 5:<br /> Nồng độ 50 ng/μl; Giếng 6: Nồng độ 80 ng/μl; Giếng 7: Kết quả giải trình tự<br /> Nồng độ 100 ng/μl; Sau khi đã có sản phẩm PCR, chúng tôi tiến<br /> Kết quả PCR các exon hành tinh sạch và giải trình tự. Kết quả giải trình<br /> Chúng tôi tiến hành thực hiện các phản ứng tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main<br /> PCR với 10 cặp mồi khuếch đại 15 exon của gen Workbench v5.5.<br /> APC với nhiệt độ bắt cặp 61oC. Kết quả giải trình tự và trình tự gen APC từ<br /> 10 băng sản phẩm PCR đều sáng rõ nét cơ sở dữ liệu NCBI có độ tương đồng 100%,<br /> chứng tỏ quy trình PCR khuếch đại các exon tốt, chứng tỏ chúng tôi đã xây dựng thành công quy<br /> có thể sử dụng sản phẩm PCR để tiến hành giải trình giải trình tự gen APC (Hình 5).<br /> trình tự (Hình 4).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Kết quả giải trình tự amplicon 6 thuộc exon 15 của gen APC<br /> BÀN LUẬN trong cơ thể, phổ biến là các bệnh ung thư<br /> đường tiêu hóa(1,4,6). Các nghiên cứu về đột biến<br /> APC là một gen ức chế khối u, gồm15 exon,<br /> gen APC đã tìm ra trên 1000 đột biến được công<br /> sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin(1,2,4). Đột<br /> bố trên cơ sở dữ liệu Leiden Open Variations<br /> biến dòng mầm trong gene sẽ làm mất chức<br /> Database (http://www.LOVD.nl). Hầu hết các<br /> năng protein APC, dẫn đến các bệnh liên quan<br /> <br /> <br /> 192 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> đột biến này là đột biến điểm nên giải trình tự là cứu tiếp theo để tìm kiếm và phân tích các đột<br /> phương pháp hiệu quả nhất để phát hiệu đột biến gen APC ở người Việt Nam.<br /> biến trên gen APC(5). KẾT LUẬN<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế<br /> Chúng tôi đã xây dựng thành công quy<br /> 10 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 15<br /> trình giải trình tự cDNA gen APC.Từ đó có<br /> exon của gen APC. Các mồi đều đảm bảo yêu<br /> thể ứng dụng trong phát hiện các đột biến ở<br /> cầu về các thông số lý thuyết. Trong quy trình<br /> gen APC ở bệnh nhân Việt Nam. Đây là bước<br /> giải trình tự cDNA thì bước tách chiết RNA và<br /> quan trọng không chỉ trong chẩn đoán mà còn<br /> tổng hợp cDNA là khâu quan trọng nhất. Khi sử<br /> trong tầm soát những đối tượng có yếu tố<br /> dụng quy trình tách chiết RNA tổng số thông<br /> nguy cơ cao.<br /> thường có bổ sung isogen trong việc phá vỡ tế<br /> bào và quy trình MMLV – RT trong tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> cDNA thì cho sản phẩm mRNA tách chiết, sản 1. Benchabane H, Ahmed Y (2009), “The adenomatous polyposis<br /> coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of<br /> phẩm cDNA có chất lượng cao. apoptosis”, Adv Exp Med Biol, 656:75-84. 2<br /> Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp cũng là một 2. Half E, Bercovich D and Rozen P (2009), “Familial<br /> adenomatous polyposis”, Orphanet J Rare Dis, 4: 22. 3<br /> thông số vô cùng quan trọng cho phản ứng PCR. 3. Laurent-Puig P, Béroud C, Soussi T (1998), “APC gene:<br /> Vì thế chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm các database of germline and somatic mutations in human tumors<br /> and cell lines”, Nucleic Acids Res, 26:269–270 4<br /> nhiệt độ bắt cặp theo dải nhiệt độ từ 55 đến 63oC,<br /> 4. Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY,<br /> kết quả chúng tôi đã lựa chọn được nhiệt độ bắt Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987),<br /> cặp tối ưu là 61oC đảm bảo yêu cầu về độ đặc “The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of<br /> chromosome 5”, Science, 238(4832):1411-3. 5<br /> hiệu của phản ứng PCR và lượng sản phẩm 5. Plawski A, Slomski R (2009), “APC gene mutations causing<br /> khuếch đại. Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát familial adenomatous polyposis in Polish patients”, J Appl<br /> độ nhạy của quy trình, kết quả PCR cho thấy Genet, 49(4): 407–414. 1<br /> 6. Powell SM., Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton<br /> quy trình của chúng tôi có độ nhạy khá cao, có SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992), “APC<br /> thể thực hiện với nồng cDNA từ 5ng/µl trở lên. mutations occur early during colorectal tumorigenesis”,<br /> Nature, 359: 235-237. 6<br /> Khi so sánh kết quả sản phẩm giải trình tự 7. Yang J, Zhang W, Evans PM, Chen X, He X, Liu C (2006),<br /> với trình tự gen APC lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI, “Adenomatous polyposis coli (APC) differentially regulates<br /> beta-catenin phosphorylation and ubiquitination in colon<br /> kết quả các trình tự này hoàn toàn tương đồng<br /> cancer cells”, J. Biol. Chem, 281: 17751-17757. 7<br /> với nhau. Điều này khẳng định quy trình giải<br /> trình tự cDNA gen APC đã được chúng tôi xây<br /> dựng thành công. Với quy trình đã xây dựng Ngày nhận bài báo: 17/8/2015<br /> được, chúng tôi có thể thực hiện các bước nghiên Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/9/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 20/10/2015<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 193<br />