intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

90
lượt xem
6
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng thành công quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C19. Đối tượng và phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua da tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19<br /> Triệu Tiến Sang*; Đào Văn Đôn*; Trần Văn Khoa*<br /> Trương Ngọc Nam*; Lê Thị Hải Yến*; Nguyễn Hoàng Hiệp**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng thành công quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C19. Đối tượng và<br /> phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua<br /> da tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103. Sử dụng phương pháp giải trình tự gen dựa trên<br /> nguyên lý của Sanger. Kết quả: đã phát hiện các đa hình của gen CYP2C19. Kết luận: đã xây<br /> dựng thành công quy trình xác định đa hình gen CYP2C19.<br /> * Từ khóa: Gen CY2C19; Đặt stent động mạch vành; Giải trình tự gen.<br /> <br /> Construction of Protocol for Screening CYP2C19 Polymophism Gene<br /> Summary<br /> Objectives: To construct successfully protocol screening CYP2C19 polymorphism gene.<br /> Subjects and methods: 10 patients with venous blood transfusions were placed at Department<br /> of Cardiology, 103 Hospital using a sequencing method based on Sanger's principle. Results:<br /> CYP2C19 polymorphism was detected. Conclusion: CYP2C19 gene polymorphism has been<br /> successfully established.<br /> * Keywords: Gene CYP2C19; Coronary stent; Sequencing.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cytochrome - P450 - 2C19 (CYP2C19)<br /> là một enzym thuộc siêu họ cytochrom<br /> P450, tham gia vào quá trình chuyển hóa<br /> các chất ngoại lai, bao gồm các thuốc<br /> kháng tiểu cầu như clopidogrel, thuốc<br /> chống động kinh, mephenytoin, omeprazol,<br /> diazepam và một số loại thuốc an thần...<br /> Khả năng chuyển hóa của CYP2C19 có<br /> thể được phân loại như sau: chuyển hóa<br /> siêu nhanh, chuyển hóa bình thường,<br /> chuyển hóa trung gian, hoặc chuyển hóa<br /> <br /> kém. Điều này dẫn đến có sự khác nhau<br /> trong phản ứng chuyển hóa thuốc và đáp<br /> ứng giữa các cá thể.<br /> Clopidogrel là một tiền thuốc chưa có<br /> tác dụng, sau quá trình chuyển hóa bởi<br /> CYP2C19 ở gan, clopidogrel sẽ được<br /> chuyển hóa thành chất có tác dụng chống<br /> kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa cục máu<br /> đông và giảm hình thành huyết khối.<br /> Việc xác định được kiểu gen CYP2C19<br /> có vai trò rất quan trọng trong tiên lượng đáp<br /> ứng thuốc, đặc biệt những thuốc chịu sự<br /> chuyển hóa qua enzym này như clopidogrel.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 02/06/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/09/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/09/2017<br /> <br /> 45<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Một số hướng dẫn điều trị về can thiệp<br /> tim mạch đã đề cập đến việc cần làm xét<br /> nghiệm gen CYP2C19 trước khi chỉ định<br /> dùng clopidogrel. Để làm được điều đó,<br /> mỗi phòng thí nghiệm cần tối ưu hóa quy<br /> trình, ổn định điều kiện thí nghiệm trước<br /> khi áp dụng quy trình một cách thường quy.<br /> Với mong muốn đưa ra quy trình xác<br /> định kiểu gen CYP2C19, góp phần nâng<br /> cao hiệu quả điều trị, giảm biến chứng và<br /> nâng cao chất lượng cuộc sống người<br /> bệnh, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này<br /> nhằm: Xây dựng quy trình xác định đa<br /> hình gen CYP2C19.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 10 mẫu máu tĩnh mạch của BN sau đặt<br /> stent động mạch vành qua da tại Khoa<br /> Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103.<br /> Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí<br /> nghiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền Y<br /> học, Học viện Quân y.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Áp dụng phương pháp giải trình tự<br /> dựa trên nguyên lý Sanger, tiến hành<br /> theo 7 bước:<br /> - Xử lý mẫu.<br /> - Tách chiết ADN tổng số.<br /> - Kiểm tra chất lượng ADN tổng số.<br /> - Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP:<br /> CYP2C19*2, CYP2C19*3.<br /> - Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR.<br /> - Tinh sạch, giải trình tự.<br /> - Phân tích, đánh giá kết quả.<br /> * Xử lý mẫu:<br /> Cách lấy mẫu: lấy 4 ml máu từ tĩnh<br /> mạch BN vào ống lấy mẫu EDTA sau đặt<br /> 46<br /> <br /> sten động mạch vành qua da, đảm bảo<br /> không nhiễm khuẩn, ký hiệu mẫu và bảo<br /> quản ở điều kiện -4OC.<br /> * Tách chiết ADN tổng số:<br /> Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood<br /> ADN mini kit để tách ADN tổng số.<br /> Nguyên lý của kít này dựa trên sự hấp<br /> thụ chọn lọc của axít nucleic vào màng<br /> silica-gel trong điều kiện nhất định với 4<br /> giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải<br /> phóng ADN; ADN liên kết với màng silicagel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel<br /> với Wash Buffer; thu ADN.<br /> * Kiểm tra chất lượng ADN tổng số:<br /> Nguyên lý: phương pháp điện di dựa<br /> trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức<br /> kéo của điện trường tác động vào phân<br /> tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền.<br /> Sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện<br /> và tạo điện trường đề. Bản gel giúp phân<br /> tách các phân tử và thuốc nhuộm khác<br /> nhau để phát hiện vị trí phân tử trên gel<br /> sau khi điện di. Tốc độ di chuyển của<br /> ADN trong điện trường phụ thuộc vào<br /> kích thước đoạn ADN, điện tích, mức độ<br /> xoắn và dạng phân tử. Như vậy, so sánh<br /> kích thước các mẫu ADN với thang chuẩn<br /> sẽ đánh giá được chất lượng ADN.<br /> * Khuếch đại đoạn gen chứa SNP<br /> quan tâm:<br /> Nguyên lý: sử dụng kỹ thuật PCR để<br /> khuếch đại ADN. Dùng enzym polymerase<br /> để tổng hợp ADN mới từ 1 ADN khuôn<br /> ban đầu. Thành phần chính của phản<br /> ứng gồm: ADN khuôn, mồi, dung dịch<br /> đệm, 4 loại deoxyrinucleotid triphosphate<br /> (dNTP), ADN polymerase. Với 3 giai đoạn<br /> chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn<br /> mồi và giai đoạn kéo dài.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> * Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR:<br /> Sử dụng phương pháp điện di, nguyên<br /> lý và cách tiến hành tương tự như điện di<br /> kiểm tra chất lượng ADN sau khi tách<br /> chiết. Điện di trên giá thể là agarose pha<br /> trong đệm TAE 1X.<br /> * Tinh sạch và giải trình tự ADN:<br /> Nguyên lý: phương pháp giải trình tự<br /> Sanger dựa vào hoạt động của enzym ADN<br /> <br /> polymerase và dideoxynucleotid (ddNTP)<br /> tham gia vào quá trình tổng hợp ADN. Khi<br /> ADN polymerase xúc tác kéo dài mạch<br /> ADN mới gặp nucleotid không có nhóm<br /> 3’OH (dideoxynucleotid), phản ứng tổng<br /> hợp dừng lại và tạo ra các đoạn ADN<br /> chênh lệch nhau 1 nucleotid. Điện di đoạn<br /> ADN giúp xác định được trình tự ADN [3].<br /> * Phân tích kết quả: dựa trên phần<br /> mềm BioEdit.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả tách chiết ADN.<br /> Bảng 1:<br /> Mẫu<br /> <br /> Nồng độ ADN (ng/µl)<br /> <br /> A260/A280<br /> <br /> 1<br /> <br /> 19,42<br /> <br /> 1,7<br /> <br /> 2<br /> <br /> 25,62<br /> <br /> 1,8<br /> <br /> 3<br /> <br /> 19,49<br /> <br /> 1,85<br /> <br /> 4<br /> <br /> 19,33<br /> <br /> 2,72<br /> <br /> 5<br /> <br /> 27,9<br /> <br /> 1,79<br /> <br /> 6<br /> <br /> 26,24<br /> <br /> 1,9<br /> <br /> 7<br /> <br /> 19,6<br /> <br /> 2,03<br /> <br /> 8<br /> <br /> 22,51<br /> <br /> 2,13<br /> <br /> 9<br /> <br /> 24,1<br /> <br /> 2,04<br /> <br /> 10<br /> <br /> 30,98<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> Nồng độ ADN trung bình 26.874 ng/µl. Tỷ lệ A260/A280 trung bình 1.923 (trong<br /> khoảng 1,8 - 2), nhìn chung dịch chiết ADN sạch và đủ nồng độ cho các nghiên cứu<br /> tiếp theo.<br /> 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR.<br /> Chúng tôi đã thiết kế được 2 cặp mồi dùng để xác định đa hình gen CYP2C19*2 và<br /> CYP2C19*3, đã tối ưu được thời gian và nhiệt độ phản ứng của 2 cặp mồi.<br /> CYP*2-F: 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’<br /> CYP*2-R: 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’<br /> CYP*3-F: 5’- AAATTGTTTCCAACATTTAGCT-3’<br /> CYP*3-R: 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’<br /> Chu trình nhiệt phản ứng: 96oC - 1 phút, 25 chu kỳ [96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây,<br /> 60 C - 4 phút], 4oC.<br /> o<br /> <br /> 47<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Thành phần phản ứng: master mix (promega): 12,5 µl; primer F: 0,5 µl; primer R:<br /> 0,5 µl; nước deion: 6,5 µl; ADN 5 µl.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR.<br /> (a) Gen CYP2C19*2<br /> <br /> Gen CYP2C19*3<br /> <br /> (F-/F+: các đối chứng âm/dương; M: Marker; 01 - 06: thứ tự các mẫu)<br /> Các mẫu có chất lượng tốt cho băng điện di sáng, rõ, có 1 băng duy nhất tương<br /> ứng với băng 140 bp (*2), 240 bp (*3). Đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào,<br /> chứng tỏ kết quả PCR đáng tin cậy.<br /> 3. Kết quả giải trình tự gen CYP2C19.<br /> * Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2:<br /> <br /> Hình 2: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 3.<br /> Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy<br /> định chuyển hóa bình thường.<br /> <br /> Hình 3: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 1.<br /> Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*2 quy định chuyển<br /> hóa trung bình.<br /> 48<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> <br /> Hình 4: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 5.<br /> Không xuất hiện tín hiệu G, chỉ có tín hiệu A, gen đồng hợp với kiểu gen *2/*2 quy<br /> định chuyển hóa kém.<br /> * Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3:<br /> <br /> Hình 5: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 1.<br /> Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy<br /> định chuyển hóa bình thường.<br /> <br /> Hình 6: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 6.<br /> Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*3 quy định chuyển<br /> hóa trung bình.<br /> 49<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2