Báo cáo khoa học: Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H. pumilio với các loài sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (Internal Transcribed Spacer)

Chia sẻ: Nguyễn Phi Nhung Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

127
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sán lá ruột nhỏ (Haplorchis spp.) thuộc họ Heterophyidae th-ờng ký sinh trong ruột non của ng-ời, gia súc v# gia cầm (Yamaguti, 1958; Pear, 1964; Cheng, 1974; Pearson, 1982). Ng-ời v# các động vật trên cạn nhiễm lo#i sán n#y do ăn gỏi, ăn lẩu hoặc ăn cá sống có chứa ấu trùng metacercariae. Ng-ời v# động vật trên cạn nhiễm sán lá ruột nhỏ với số l-ợng lớn th-ờng có biểu hiện đau đầu, buồn nôn, viêm ruột v# ỉa chảy. Tác hại trực tiếp của lo#i sán n#y đối với ng-ời v# động vật không lớn nh-ng khi sán ký sinh tạo các vết loét l# cửa ngõ cho...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo khoa học: Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H. pumilio với các loài sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (Internal Transcribed Spacer)

Báo cáo khoa học: Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H. pumilio với các loài sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (Internal Transcribed Spacer)
Ph©n biÖt s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis taichui vµ H. pumilio víi c¸c loµi s¸n l¸ kh¸c sö dông chØ thÞ ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) Discrimination of tiny trenmatodes (Haplorchis taichui and H. pumilio) to other species using ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) markers Kim V¨n V¹n1,3, Lª Thanh Hßa2, NguyÔn ThÞ BÝch Nga2, NguyÔn ThÞ TuyÕt Nhung2 v Anders Dalgaard3 SUMMARY Haplorchis spp are tiny trematodes can be found in the small intestines of various definitive hosts such as human, birds, cats, dogs and rats. Human and other definitive hosts are infected by eating raw freshwater fishes containing encysted metacercariae. Haplorchis spp. is not easy to discriminate from other trematodes due to their minute size, similar morphology of eggs, cercaria, metacercaria and adult worm. A molecular method, for the first time in Vietnam, was applied to identify H. pumilio and H. taichui based on amplification of ITS-2 using forward primer, 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ and reverse primer BD2R: 5'- TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3-BD2R) with annealing at 50oC in the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing for analyzing the nucleotide composition. Samples including adult worm and metacercariae were collected on human and fish in NamDinh province, Vietnam and Bangkok, Thailand. The length of ITS-2 specific for H. taichui is 446bp; and for H. pumilio is 290bp. ITS-2 sequence in H. taichui was found longer than that in H. pumilio, due to the insertion of 154 nucleotides between nucleotide 198 and 352. There was high identity rate (99- 100%) of nucleotides in the ITS-2 gene in H. taichui and H. pumilii of Vietnamese and Thai collected sample, respectively. Key words: Haplorchis spp, H. taichui, H. pumilio, PCR, identity. x©m nhËp v o c¬ thÓ. Haplorchis spp. l lo¹i 1. §Æt vÊn ®Ò ký sinh trïng g©y ra bÖnh truyÒn l©y gi÷a S¸n l¸ ruét nhá (Haplorchis spp.) thuéc ®éng vËt d−íi n−íc (c¸) v ®éng vËt trªn c¹n hä Heterophyidae th−êng ký sinh trong ruét (Fish-born parasites, FZP). Khi c¸ nhiÔm c¸c non cña ng−êi, gia sóc v gia cÇm (Yamaguti, lo¹i Êu trïng n y th−êng bÞ gi¶m chÊt l−îng 1958; Pear, 1964; Cheng, 1974; Pearson, s¶n phÈm v gi¶m gi¸ trÞ h ng ho¸, ®Æc biÖt 1982). Ng−êi v c¸c ®éng vËt trªn c¹n nhiÔm khi s¶n phÈm thñy s¶n ®−îc xuÊt khÈu sang lo i s¸n n y do ¨n gái, ¨n lÈu hoÆc ¨n c¸ sèng c¸c thÞ tr−êng khã tÝnh nh− ch©u ¢u, Mü v cã chøa Êu trïng metacercariae. Ng−êi v NhËt B¶n. ®éng vËt trªn c¹n nhiÔm s¸n l¸ ruét nhá víi sè l−îng lín th−êng cã biÓu hiÖn ®au ®Çu, Trong mét tÕ b o cña c¬ thÓ ®éng vËt buån n«n, viªm ruét v Øa ch¶y. T¸c h¹i trùc lu«n tån t¹i 2 hÖ gen: hÖ gen nh©n tÕ b o v hÖ tiÕp cña lo i s¸n n y ®èi víi ng−êi v ®éng gen ty thÓ, hai hÖ gen n y ho¹t ®éng cã tÝnh vËt kh«ng lín nh−ng khi s¸n ký sinh t¹o c¸c chÊt võa ®éc lËp võa t−¬ng t¸c v hÖ gen ty thÓ vÕt loÐt l cöa ngâ cho c¸c t¸c nh©n kh¸c chÞu ¶nh h−ëng ®iÒu hßa cña hÖ gen nh©n tÕ 1 Khoa Ch¨n nu«i - Thuû s¶n, Tr−êng §H N«ng nghiÖp I 2 ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn Khoa häc v C«ng nghÖ ViÖt Nam 3 Khoa BÖnh häc Thó Y, Tr−êng §H Thó Y v N«ng nghiÖp §an M¹ch.
§¹i häc N«ng nghiÖp I T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp 2007: TËp V, Sè 1: 36-42 b o. HÖ gen nh©n tÕ b o cã hÖ sè ®ét biÕn thÊp thùc hiÖn x¸c ®Þnh, thÈm ®Þnh lo i v ph©n h¬n hÖ gen ty thÓ. BÊt kÓ sù thay ®æi n o cña biÖt chóng víi c¸c lo i s¸n l¸ kh¸c. c¸c gen còng cã thÓ dÉn ®Õn sù biÕn ®æi hÖ Trong b i b¸o n y, chóng t«i chñ yÕu tËp gen cã tÝnh chÊt ®Æc tr−ng cña lo i. HÖ gen trung nghiªn cøu gen ITS-2 nh»m môc ®Ých nh©n chiÒu h−íng b¶o tån rÊt cao v cã gi¸ trÞ gi¸m ®Þnh ph©n tö 2 lo i s¸n l¸ ruét nhá nãi trong gi¸m ®Þnh. Trong nh©n tÕ b o cã mét trªn, so s¸nh ®Æc ®iÓm cña gen n y trong c¸c nhãm gen quan träng l 5,8S; 18S; 28S v lo i s¸n l¸ truyÒn l©y gi÷a c¸ - ®éng vËt trªn vïng nucleotide nèi gi÷a c¸c gen ®ã l ITS-1 c¹n v x©y dùng c©y ph¶ hÖ t×m mèi liªn quan v ITS-2 (Internal transcribed spacer) ®−îc gi÷a s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis víi c¸c lo i dïng trong ph©n tÝch ph©n lo¹i (Lª Thanh s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c. Hßa, 2002) (H×nh 1). Haplorchis l mét lo i s¸n l¸ ruét nhá ®Ó 2. Nguyªn liÖu v ph−¬ng ph¸p ho n th nh vßng ®êi chóng ph¶i tr¶i qua nhiÒu nghiªn cøu lo i vËt chñ phøc t¹p (vËt chñ chÝnh, vËt chñ trung gian) nªn th−êng Ýt ®−îc quan t©m (kÓ 2.1. MÉu v nguån gèc mÉu c¶ y tÕ, thó y, ng− y). Do kÝch th−íc rÊt nhá, MÉu s¸n l¸ ruét nhá tr−ëng th nh v Êu h×nh d¹ng cña trøng, Êu trïng (cecaria, trïng (metacercariae) cña Haplorchis ®−îc metacercaria) v kÓ c¶ d¹ng tr−ëng th nh rÊt c¸c ®èi t¸c tham gia dù ¸n FIBOZOPA cung gièng víi h×nh d¹ng cña mét sè lo i s¸n l¸ cÊp: ViÖn Sèt rÐt-Ký sinh trïng-C«n trïng kh¸c nªn rÊt dÔ chÈn ®o¸n nhÇm (Tesana v trung −¬ng (NIMPE), ViÖn Nghiªn cøu Nu«i cs., 1991). Nghiªn cøu øng dông sinh häc trång Thñy s¶n 1 (RIA1). Nguån mÉu n y ph©n tö ®èi víi c¸c bÖnh ký sinh trïng truyÒn l©y nh»m kh¾c phôc nh÷ng tån t¹i cña c¸c ®−îc thu tõ ng−êi nhiÔm s¸n l¸ ruét nhá v c¸ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu cæ truyÒn l h−íng nhiÔm Êu trïng s¸n l¸ ruét nhá vïng Nam míi ®−îc quan t©m trong nhiÒu n¨m qua ë §Þnh (b¶ng 1). n−íc ta. MÆc dï cã nhiÒu nghiªn cøu sinh häc MÉu s¸n (c¶ Êu trïng v s¸n tr−ëng th nh ph©n tö trong gi¸m ®Þnh ph©n lo¹i ph¶ hÖ v cña s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis taichui v H. dÞch tÔ häc ph©n tö mét sè s¸n l¸, s¸n d©y ë pumilio) ® ®−îc x¸c ®Þnh h×nh th¸i chuÈn do ViÖt Nam, nh−ng cho ®Õn nay ®èi víi Khoa Ký sinh trïng, Tr−êng §¹i häc Mahidol, Haplorchis, rÊt Ýt nghiªn cøu ®Ò cËp ®Õn. Víi B¨ng Cèc, Th¸i Lan cung cÊp. sù gióp ®ì cña dù ¸n FIBOZOPA (Fishborne MÉu s¸n v Êu trïng s¸n ®−îc l−u gi÷ Zoonotic Parasites: dù ¸n ký sinh trïng truyÒn trong cån 70o v b¶o qu¶n l¹nh cho ®Õn khi l©y gi÷a ®éng vËt thñy sinh, ®éng vËt trªn c¹n sö dông. kÓ c¶ ng−êi) ® t¹o ®iÒu kiÖn cho chóng t«i ITS-2 Intergenic spacer (IGS) 28S 28S 18S 18S 11 5.8S 2 1 5.8S 28S 18S 18S Internal transcribed spacer (ITS) External transcribed spacer (ETS) H×nh 1. Vïng gen ribosom cña hÖ gen nh©n tÕ b o (18S-5,8S-28S) v ®iÓm b¸m måi (3SF-BD2R) nh©n ®o¹n gen ITS-2
B¶ng 1. Danh s¸ch mÉu, nguån gèc cña mÉu trong nghiªn cøu v nguån gen tham kh¶o Lo i s¸n Ký hiÖu mÉu Lo¹i mÉu (ADN) Nguån mÉu Ký chñ Nguån gen ITS-2 Hpu (TL1) S¸n tr−ëng th nh Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 H.pumilio HpM (TL) Metacercaria Th¸i Lan C¸ Nghiªn cøu n y H.pumilio Haplorchis sp. HspMND (VN) Metacercaria ViÖt Nam C¸ Nghiªn cøu n y Hpu (AY245706) Dzikowski v cs., 2004; H. pumilio AY245706 Haplorchis sp. HspND (VN) S¸n tr−ëng th nh ViÖt Nam Ng−êi Nghiªn cøu n y Haplorchis sp. HspNDV (VN) S¸n tr−ëng th nh ViÖt Nam Ng−êi Nghiªn cøu n y Hta (TL1) S¸n tr−ëng th nh Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 H. taichui Haplorchis sp. HspMND2 (VN) Metacercaria ViÖt Nam C¸ Nghiªn cøu n y Hta (AY245705) Dzikowski v cs., 2004; H. taichui AY245705 Ovi (AY584735) Sanath v cs., 2004; O. viverrini AY584735 Ovi (TL1) S¸n + Êu trïng Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 O. viverrini Csi (SKR) Lee v cs., 1999; C. sinensis AF217095 Ph¶n øng PCR tiÕn h nh víi dung tÝch l 2.2. Ph©n tÝch ITS-2 50 ml (25 ml PCR master mix, 2 ml primer Qu¸ tr×nh ph©n tÝch sinh häc ph©n tö ®−îc (10 pmol/ml), 4 ml khu«n v 17 ml n−íc) v thùc hiÖn t¹i Phßng thÝ nghiÖm MiÔn dÞch häc, kiÓm tra s¶n phÈm trªn th¹ch agarose 1%. ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc v S¶n phÈm PCR ®−îc tinh s¹ch b»ng bé C«ng nghÖ ViÖt Nam (H Néi). QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) v MÉu s¸n l¸ ruét nhá tr−ëng th nh v Êu ®−îc dßng hãa v o vector pCR2.1TOPO (TA- trïng s¸n ®−îc t¸ch chiÕt ADN tæng sè b»ng cloning kit, h ng Invitrogen). Sau khi t¸ch QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc., USA). dßng, ADN plasmid t¸i tæ hîp ®−îc gi¶i tr×nh Sau khi thu ®−îc ADN tæng sè, tiÕn h nh tr×nh tù trªn m¸y ABI-3100 Avant Genetic thùc hiÖn ph¶n øng PCR víi chu tr×nh nhiÖt: Analyzer t¹i ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. Chuçi NhiÖt ®é ®Ó bung liªn kÕt l 94oC trong 1 phót, nucleotide ®−îc xö lý b»ng ch−¬ng tr×nh nhiÖt ®é b¸m måi l 50oC trong 1 phót, nhiÖt SeqEd1.03, sau ®ã so s¸nh sö dông ch−¬ng ®é cung cÊp cho qu¸ tr×nh tæng hîp chuçi tr×nh AssemblyLIGN v1.9c v MacVector8.2 ADN l 72oC trong vßng 2 phót. To n bé qu¸ (Accelrys Inc.) trªn m¸y tÝnh Macintosh. So tr×nh thùc hiÖn ph¶n øng PCR l 35 chu kú (Lª s¸nh tr×nh tù chuçi ITS-2 cña mÉu nghiªn cøu Thanh Hßa v cs., 2002). víi tr×nh tù gen ITS-2 cña H. taichui v H. Måi ®Ó thùc hiÖn ph¶n øng: måi xu«i 3SF pumilio tõ Ng©n h ng gen, tõ t i liÖu tham (5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG- kh¶o (Ando v cs., 2001) v so s¸nh víi gen 3') v måi ng−îc BD2R (5'- ITS-2 cña mét sè lo¹i s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3'). §©y l (b¶ng 1). C¸c ch−¬ng tr×nh GENEDOC2.5 v måi chung cho ph©n tÝch gen ITS-2 cña c¸c MEGA3.1 ®−îc sö dông ®Ó ph©n tÝch v so lo i s¸n l¸ (Bowles v cs., 1995). S¬ ®å hÖ gen s¸nh vÒ th nh phÇn nucleotide (Nicholas v nh©n, ®iÓm b¸m måi v måi dïng ®−îc m« Nicholas, 1999; Kumar v cs., 2004). pháng ë h×nh 1.
C¸c mÉu s¸n ruét nhá v Êu trïng cña chóng 3. KÕt qu¶ v th¶o luËn thu ®−îc tõ ng−êi v c¸ ë ViÖt Nam bao gåm 3.1. S¶n phÈm PCR vïng ITS-2 mÉu HspMND2(VN) cã ®é d i gen ITS-2 l 446 bp, t−¬ng ®−¬ng ITS-2 cña H. taichui; v M 1 2 3 4 5 mÉu HspMND(VN) cã ®é d i gen ITS-2 l 290 bp, t−¬ng ®−¬ng gen ITS-2 cña H. pumilio. 3.3. So s¸nh sù t−¬ng ®ång cña nucleotide trong gen ITS-2 So s¸nh gi÷a c¸c mÉu s¸n v Êu trïng thu ®−îc ë ViÖt Nam víi H. taichui v H. pumilio cña Th¸i Lan v so s¸nh víi mét sè s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c nh− s¸n l¸ gan nhá (C. sinensis v O. viverrini) vÒ møc ®é t−¬ng ®ång c¸c 0,6 0,6 kb nucleotide ®−îc thÓ hiÖn trong b¶ng 2. 0,4 kb Ph©n tÝch sù t−¬ng ®ång nucleotide vïng gen ITS-2 cña c¸c mÉu nghiªn cøu v mét sè H×nh 2. S¶n phÈm PCR vïng gen ITS-2 trªn mÉu trong ng©n h ng gen cho thÊy gi÷a mÉu th¹ch agarose 1%. M: chØ thÞ ADN (Lamda c¾t H.pumilio ((HpuM(TL) nguån gèc tõ Th¸i b»ng HindIII); 1: Hta(TL), mÉu H. taichui cña Lan) ph©n tÝch ë nghiªn cøu n y v mÉu cña Th¸i Lan; 2: HpM(TL), mÉu metacercaria H. Ando v cs (2001) (tõ Th¸i Lan) cã sù t−¬ng pumilio cña Th¸i Lan; 3: HspMND(VN), mÉu ®ång nucleotide cña gen ITS-2 l 96% v gi÷a metacercaria Haplorchis sp. thø nhÊt cña ViÖt mÉu HspMND(VN) víi mÉu H.pumilio cña Nam; 4: HspND(VN), mÉu Haplorchis sp. cña Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y HpuM(TL) v ViÖt Nam; 5: HspMND2(VN), mÉu metacercaria Haplorchis sp. thø 2 cña ViÖt Nam mÉu ph©n tÝch cña Ando (2001) cã sù t−¬ng ®ång nucleotide t−¬ng øng l 99 v 96%. KÕt qu¶ cho thÊy cã sù sai kh¸c vÒ chiÒu Trong khi ®ã sù t−¬ng ®ång nucleotide trong d i cña vïng gen ITS-2 gi÷a c¸c mÉu c¸c mÉu H.pumilio cña Th¸i Lan v c¶ mÉu Haplorchis sp. thu ®−îc ë ViÖt Nam v gi÷a HspMND(VN) so víi Hpu (AY245706) tõ mÉu H. taichui v H. pumilio cña Th¸i Lan ng©n h ng gen chØ ®¹t 94%. Møc ®é t−¬ng (mÉu ® ®−îc x¸c ®Þnh h×nh th¸i häc). §é d i ®ång nucleotide gi÷a c¸c mÉu (1-4) ®¹t tû lÖ cña vïng gen ITS-2 giíi h¹n gi÷a cÆp måi t−¬ng ®èi cao (94-99%) tû lÖ n y ph¶n ¸nh (3SF v BDR) cña H. taichui kho¶ng 0,6 kb v t−¬ng ®ång th−êng thÊy ë trong mét lo i. Nh− vËy cã thÓ kÕt luËn mÉu HspMND (VN) cña cña H. pumilio kho¶ng 0,4 kb. MÉu s¸n ViÖt Nam l H. pumilio. Haplorchis sp. cña ViÖt Nam còng cã ®é d i vïng gen ITS-2 t−¬ng tù nh− mÉu s¸n cña §èi víi mÉu H. taichui cã nguån gèc Th¸i Lan (h×nh 2). Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y Hta (TL) víi mÉu Hta (TL1) trong nghiªn cøu cña Ando 3.2 Tr×nh tù vïng gen ITS-2 n¨m 2001 cho thÊy cã sù t−¬ng ®ång nucleotide l 99%. Trong khi ®ã mÉu So s¸nh tr×nh tù nucleotide c¸c mÉu HspMND2 (VN) cã sù t−¬ng ®ång rÊt cao tõ nghiªn cøu ®−îc tr×nh b y ë h×nh 3. KÕt qu¶ 99-100% so víi mÉu H. taichui cña Th¸i Lan gi¶i tr×nh tù cho thÊy cã sù sai kh¸c vÒ ®é d i v cã sù t−¬ng ®ång rÊt thÊp víi c¸c mÉu H. gen ITS-2 gi÷a H. taichui v H.pumilio. §èi pumilio chØ ®¹t tõ 52-54%, v ®©y l møc ®é víi H. taichui, gen ITS-2 cã ®é d i l 445-446 t−¬ng ®ång th−êng thÊy ë 2 lo i kh¸c nhau. V× bp cßn ®èi víi mÉu s¸n H. pumilio l 290 bp. vËy cã thÓ kÕt luËn mÉu HspMND2 (VN) cña Gen ITS-2 cña H. taichui d i h¬n H. pumilio ViÖt Nam l H. taichui. do cã mét ®o¹n 154 nucleotide tõ nucleotide thø 198 ®Õn nucleotide 352 ®−îc chÌn v o §èi víi mÉu ký hiÖu HspNDV (VN) khi (h×nh 3). Sù sai kh¸c nhiÒu vÒ tr×nh tù s¾p xÕp ph©n tÝch sù t−¬ng ®ång nucleotide vïng gen c¸c nucleotide gi÷a H. taichui v H. pumilio ITS-2 cho thÊy t−¬ng ®ång tuyÖt ®èi 100% so chñ yÕu x¶y ra ë c¸c vÞ trÝ sau ®o¹n chÌn, cßn víi O. viverrini tõ ng©n h ng gen. Lª Thanh c¸c vÞ trÝ tr−íc ®o¹n chÌn cã sù t−¬ng ®ång lín. Hßa v cs (2003) cho r»ng s¸n l¸ gan nhá O.
Nam §Þnh. §iÒu n y cho thÊy cÇn thiÕt cã viverrini chñ yÕu ph©n bè ë vïng Nam Trung nghiªn cøu bæ sung vÒ nguån gèc ®Ó cã kÕt bé v phÝa Nam, nh−ng mÉu HspNDV (VN) luËn ch¾c ch¾n h¬n. ®em ph©n tÝch ë ®©y l¹i ®−îc t×m thÊy ë vïng * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 Hpu(TL1) : TTATAAACTATCACGACGCCCAAATAGTCGTGGCTTGGGTCTTGCCAGCTGGCGTGATTTC--C------TTGTGC-TAT-TGCATGGGGTGCCAGATCA : 90 HpuM(TL) : ...............G........A....................................--.------......-...-................... : 90 Hpu(AY2457 : .........G.....G........A....................................--.------......-...-C......A........... : 90 HspMND(VN) : ...............G........A....................................--.------......-...-................... : 90 HspND(VN) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 HspNDV(VN) : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Hta(TL1) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 Hta(TL) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 HspMND2(VN : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 Hta(AY2457 : ........................A...............T...............G....--.------....AG-GT.-.CT...A........T..T : 90 Ovi(TL)AY5 : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Ovi(TL1) : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Csi(SKR) : ........................A............................A.......CC.ACACAA.....TG...G..TG.........G....T : 100 * 120 * 140 * 160 * 180 * 200 Hpu(TL1) : ATGGCTTCTCCCTAATGTGCCGAACGCAACCATGTCTGGGTTGA----ATGCCTGGATGAGGGGGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATTTATGTAT---- : 182 HpuM(TL) : ............................................----...........................A............--T.A.G.AT-- : 182 Hpu(AY2457 : G...........................................----.............A.....................G..........G.TT-- : 184 HspMND(VN) : ............................................----........................................--T.A.G.AT-- : 182 HspND(VN) : ............................................----C....C........AA.G......................GGT.A...AT-- : 184 HspNDV(VN) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Hta(TL1) : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 Hta(TL) : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 HspMND2(VN : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 Hta(AY2457 : G......TC.............G..........TA.....C...TGGA.G..........ATCTA...T...................AAT.A------- : 183 Ovi(TL)AY5 : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Ovi(TL1) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Csi(SKR) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...------ : 190 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 Hpu(TL1) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HpuM(TL) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Hpu(AY2457 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspMND(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspND(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspNDV(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Hta(TL1) : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTCTGGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 285 Hta(TL) : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTC-GGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 284 HspMND2(VN : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTCTGGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 285 Hta(AY2457 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Ovi(TL)AY5 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Ovi(TL1) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Csi(SKR) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - * 320 * 340 * 360 * 380 * 400 Hpu(TL1) : ----------------------------------------------------TTTTTATTCATTGT--GCGCGCTCCGCTG-AAAACCTTCGTCTGTGGC : 227 HpuM(TL) : ----------------------------------------------------..............--.............-.................. : 227 Hpu(AY2457 : ----------------------------------------------------..A...........--.............--................. : 228 HspMND(VN) : ----------------------------------------------------..............--.............-.................. : 227 HspND(VN) : ----------------------------------------------------..G.GG.G-.....--.............CTT.....CT......... : 229 HspNDV(VN) : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Hta(TL1) : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAGGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 384 Hta(TL) : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAAGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 383 HspMND2(VN : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAGGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 384 Hta(AY2457 : ---------------------------------------------------------G.GGC.AACGCA.........T.ATC.TTTA...A..AT.ATT : 226 Ovi(TL)AY5 : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Ovi(TL1) : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Csi(SKR) : -----------------------------------------------------.A..G..GTGAA.GT..........T..TTGGT....T....T...T : 237 * 420 * 440 * 460 * Hpu(TL1) : TGTGA-TGCTA-GGATGTGGCAATGCATTCGATGCAAATAA-TTGTGCACAT--ATG--TGCCATATT-TA : 290 HpuM(TL) : .....-.....-.............................-..........--...--.........-.. : 290 Hpu(AY2457 : .....-.....-.....C.....................G.-..........--...--.........-.. : 291 HspMND(VN) : .....-.....-.............................-..........--...--.........-.. : 290 HspND(VN) : ..--.-.....-...C.....................TAT.-........T.--T..--....T....--- : 288 HspNDV(VN) : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Hta(TL1) : ..A-C-G....-A...............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 446 Hta(TL) : ..A-C-G....-A..C............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 445 HspMND2(VN : ..A-C-G....-A...............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 446 Hta(AY2457 : G..TCAG...TTAT.A-...........C...A..C.G.T.-A..G.T..C.A------.C....T..G.C : 289 Ovi(TL)AY5 : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Ovi(TL1) : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Csi(SKR) : ..A---G...TCA.TAT......................CTG..T.....CGGTCG.--...TTA.C.-.T : 302 H×nh 3. So s¸nh tr×nh tù nucleotide gen ITS-2 cña c¸c mÉu s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis ViÖt Nam, Th¸i Lan v s¸n l¸ gan bÐ (Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini) Ghi chó: Sai kh¸c tr×nh tù cña c¸c chñng so víi Hpu(TL1) biÓu thÞ b»ng chÝnh ký hiÖu nucleotide cña chóng; dÊu (.) biÓu thÞ sù gièng nhau; dÊu (-) kh«ng cã nucleotide t−¬ng øng.
B¶ng 2. Sù t−¬ng ®ång nucleotide trong gen ITS-2 gi÷a mét sè lo i s¸n l¸ truyÒn l©y qua c¸ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 96 94 96 88 79 54 54 54 54 79 79 76 2 94 99 88 78 53 53 53 68 78 78 75 3 94 84 76 52 52 52 66 76 76 74 4 88 78 53 53 53 68 78 78 76 5 77 76 57 56 66 77 77 74 6 50 50 50 69 100 100 87 7 99 100 45 50 50 50 8 99 45 50 50 50 9 45 50 50 50 10 69 69 68 11 100 87 12 87 13 Ghi chó: 1: Hpu(TL1); 2: HpuM(TL); 3: Hpu(AY245706); 4: HspMND(VN); 5: HspND(VN); 6: HspNDV(VN); 7: Hta(TL1); 8: Hta(TL); 9: HspMND2(VN); 10: Hta(AY245705); 11: Ovi(AY584735); 12: Ovi(TL1); 13: Csi(SKR) Tr×nh tù gen ITS-2 cña Hta (AY245705) Gi÷a 2 lo i s¸n l¸ ruét nhá H. taichui v thu thËp tõ ng©n h ng gen ®em so s¸nh víi H. pumilio cã sù sau kh¸c vÒ ®é d i v trËt tù mÉu nghiªn cøu cña chóng t«i v c¸c mÉu gen ITS-2 ®−îc thÓ hiÖn ë sù chÌn ®o¹n gen tham kh¶o kh¸c cho thÊy cã tû lÖ t−¬ng ®ång 154 nucleotide, l m cho ®o¹n gen ITS-2 cña rÊt thÊp (45%) víi nhãm H. taichui v 54-68% H. taichui d i h¬n ®o¹n gen ITS-2 cña H. víi nhãm H. pumilio. VËy ch¾c ch¾n tr×nh tù pumilio. n y trong ng©n h ng gen l kh«ng ®óng víi H. Cã rÊt Ýt sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù nucleotide taichui. trong gen ITS-2 cña H. pumilio gi÷a mÉu s¸n cña ViÖt Nam v mÉu s¸n cña Th¸i Lan trong 4. KÕt luËn nghiªn cøu n y (t−¬ng ®ång ®¹t 99%) v cã sù sai kh¸c kh«ng ®¸ng kÓ gi÷a mÉu s¸n cña Th¸i Hai lo i s¸n l¸ ruét nhá H. taichui v H. Lan trong nghiªn cøu n y víi mÉu s¸n Th¸i pumilio ® ®−îc gi¸m ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p Lan trong nghiªn cøu cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c. sinh häc ph©n tö dùa trªn ph©n tÝch gen ITS-2, tõ c¸c mÉu s¸n l¸ ruét nhá vïng Nam §Þnh Cã sù gièng nhau ho n to n vÒ tr×nh tù cña ViÖt Nam. MÉu Êu trïng s¸n ký hiÖu l s¾p xÕp nucleotide trong gen ITS-2 cña H. HspMND(VN) ®−îc x¸c ®Þnh lo i l taichui gi÷a mÉu s¸n ViÖt Nam v mÉu s¸n H.pumilio v mÉu HspMND2(VN) l H. Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y v gièng nhau taichui. VÒ ®é d i gen ITS-2 cña H. taichui l gÇn nh− tuyÖt ®èi víi mÉu s¸n Th¸i Lan cña 446 bp v cña H. pumilio l 290 bp. Ando v cs (2001).
Lêi c¶m ¬n C¸c t¸c gi¶ xin göi lêi c¶m ¬n Tæ chøc DANIDA v dù ¸n FIBOZOPA ® cung cÊp kinh phÝ v t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nghiªn cøu n y. Xin c¶m ¬n PGS. TS. NguyÔn V¨n §Ò (ViÖn Sèt rÐt, Ký sinh trïng v c«n trïng Trung −¬ng), TS. Jitra Waikagul (Tr−êng §H Y Mahildol, B¨ng Cèc, Th¸i lan v KS. NguyÔn ThÞ H»ng (ViÖn Nghiªn cøu NTTS 1) ® cung cÊp mÉu cho nghiªn cøu. viverrini collected from Phu Yen T i liÖu tham kh¶o province. Proceedings of National Ando, K.; Sathithaworn, P.; Nuchjungreed, C.; Conference on Molecular Biology and Tesana, S.; Srisawangwong, T.; Biochemistry, Hanoi (22-24.10.2003). Limviroj, W. and Chinzei, Y. (2001). Le, T.H., Blair, D. and McManus, D.P. (2002). Nucleotide sequence of mitochondrial Mitochondrial genomes of parasitic CO I and ribosomal ITS-2 genes of flatworms. Trends Parasitol, 18: 206-213. Opisthochis viverrini in Northeast Nicholas, K.B. and H.B. Nicholas (1999). Thailand. Southeast Asian J Trop Med GeneDoc: a tool for editting and Public Health 2001; 32: 17-22. annotating multiple sequence Bowles J, Blair D, McManus DP (1995). A alignments. Distributed by authors. molecular phylogeny of the human Pear, J. C. (1964). A revision of the subfamily schistosomes. Mol Phylogenet Evol 4: Haplorchinae Looss, 1899 (Trematoda: 103-109. Heterophyidae). Parasitology 1964; 54: Cheng, T. C. (1974). General parasitology. 601-76. New York: Academic Press, 1974. Pearson, J. C. and C. K. Ow-Yang (1982). Dzikowski, R.; Levy, M. G.; Poore, M. F.; New species of Haplorchis from Flowers, J. R. and Paperna, I. (2004). Southeast Asia, together with keys to Use of rDNA polymorphism for the Haplorchis - group of Heterophyid identification of Heterophyidae trematodes of the region. Southeast Asia infecting freshwater fishes. Dis Aquat J. Trop. Med. Pub. Health, 13: 53-60. Org 2004; 59: 35-41. Tesana S., Srisawangwonk T., Kaekes S., Kumar, S., Tamura, K., Nei M. (2004). Sithithaworn P., Kanla P., Arunyanart MEGA3: Integrated Software for C. (1991). Eggshell morphology of the Molecular Evolutionary Genetics small eggs of human trematodes in Analysis and Sequence Alignment. Thailand. Southeast Asian J Trop Med Briefings in Bioinformatics 5, 150-163. Public Health 1991; 22: 631-6. Le T.H., N. V. Chuong, N. V. De, P. Yamaguti S. (1958). Systema Helminthum. Sithitharworn, N. B. Nga, T. N. Trung, Vol I. The dignetic trematodes of L. K. Thuan (2003). Report on vertebrates Part 1 & II. New York: Inter molecular analysis of Opisthorchis cience Publishers, 1958: 1575 pp.
§¹i häc N«ng nghiÖp I T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp 2007: TËp V, Sè 1: 92