BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM

PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh,Lê Thanh Hoà, Nguyễn Ngọc Dũng Viện Công nghệ Sinh học. Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992, Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in). Do có những đặc điểm riêng hình thành trong trong suốt qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer ( 2000) đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩn đã được xác định trình tự nucleotid. Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ được trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S- ARN ribosom (16S-ARNr). I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vi sinh vật:
Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây lúa ở Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối kháng F. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coli DH đã được sử dụng. 2. Các phương pháp phân loại: a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình: Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API 20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theo nhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loại các nhóm vi khuẩn hình que, gram âm, không thuộc Họ Enterobacteracae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE, các đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin đã được xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được tiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi trường LB rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu được ủ ở 30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ ủ. Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theo
phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm đối chứng. Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ. b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen: -Thu ADN tổng số: ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson và cộng sự (1985). -Thu nhận gen 16S-ARNr: Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận chiều Prf: 5'-GAGTTTGATCATGGCTAA-3', tương ứng với các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli; mồi nghịch chiều Prr: 5'- AGGAGGTGATCCAGCC-3', tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-Oligos Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có
thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịch ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADN được biến tính ở 95oC trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biến tính ở 94oC trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt độ 52oC và phản ứng kéo dài chuỗi ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ bản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến tính một lần ngay ở nhiệt độ 94oC trong 1 phút, tiếp sau pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72oC trong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 4oC. Kết qủa phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8%. Sản phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1 theo chỉ dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen. Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và
RUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI. 3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu: Chuỗi ADN được giải trình tự trên máy giải trình tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) từ sản phẩm dòng hoá là ADN của plasmid tái tổ hợp đã tiếp nhận đoạn gen 16S ARNr. Mồi xuôi M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) và mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng trong giải trình tự là các chuỗi cố định của vectơ và nằm gần hai đầu biên của ADN tái tổ hợp cần giải trình. Trong quá trình giải trình, chúng tôi thiết kế thêm một mồi khác ký hiệu là Seq16SF (5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’ của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu là khoảng 300-320 nucleotid. Giải trình được thực hiện nhiều lần với số lượng
nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác. Xử lý chuỗi nucleotid bằng chương trình SeqEd1.0.3; sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5 (Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua chương trình BLASTn có tại (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 4. Chọn chuỗi so sánh: Các chuỗi nucleotid 16S ARNr của một số chủng có trình tự tương ứng từ Pseudomonas spp. tại Ngân hàng Gen được thu nhận bằng cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số thư mục ngân hàng và được sử dụng để so sánh đối chiếu với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1).
Bảng 1: Các chủng Pseudomonas spp. được dùng để so sánh
5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dòng hoá sản phẩm và một phần phân tích số liệu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng máy, Viện Công nghệ Sinh học (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Việt Nam). Công việc giải trình trình tự và xử lý số liệu giám định phân tử được tiến hành tại Viện nghiên cứu Y học Queensland (Australia). II. KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 1. Phân loại theo kiểu hình: Như đã nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn được chuẩn hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có
nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ Enterobacteracae. Kết qủa phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ bản, chủng này cho kết qủa âm tính với khử nitrat, tạo indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp - galactosidase; và cho 3 kết qủa dương tính là lên men glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase. Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1 không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat, citrat và phenol-axetat. Với những kết qủa như vậy, chủng Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn, chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ số ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch. violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết qủa xác định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,
chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni (1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang (Gould và cộng sự, 1985). Chính vì vậy, đến đây có thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng Chromobacterium. 2. Phân loại theo kiểu gen: Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 đã được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen PCR; trình tự của nó cũng đã được xác định và đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với số thư mục AF521651. Một phần của kết qủa giám định chủng Ps7-1 bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua chương trình BLASTn được trình bày trong bảng 2. Bảng 2: Trích đoạn kết qủa giám định trình tự gen 16S- rRNA từ chủng Ps7-1
Căn cứ vào các kết qủa giám định nhận được từ ngân hàng gen có thể khảng định rằng chủng Ps7-1 là một chủng thuộc Chi Pseudomonas, bởi sự so sánh chuỗi trình tự nucleotid của gen 16S-rARN từ chủng này với trình tự từ các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen cho giá trị tin cậy cao nhất thuộc về các chủng của Chi Pseudomonas. Để làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của chủng Ps7-1, trình tự nucleotid một đoạn gen 16S-ARN dài 648 base từ chủng này đã được so sánh với trình tự từ một số chủng thuộc các loài Pseudomonas khác nhau (xem Bảng 1) và kết qủa được trình bày ở Hình 1. Theo đó, trình tự nucleotid của
phân đoạn gen 16S-ARNr từ chủng Ps 7-1 hoàn toàn đồng nhất (648/648) với các chủng thuộc loài P. fluorescens, đạt tỷ lệ 100%. Sai khác nucleotid giữa các loài Pseudomonas spp. đã nêu với chủng Ps7-1 là 28/648, đạt tỷ lệ 4,3%. Đó là các thay thế TC (vị trí 14; 58; 65; 84 và 450), CT (vị trí 15; 77; 315 và 496), GA (vị trí 25; 57; 331; 335; 460; 505; 509 và 605), AG (vị trí 72; 78 và 320), GC (vị trí 317), AT (vị trí 332), TGC (vị trí 333), GT (vị trí 469), AGT (vị trí 507) và AG (vị trí 508). Với kết qủa như vậy cho phép kết luận rằng chủng Ps7-1 thuộc loài P. fluorescenss.
Hình 1: So sánh trình tự nucleotid của một đoạn gen ribôxom 16S - ARNr của chủng Ps7-1 với các loài Pseudomonas đã được biết. Ghi chú: dấu chấm (.) biểu thị
sự giống nhau của trình tự nucleotid của các loài; sự sai khác về nucleotid được thể hiện bằng chính các chữ cái ký hiệu của chúng; PluoATCC : P. fluorescens chủng ATCC 17386; Pfluor : P. fluorescens chủng CHAO; Pchlor: P. chlororaphis chủng DSM50083T; Pcost: P. costantinii chủng CFBP 5705; Pficu: P. ficuserectae chủng JCM 2400T; Pman: P. mandelii chủng CIP 105273; Pmeli: P. meliae MAFF 301463T; Psyr+gly: P. syringae pv. glycinea chủng MAFF 302260; Psyr+pha: P. syringae pv. phaseolicola MAFF 302282. Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống API 20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết qủa phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE, nhưng theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì chủng này thuộc loài P. putida (99%) (Lottmann và cộng sự , 2000). Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ loài, không xẩy ra ở định loại chi. Nhưng, như đã nêu, trong
trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho kết qủa cách biệt khá lớn, nếu không nói hoàn toàn khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr, mặc dù theo nhà cung cấp dịch vụ API 20NE, các chủng thuộc Chi Pseudomonas là một trong nhũng đối tượng phù hợp của hệ thống xác định được chuẩn hoá này. Tóm lại, cùng với những đặc tính phân lập có chọn lọc, hiếu khí bắt buộc và kháng tetraxyclin, kết quả phân tích trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr cho thấy chủng Ps7-1 là một chủng Pseudomonas, chứ không thuộc chi Chromobacterium và có độ tương đồng cao nhất, 100%, với loài P. fluorescens. Công trình này được tài trợ bởi Viện Công nghệ Sinh học, TTKHTN&CNQG và hỗ trợ bởi Hội đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học Công nghệ & Môi trường, tài khóa 2002. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H. and Oyaizu,H. (2000). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1563-1589.. 2. Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M. and Smalla, K., 2000. Successful strategy for the selection of new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137. 3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D., Pienta,P.A. and Gillevet, P.M.(Chưa công bố). 4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M. Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration and recovery of fluorescent Pseudomonads from Various Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32. 5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus Azospirillum. In: Krieg, N.R.,& Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore. 6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering, K., Wackernagel, W., Smalla, K., Berg, G., 2000. Establishment of introduced antagonistic bacteria in the
rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the bacterial community. EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49. 7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of Bacteria beyond the 16S-rRNA Standerd. Vermicon. http:w.w.w. ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm 8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985. Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol., 163, 2-25. 9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C., Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De Wachter,R. and Timmis,K.N.(1996). Syst. Appl. Microbiol. 19, 478-492. 10. Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J.-M., Christen,R. and Gardan,L. (2002). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. đang in. 11. Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh, 2000. Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu khí khu trú trong rễ lúa ở một số địa điểm thuộc đồng bằng sông Hồng. Tuyển tập .Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong sinh học. Hội Nghị
Sinh học quốc gia, Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia Hà Nội. 12. Norberto, J. and Palleroni, 1984. Genus Pseudomonas. In: Krieg, N.R. & Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin, Co., Baltimore. 13. O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens. Microbiol. Rev., 56, 662-672 14. Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y. and Defa go, G. (2001). Mol. Plant Microbe Interact. 14 (5), 639-652 15. Sawada, H. (1997). Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen 16. Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D. and Leclerc,H. (1999). Syst. Appl. Microbiol. 22, 45-58 17. Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev., 51, 221-271 SUMMARY Taxonomical Position of the Isolate Ps7-1 capable of