Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

Chia sẻ: Cẩm Nguyên | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

642
lượt xem 40
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo "Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm" trình bày các nội dung chính như: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kỹ thuật gieo cấy và phân lập, định lượng – tách vi sinh vật, quan sát vi sinh vật nói chung trên,...Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Kỹ Thuật Hoá Học Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG SV: NGUYỄN THỊ KIM TIẾN_61103601
 Tp HCM, 11/2013  Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 2
MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG
BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. Mục đích thí nghiệm Tạo môi trường thuần khiết để nuôi cấy vi sinh vật. Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho quá trình nuôi cấy Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm và vô khuẩn chúng để đảm bảo môi trường đủ sách cho việc nuôi cấy. II. Sơ lược lí thuyết 1. Định nghĩa Môi trường dinh dưỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào quá trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường. 2. Phân loại Phân loại theo trạng thái lý hóa: Môi trường lỏng: lên men, nhân giống, nghiên cứu một số đặc tính. Môi trường rắn(môi trường đặc): môi trường lỏng kết hợp với chất tạo đặc agar (22.5%), gelatin (1015%)để phân lặp, định lượng, gieo giống và giữ giống vi sinh vật. Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn thường dùng (0.30.7% agar) – dùng để quan sát khả năng chuyển động của một số vi sinh vật ( tạo nên đường đi trên bề mặt môi trường). Phân loại theo thành phần: Môi trường tổng hợp: Môi trường tự nhiên: Môi trường hòa tan chuẩn bị sẵn 3. Yêu cầu môi trường dinh dưỡng Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Có pH thích hợp. Không chứa các yếu tố độc hại. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 4
Có độ nhớt nhất định. Tuyệt đối vô trùng. III. Cách tiến hành thi nghiệm Ghi chú: (1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42450C, thời gian 30 phút (2) Nâng nhiệt: 68700C, thời gian 1h (3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70 (4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½ Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 5
(5) Hấp tiệt trùng: 1520p Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình Môi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau đó để thẳng đứng Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để môi trường không dính vào miệng ống nghiệm, đĩa petri hay nút bông và cần thực hiện trước khi môi trường bị đông đặc. Môi trường thạch phải phẳng, nhẵn. IV. Kết quả Ta có công thức V1 . N1 = V2 . N2 V2= V1 . N1 / N2 Trong đó V1 Thể tích môi trường sau khi lọc tinh. N1 Độ đường sau khi lọc tinh. N2 Độ đường cần điều chỉnh là = 70 Balling. Thể tích nước cần thêm vào = V2 – V1 N1(0) V1(ml) N2 (0) V2(ml) VH2O thêm vào 11 127 7 200 73 V. Một số chú ý trong tiến trình thí nghiệm: Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô. Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Đầu nút tròn, độ chặt vừa phải. Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng. Phần giấy bao gói phải chặt kín. VI. Bàn luận và mở rộng 1. Đánh giá chất tạo đặc cho môi trường: Gelatin tuy làm đông môi trường nhưng môi trường tan chảy ở 37 0C, một nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn gây bệnh cho động vật, ngoài ra thì nhiều vi sinh vật phân hủy gelatin làm lỏng môi trường. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 6
Agar không chỉ đông đặc tốt ở nhiệt độ dưới 400C mà còn không bị vi sinh vật phân giải làm biến tính. 2. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Phương pháp này khá phổ biến vì rất đơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian giữ giống chỉ nên kéo dài trong 1 tháng , sau đó phẩi cấy truyền lại trên môi trường mới. Do đó tốn nhiều công sức và dễ bị mất các đặc tính di truyền ban đầu. Phương pháp này được tiến hành như sau: Thuần khiết chủng vsv trên môi trường agar ở đĩa petri, chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm để vsv phát triển bình thường, lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4 oC, hàng tháng cấy truyền lại vào môi trường mới. Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage. 3. Hấp tiệt trùng Ngoài cách tiệt trùng sử dụng hơi nước bão hoà (nồi autoclave) thì tuỳ từng loại môi trường mà có thêm một số phương pháp khác như: Phương pháp pasture: đun cách thuỷ ở nhiệt độ thấp 65700C, thời gian 15 30p. Phương pháp Tyndal: Nhiệt độ tiệt khuẩn của phương pháp này từ 70 800C/1 giờ làm như vậy 3 lần, mỗi lần cách nhau 24giờ hoặc dùng nhiệt độ 60650C/1 giờ làm 5 lần. Thời gian nghĩ để ở nhiệt độ 370C. Phương pháp này thường được áp dụng tiệt khuẩn các sản phẩm dễ bị hỏng ở nhiệt độ cao. Tyndall cho rằng ở nhiệt độ 60650C hay ở 70800C, vi khuẩn thể ding dưỡng sẽ bị chết nhưng nha bào vẫn sống, khi để nguội đến 370C, nha bào chuyển sang thể hoạt động (thể dinh dưỡng) và lại bị tiêu diệt ở lần hấp sau đó. Nhược điểm: kéo dài thời gian tiệt khuẩn, độ tiệt khuẩn không chắc chắn. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 7
BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP I. Gieo cấy 1. Định nghĩa Gieo cấy là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhân giống và giữ giống. Môi trường mới đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng và phát triển. Canh trường: môi trường đã có vi sinh vật. 2. Yêu cầu gieo cấy Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối khu vực xung quanh, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn hay tủ cấy. Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc hoặc vòng, pipet, que trang,.. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 8
Hình . Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn 3. Kỹ thuật gieo cấy Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng: nhân giống cấp 123 để lên men. Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc: phân lập, tạo khuẩn lạc. Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc: giữ giống. 4. Các cách cấy truyền Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: Hình . Mẫu cấy ziczac và cấy song song Hiếu khí: cấy điểm, cấy ziczac, cấy song song. Yếm khí: đuổi khí, cấy đâm sâu vào trong ống nghiệm. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 9
Nếu cấy chuyền vi khuẩn hay nấm men thì di que cấy trên bề mặt thạch theo hình chữ chi hoặc vạch song song. Cấy chuyển nấm mốc thì chỉ cần chạm que cấy lên bề mặt thạch. Cấy trên mặt thạch đứng. Cấy trên đĩa petri. Cấy gạt: cho một ít mẫu vào môi trường thạch trong petri sau đó dùng que trang dàn đều vi sinh vật trên bề mặt thạch trong hộp. Hình . Cấy gạc trên môi trường đĩa petri Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (50 0C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri đã khử trùng. Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại và cuối cùng là bao gói và nuôi trong tủ ấm. (có thể cho dịch cấy vào petri trước và tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri). Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc. Hình . Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 10
Hình . Các kiểu cấy trên đĩa thạch 5. Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm) Hình . Trình tự cấy truyền Mô tả qui trình: a) Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống canh trường và một ống môi trường (ống canh trường nằm bên ngoài, ống môi trường nằm bên trong) Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng ngón út và áp út rút nút bông của ống canh trường ra. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 11
b) Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm. c) Đợi que cấy nguội, lấy vi sinh vật từ ống canh trường đưa sang ống môi trường. d) Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi. e) Rút que cấy ra và đốt nóng que cấy Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bong II. Phân lập 1. Định nghĩa Phân lập là quá trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các khuẩn lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao. 2. Các phương pháp phân lập vi sinh vật Phương pháp trực tiếp 3. Tiến hành thí nghiệm Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 12
a. Pha loãng mẫu Hình . Qui trình pha loãng mẫu Mô tả qui trình: o Chuẩn bị sẵn 95ml nước vô khuẩn trong bình tam giác và 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa sẵn 95ml nước vô khuẩn và lắc đều (bình mẫu). o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ bình mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 101) o Tiếp tục dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm thứ 2 có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 102) o Lần lượt ta làm tương tự đối với ống thứ 3, thứ 4 và thứ 5(độ pha loãng 103, độ pha loãng 104, độ pha loãng 105) b. Phân lập: đối với mẫu có độ pha loãng: 1 ống 103, 1 ống 104, 1 ống 105 Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ . Tháo bao gói petri đã vô khuẩn, hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn. Tay trái cầm hộp petri, dùng ngón tay hé mở nắp và rồi dùng tay phải đổ thạch đã rã đông vào trong hộp petri. Xoay đều để thạch phân bố đều trong hộp và bề mặt phẳng, nhẵn. Để nguội cho thạch đông lại. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 13
Dùng pipet lấy mẫu ở ống nghiệm có độ pha loãng 103 và cho vào hộp petri (vẫn dùng tay để hé nắp hộp petri). Vô khuẩn que trang bằng cồn và hơ nóng, sau đó để nguội rồi dàn đều mẫu trên bề mặt thạch để nấm men phát triển đều trên khắp bề mặt thạch. Để ổn định trong 5 phút, lật ngược hộp petri lại và tiến hành bao gói. Để nguội trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28300C), trong vòng 4872 giờ. III. Bàn luận và mở rộng BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT I. Sơ lược lược lý thuyết 1. Khái niệm Định lượng vi sinh vật là quá trình pha loãng mẫu sau đó cấy chuyền mẫu qua một môi trường mới nhằm mục đích tạo ra các tế bào riêng lẻ và đếm tổng số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu. 2. Phương pháp định lượng: Định lượng trực tiếp: là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu. o Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng. o Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. o Phương pháp định lượng trực tiếp: Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu (thường dùng nhất). Định lượng gián tiếp: là phương pháp định lượng thông qua môi trường mới bằng cách gieo cấy một lượng nhất định mẫu lên một môi trường dinh dưỡng thích Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 14
hợp, nuôi cấy trong tủ ấm, sau đó đếm tổng số khuẩn lạc và dựa vào công thức để tính số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu. o Ưu điểm: kết quả chính xác hơn. o Nhược điểm: Mất nhiều kinh phí để làm môi trường Mất nhiều thời gian 3. Nguyên lý: o Phương pháp đổ đĩa: một ít vi sinh vật đã pha loãng được trộn đều với môi trường agar nóng chảy và được đổ vào hộp petri vô khuẩn. Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng lẽ. o Phương pháp cấy ria: que cấy được sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật phân lập trên khắp bề mặt môi trường đặc trong petri. Sau mỗi lần vi sinh vật sẽ tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng lẽ. II. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ: o Erlen chứa 95ml nước vô khuẩn o 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o 1 pipet 10ml và 5 pipet 1ml đã hấp tiệt trùng o Chuẩn bị các ống thạch, đun chảy cách thủy, giữ ở 450C500C. 1. Pha loãng mẫu: o Chuẩn bị mẫu: lấy 5ml dịch mẫu chứa VSV cho vào erlen chứa 95ml nước vô khuẩn được 100ml dịch mẫu. o Pha loãng: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 15
Hình . Trình tự pha loãng mẫu Lưu ý: o Sử dụng ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn. o Giữa những lần pha loãng nên đánh đều bằng máy Vortex. o Pipet nào thì dùng riêng cho ống nghiệm ứng với độ pha loãng đó. o Thao tác nên thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn. o Không nên mở nắp hộp petri quá lớn để tránh nhiễm khuẩn. o Thao tác thực hiện phải nhanh. o Dùng nút bông đậy các ống nghiệm để tránh nhiễm khuẩn. 2. Phương pháp đổ hộp (phương pháp trộn) o Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ giữ môi trường ở nhiệt độ 500C o Cho 0.2ml mẫu với độ pha loãng tương ứng vào petri và đổ ống nghiệm chứa môi trường vào. o Xoay đều hộp petri cho mặt thạch đều và phẳng. Để môi trường đặc lại. o Lật ngược petri, bao gói, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp. o Sau 23 ngày, lấy ra, đếm số khuẩn lạc và tính toán kết quả. 3. Phương pháp cấy ria (phương pháp tách) o Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một ít vi sinh vật cần phân lập o Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy cấy đường dích dắc trên ¼ hộp petri. o Lấy que cấy ra đốt nóng để nguội và tiếp tục kéo vi sinh vật ở ¼ đã cấy và cấy tương tự như trên tại ¼ của phần thứ 2 o Tiếp tục thao tác trên với phần thứ ba và thứ tư. o Lật ngược, bao gói hộp petri và nuôi trong tủ ấm trong 48 giờ.Lưu ý: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 16
o Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn. o Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tư khác nhau. Hình . Các kiểu cấy ria III. Tính toán và kết quả Hộp bị nhiễm không tính Xét điều kiện nếu không thỏa sẽ không tính. Công thức tính X= (tế bào/1ml mẫu) Trong đó: ⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn. n1, n2, n3: số hộp petri gieo cấy ở các nồng độ khác nhau dn: hệ số pha loãng gieo cấy đậm đặc. Kết quả thu được: Bảng . Kết quả thí nghiệm tìm số tế bào/1ml mẫu n1 n2 n3 dn X 118 0 2 1 104 5 619 048 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 17
Vậy số tế bào/1ml mẫu: X= 5.619.048 ≈ 5,6×106 tế bào. Số tế bào/ 1ml mẫu ban đầu = X.100/5 = 112.380.960 ≈ 1,1×108 tế bào IV. Bàn luận và mở rộng Một số phương pháp khác để định lượng vi sinh vật hoặc đánh giá sự sinh trưởng của chúng Bảng . Nhóm các phương pháp định lượng vi sinh vật Nhóm phương pháp Tên phương pháp Phạm vi áp dụng Phương pháp xác định Kỹ thuật đếm tế bào Khảo sát sự sinh trưởng VSV số lượng tế bào trên buồng đếm trong canh trường lên men Kỹ thuật Breed Phương pháp nuôi cấy Định lượng VSV trong thực trên môi trường đặc phẩm Khảo sát sự sinh trưởng của VSV trong canh trường lên men Phương pháp xác định Phương pháp đo độ đục Khảo sát sự sinh trưởng của sinh khối Phương pháp xác định VSV trong canh trường lên men hàm lượng chất khô của sinh khối.. Phương pháp xác định Hàm lượng ATP nội Định lượng VSV trong thực hàm lượng các chất bào phẩm nội bào Khảo sát sự sinh trưởng của VSV trong canh trường lên men Hàm lượng NAD, Khảo sát sự sinh trưởng của NADH,.. VSV trong canh trường lên men Hàm lượng nitơ tổng Phương pháp xác định Động học quá trình sử Khảo sát sự sinh trưởng của hoạt tính của sinh khối dụng cơ chất VSV trong canh trường lên Động học quá trình tạo men sản phẩm Ở đây xin cung cấp thêm một số thông tin về 2 phương pháp định lượng VSV trực tiếp thường dùng sau phương pháp dùng buồng đếm hình cầu: phương pháp đo độ đục và MPN Phương pháp đo độ đục: o Cơ sở: khi pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan sẽ tạo thành hệ huyền phù và có độ đục bởi các thành phần trong môi trường lỏng cản ánh sang, làm phân tán chùm sáng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 18
tới. Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm đục môi trường o Phương pháp: xác lập quan hệ tỉ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào VSV và độ đục. o Xây dựng phương trình đường chuẩn o Định lượng gián tiếp thông qua độ đục OD dựa vảo đường chuẩn. Phương pháp MPN: o Là phương pháp pha loãng tới hạn hay còn gọi phương pháp sử dụng chỉ số xác suất cao nhất. o Cơ sở: phân tích thống kê số liệu. BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT NÓI CHUNG TRÊN KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC I. Giới thiệu sơ lược kính hiển vi Kính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát. Phân loại: kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử.. Cấu tạo của kính hiển vi quang học( gồm 2 bộ phận: cơ học và quang học): Bảng . Cấu tạo kính hiển vi quang học Bộ phận cơ học Bộ phận quang học Ống kính Bộ tụ quang: một hệ thống thấu Đế kính kính ghép lại, có tác dụng tập trung Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 19
Bàn kính ánh sáng để chiếu vào tiêu bản. Ốc di chuyển Vật kính: gồm nhiều thấu kính Nút chỉnh (thôtinh) ghép lại. (soi khô: vật kính 10x, 40x hay soi dầu: vật kính 90x, 100x) Thị kính: lắp ở đầu ống kính, có cấu tạo gồm hai thấu kính (thị kính 7x, 10x, 15x…) Đèn chiếu sáng. Hình . Cấu tạo kính hiển vi quang học II. Các sử dụng kính hiển vi quang học Làm tiêu bản, sau đó 1. Bật đèn sang 2. Đặt tiêu bản lên bàn kính 3. Xoay vật kính nhỏ nhất về phía tiêu bản (10x) 4. Dùng các ốc di chuyển ngang về phía có lá kính 5. Dùng ốc di chuyển thô (nhanh, ngược chiều kim đồng hồ) để tìm thấy ảnh. 6. Xoay vật kính sang 40x 7. Dùng ốc di chuyển tinh (chậm) để tìm thấy ảnh rõ nhất. 8. Dùng ốc di chuyển tinh (chậm) xoay để nhìn thấy ảnh rõ nét nhất. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 20