Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN<br /> CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ<br /> (Taxus wallichiana Zucc.)<br /> Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ<br /> (Taxus wallichiana). Đối tượng và phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy trong môi trường<br /> lỏng. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV,<br /> định tính và định lượng paclitaxel, baccatin III bằng HPLC. Kết quả: đã khảo sát được các chỉ<br /> tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao<br /> gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng,<br /> độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel<br /> và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được < 0,03% và baccatin III không được ít hơn<br /> 0,005%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được TCCS của SKTB Thông đỏ. Với TCCS xây<br /> dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu<br /> được từ quá trình nuôi cấy sinh khối.<br /> * Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào.<br /> <br /> Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana<br /> Summary<br /> Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass. Subjects<br /> and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media. Evaluate general<br /> specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative<br /> determination of baccatin III by HPLC. Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass<br /> has been evaluated for standardization. From which, we established the standard criteria of<br /> Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative,<br /> quantitative, bacteria count. In which, the most important specifications are qualitative and<br /> quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be<br /> not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005%. Conclusion: Institutional<br /> standard of taxus wallichiana cellmass has been established. With the selected criteria,<br /> the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production<br /> process.<br /> * Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/12/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/12/2014<br /> <br /> 5<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)<br /> phân bố ở Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng)<br /> với số lượng cá thể nhỏ. Đây là dược liệu<br /> ghi trong sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2]. Từ<br /> Thông đỏ chiết xuất được paclitaxel (biệt<br /> dược taxol) sử dụng phổ biến và hiệu quả<br /> trong điều trị nhiều loại ung thư như: ung<br /> thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dạ<br /> dày... Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ<br /> tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp<br /> ứng được nhu cầu điều trị ung thư (do tốc<br /> độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt<br /> chất thấp). Để khắc phục nhược điểm<br /> này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân<br /> giống, trồng phát triển nguồn gen cây<br /> Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật là<br /> hướng đi mới có triển vọng trong sản xuất<br /> các hoạt chất từ dược liệu nói chung và<br /> các loài Thông đỏ nói riêng [3]. Học viện<br /> Quân y đã nghiên cứu thành công quy<br /> trình SKTB Thông đỏ ở quy mô phòng thí<br /> nghiệm để chiết xuất paclitaxel cũng như<br /> các dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu<br /> bào chế thuốc điều trị ung thư [4]. Để có<br /> căn cứ cho việc thẩm định quy trình sản<br /> xuất sinh khối, cũng như sử dụng sản<br /> phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất<br /> paclitaxel và các hoạt chất được ổn định,<br /> cần có nghiên cứu về xây dựng tiêu<br /> chuẩn chất lượng sản phẩm. Chúng tôi<br /> nghiên cứu đề tài này nhằm: Khảo sát<br /> xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và thiết bị.<br /> Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch<br /> từ nuôi cấy trong môi trường lỏng<br /> hildebrandt, được rửa sạch, sấy khô (lô<br /> 6<br /> <br /> SH 03/2011); các hóa chất, dung môi hữu<br /> cơ đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết<br /> phân tích; chất chuẩn paclitaxel và baccatin<br /> III (Sigma).<br /> Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert<br /> GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG,<br /> Đức). Máy cất quay (Rotavapor R-200,<br /> Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ<br /> chính xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ chính<br /> xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320<br /> (Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean Úc); sắc ký lỏng hiệu năng cao (Waters 2695D, Mỹ) và một số trang thiết bị khác.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất<br /> lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp<br /> chung của DĐVN IV [1] quy định với<br /> dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn<br /> phần, tro không tan trong axít, độ nhiễm<br /> khuẩn.<br /> - Định tính paclitaxel và baccatin III:<br /> tiến hành định tính bằng phương pháp<br /> HPLC [5], phân tích sắc ký đồ của mẫu<br /> thử với dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn<br /> và với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn.<br /> - Định lượng paclitaxel và baccatin III:<br /> bằng phương pháp HPLC đã khảo sát<br /> trước đó [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột<br /> Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x<br /> 4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất<br /> (chạy theo chương trình gradient), thể tích<br /> bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm),<br /> cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.<br /> Xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát [5].<br /> So sánh diện tích pic của mẫu thử với<br /> paclitaxel và baccatin III chuẩn. Từ đó<br /> tính được hàm lượng paclitaxel và baccatin<br /> III trong mẫu sinh khối.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hình thức cảm quan.<br /> Thấy SKTB Thông đỏ là những khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc,<br /> không có mùi lạ.<br /> 2. Độ ẩm.<br /> Cân chính xác 1,000 g SKTB Thông đỏ. Tiến hành theo phương pháp mô tả trong<br /> phụ lục 9.6 - DĐVN IV.<br /> Bảng 1: Kết quả xác định độ ẩm trong SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> g<br /> <br /> X<br /> <br /> g<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,1124<br /> <br /> 1,0568<br /> <br /> 5,00<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,1920<br /> <br /> 1,1429<br /> <br /> 4,12<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,1154<br /> <br /> 1,0612<br /> <br /> 4,86<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,0256<br /> <br /> 0,9784<br /> <br /> 4,60<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,0325<br /> <br /> 0,9827<br /> <br /> 4,82<br /> 4,68 ± 0,34<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Độ ẩm trong SKTB Thông đỏ là 4,68 ± 0,34%.<br /> 3. Tro toàn phần.<br /> Cân chính xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương<br /> pháp mô tả trong phụ lục 9.8 - DĐVN IV.<br /> Bảng 2: Kết quả xác định tro toàn phần của SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> (g)<br /> <br /> X<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,5235<br /> <br /> 0,0943<br /> <br /> 7,19<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,5795<br /> <br /> 0,0979<br /> <br /> 6,20<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,5987<br /> <br /> 0,1092<br /> <br /> 6,83<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,5654<br /> <br /> 0,1001<br /> <br /> 6,39<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,5901<br /> <br /> 0,0976<br /> <br /> 6,14<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> 6,35 ± 0,28<br /> <br /> Khối lượng tro toàn phần trong SKTB Thông đỏ là 6,35 ± 0,28%.<br /> 4. Tro không tan trong axít.<br /> Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục<br /> thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục<br /> 9.7 - DĐVN IV.<br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả xác định tro không tan trong axít của SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> g<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> X<br /> <br /> mg<br /> <br /> 1,5235<br /> 1,5795<br /> 1,5987<br /> 1,5654<br /> 1,5901<br /> <br /> 2,7<br /> 2,6<br /> 3,3<br /> 1,8<br /> 2,5<br /> <br /> 0,13<br /> 0,12<br /> 0,15<br /> 0,09<br /> 0,09<br /> 0,11 ± 0,02<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Khối lượng tro không tan trong axít trong dược liệu SKTB Thông đỏ là 0,11 ± 0,02%.<br /> 5. Định tính paclitaxel và baccatin III.<br /> Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ và mẫu Thông đỏ tự nhiên. Tiến hành định<br /> tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC.<br /> a<br /> <br /> 31.144<br /> <br /> 0.020<br /> <br /> 18.626<br /> <br /> 0.025<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.005<br /> <br /> 0.000<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 0.025<br /> 0.020<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> b<br /> <br /> 31.149<br /> <br /> 18.629<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 0.005<br /> 0.000<br /> -0.005<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> 0.025<br /> <br /> 0.020<br /> <br /> AU<br /> <br /> 31.131<br /> <br /> c<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 18.650<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.005<br /> <br /> 0.000<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) và mẫu SKTB Thông đỏ (c).<br /> 8<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Đa số các pic xuất hiện trên mẫu<br /> Thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên pic<br /> của mẫu SKTB Thông đỏ. Tại thời điểm<br /> 18,6 phút và 31,1 phút, ở sắc ký đồ mẫu<br /> SKTB xuất hiện pic giống như các pic của<br /> mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như<br /> vậy, trong SKTB Thông đỏ có baccatin III<br /> và paclitaxel.<br /> 6. Định lƣợng paclitaxel và baccatin III.<br /> Cân chính xác 500,0 mg SKTB đã<br /> nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm<br /> 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000<br /> vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ<br /> 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy<br /> dịch, SKTB trong ống ly tâm được chiết<br /> <br /> như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml<br /> methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào<br /> bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri<br /> clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2<br /> lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết nhexan. Lớp nước được lắc kỹ với<br /> dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các<br /> dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat<br /> khan. Sau khi lọc xong, rửa lớp natri sulfat<br /> bằng 2 - 3 ml dicloromethan. Gộp các dịch<br /> lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi<br /> dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới<br /> cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol.<br /> Lọc qua màng lọc 0,45 m, được dung dịch<br /> tiêm sắc ký.<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ<br /> (n = 6).<br /> mg<br /> mg<br /> <br /> X<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> PACLITAXEL<br /> (mg)<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> BACCA TIN III<br /> (mg)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 524,5<br /> <br /> 4,98<br /> <br /> 0,1809<br /> <br /> 0,0363<br /> <br /> 0,0324<br /> <br /> 0,0065<br /> <br /> 2<br /> <br /> 498,6<br /> <br /> 5,04<br /> <br /> 0,1747<br /> <br /> 0,0369<br /> <br /> 0,0270<br /> <br /> 0,0057<br /> <br /> 3<br /> <br /> 516,7<br /> <br /> 4,97<br /> <br /> 0,1743<br /> <br /> 0,0355<br /> <br /> 0,0304<br /> <br /> 0,0062<br /> <br /> 4<br /> <br /> 505,2<br /> <br /> 4,45<br /> <br /> 0,1743<br /> <br /> 0,0361<br /> <br /> 0,0304<br /> <br /> 0,0063<br /> <br /> 5<br /> <br /> 501,9<br /> <br /> 4,69<br /> <br /> 0,1708<br /> <br /> 0,0357<br /> <br /> 0,0277<br /> <br /> 0,0058<br /> <br /> 6<br /> <br /> 517,4<br /> <br /> 4,87<br /> <br /> 0,1742<br /> <br /> 0,0354<br /> <br /> 0,0300<br /> <br /> 0,0061<br /> <br /> 0,1749 ± 0,0030<br /> <br /> 0,0360<br /> ± 0,0006<br /> <br /> 0,0297 ± 0,0018<br /> <br /> 0,0061 ±<br /> 0,0003<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ lần lượt là 0,0360% và<br /> 0,0061%.<br /> 7. Độ nhiễm khuẩn.<br /> Bảng 5: Kết quả đánh giá độ nhiễm khuẩn của SKTB Thông đỏ.<br /> Y ª u<br /> <br /> 9<br /> <br /> K Õ t<br /> <br /> K Õ t<br /> <br /> Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 104/01 g<br /> <br /> 142 ± 12<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Tống số Enterobacteria không quá 500/01 g<br /> <br /> 94 ± 11<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Nấm và mốc không quá 100/01 g<br /> <br /> 22 ± 2<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Không được có Salmonella/10 g<br /> <br /> Không có<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus<br /> aureus./01 g<br /> <br /> Không có<br /> <br /> Đạt<br /> <br />