intTypePromotion=1
ADSENSE

Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thanh Triều | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

46
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana). Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xây dựng và thẩm định được tiêu chuẩn cơ sở của sinh khối tế bào Thông đỏ. Với tiêu chuẩn cơ sở xây dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của sinh khối tế bào Thông đỏ thu được từ quá trình nuôi cấy sinh khối.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN<br /> CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ<br /> (Taxus wallichiana Zucc.)<br /> Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ<br /> (Taxus wallichiana). Đối tượng và phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy trong môi trường<br /> lỏng. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV,<br /> định tính và định lượng paclitaxel, baccatin III bằng HPLC. Kết quả: đã khảo sát được các chỉ<br /> tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao<br /> gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng,<br /> độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel<br /> và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được < 0,03% và baccatin III không được ít hơn<br /> 0,005%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được TCCS của SKTB Thông đỏ. Với TCCS xây<br /> dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu<br /> được từ quá trình nuôi cấy sinh khối.<br /> * Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào.<br /> <br /> Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana<br /> Summary<br /> Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass. Subjects<br /> and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media. Evaluate general<br /> specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative<br /> determination of baccatin III by HPLC. Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass<br /> has been evaluated for standardization. From which, we established the standard criteria of<br /> Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative,<br /> quantitative, bacteria count. In which, the most important specifications are qualitative and<br /> quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be<br /> not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005%. Conclusion: Institutional<br /> standard of taxus wallichiana cellmass has been established. With the selected criteria,<br /> the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production<br /> process.<br /> * Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/12/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 29/12/2014<br /> <br /> 5<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)<br /> phân bố ở Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng)<br /> với số lượng cá thể nhỏ. Đây là dược liệu<br /> ghi trong sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2]. Từ<br /> Thông đỏ chiết xuất được paclitaxel (biệt<br /> dược taxol) sử dụng phổ biến và hiệu quả<br /> trong điều trị nhiều loại ung thư như: ung<br /> thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dạ<br /> dày... Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ<br /> tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp<br /> ứng được nhu cầu điều trị ung thư (do tốc<br /> độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt<br /> chất thấp). Để khắc phục nhược điểm<br /> này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân<br /> giống, trồng phát triển nguồn gen cây<br /> Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật là<br /> hướng đi mới có triển vọng trong sản xuất<br /> các hoạt chất từ dược liệu nói chung và<br /> các loài Thông đỏ nói riêng [3]. Học viện<br /> Quân y đã nghiên cứu thành công quy<br /> trình SKTB Thông đỏ ở quy mô phòng thí<br /> nghiệm để chiết xuất paclitaxel cũng như<br /> các dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu<br /> bào chế thuốc điều trị ung thư [4]. Để có<br /> căn cứ cho việc thẩm định quy trình sản<br /> xuất sinh khối, cũng như sử dụng sản<br /> phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất<br /> paclitaxel và các hoạt chất được ổn định,<br /> cần có nghiên cứu về xây dựng tiêu<br /> chuẩn chất lượng sản phẩm. Chúng tôi<br /> nghiên cứu đề tài này nhằm: Khảo sát<br /> xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và thiết bị.<br /> Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch<br /> từ nuôi cấy trong môi trường lỏng<br /> hildebrandt, được rửa sạch, sấy khô (lô<br /> 6<br /> <br /> SH 03/2011); các hóa chất, dung môi hữu<br /> cơ đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết<br /> phân tích; chất chuẩn paclitaxel và baccatin<br /> III (Sigma).<br /> Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert<br /> GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG,<br /> Đức). Máy cất quay (Rotavapor R-200,<br /> Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ<br /> chính xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ chính<br /> xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320<br /> (Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean Úc); sắc ký lỏng hiệu năng cao (Waters 2695D, Mỹ) và một số trang thiết bị khác.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất<br /> lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp<br /> chung của DĐVN IV [1] quy định với<br /> dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn<br /> phần, tro không tan trong axít, độ nhiễm<br /> khuẩn.<br /> - Định tính paclitaxel và baccatin III:<br /> tiến hành định tính bằng phương pháp<br /> HPLC [5], phân tích sắc ký đồ của mẫu<br /> thử với dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn<br /> và với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn.<br /> - Định lượng paclitaxel và baccatin III:<br /> bằng phương pháp HPLC đã khảo sát<br /> trước đó [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột<br /> Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x<br /> 4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất<br /> (chạy theo chương trình gradient), thể tích<br /> bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm),<br /> cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.<br /> Xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát [5].<br /> So sánh diện tích pic của mẫu thử với<br /> paclitaxel và baccatin III chuẩn. Từ đó<br /> tính được hàm lượng paclitaxel và baccatin<br /> III trong mẫu sinh khối.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hình thức cảm quan.<br /> Thấy SKTB Thông đỏ là những khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc,<br /> không có mùi lạ.<br /> 2. Độ ẩm.<br /> Cân chính xác 1,000 g SKTB Thông đỏ. Tiến hành theo phương pháp mô tả trong<br /> phụ lục 9.6 - DĐVN IV.<br /> Bảng 1: Kết quả xác định độ ẩm trong SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> g<br /> <br /> X<br /> <br /> g<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,1124<br /> <br /> 1,0568<br /> <br /> 5,00<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,1920<br /> <br /> 1,1429<br /> <br /> 4,12<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,1154<br /> <br /> 1,0612<br /> <br /> 4,86<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,0256<br /> <br /> 0,9784<br /> <br /> 4,60<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,0325<br /> <br /> 0,9827<br /> <br /> 4,82<br /> 4,68 ± 0,34<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Độ ẩm trong SKTB Thông đỏ là 4,68 ± 0,34%.<br /> 3. Tro toàn phần.<br /> Cân chính xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương<br /> pháp mô tả trong phụ lục 9.8 - DĐVN IV.<br /> Bảng 2: Kết quả xác định tro toàn phần của SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> (g)<br /> <br /> X<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1,5235<br /> <br /> 0,0943<br /> <br /> 7,19<br /> <br /> 2<br /> <br /> 1,5795<br /> <br /> 0,0979<br /> <br /> 6,20<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1,5987<br /> <br /> 0,1092<br /> <br /> 6,83<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,5654<br /> <br /> 0,1001<br /> <br /> 6,39<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,5901<br /> <br /> 0,0976<br /> <br /> 6,14<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> 6,35 ± 0,28<br /> <br /> Khối lượng tro toàn phần trong SKTB Thông đỏ là 6,35 ± 0,28%.<br /> 4. Tro không tan trong axít.<br /> Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục<br /> thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục<br /> 9.7 - DĐVN IV.<br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả xác định tro không tan trong axít của SKTB Thông đỏ (n = 5).<br /> g<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> X<br /> <br /> mg<br /> <br /> 1,5235<br /> 1,5795<br /> 1,5987<br /> 1,5654<br /> 1,5901<br /> <br /> 2,7<br /> 2,6<br /> 3,3<br /> 1,8<br /> 2,5<br /> <br /> 0,13<br /> 0,12<br /> 0,15<br /> 0,09<br /> 0,09<br /> 0,11 ± 0,02<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Khối lượng tro không tan trong axít trong dược liệu SKTB Thông đỏ là 0,11 ± 0,02%.<br /> 5. Định tính paclitaxel và baccatin III.<br /> Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ và mẫu Thông đỏ tự nhiên. Tiến hành định<br /> tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC.<br /> a<br /> <br /> 31.144<br /> <br /> 0.020<br /> <br /> 18.626<br /> <br /> 0.025<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.005<br /> <br /> 0.000<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 32.00<br /> <br /> 34.00<br /> <br /> 36.00<br /> <br /> 38.00<br /> <br /> 40.00<br /> <br /> 0.025<br /> 0.020<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> b<br /> <br /> 31.149<br /> <br /> 18.629<br /> <br /> AU<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 0.005<br /> 0.000<br /> -0.005<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> 0.025<br /> <br /> 0.020<br /> <br /> AU<br /> <br /> 31.131<br /> <br /> c<br /> <br /> 0.015<br /> <br /> 18.650<br /> <br /> 0.010<br /> <br /> 0.005<br /> <br /> 0.000<br /> 10.00<br /> <br /> 12.00<br /> <br /> 14.00<br /> <br /> 16.00<br /> <br /> 18.00<br /> <br /> 20.00<br /> <br /> 22.00<br /> <br /> 24.00<br /> 26.00<br /> Minutes<br /> <br /> 28.00<br /> <br /> 30.00<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) và mẫu SKTB Thông đỏ (c).<br /> 8<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Đa số các pic xuất hiện trên mẫu<br /> Thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên pic<br /> của mẫu SKTB Thông đỏ. Tại thời điểm<br /> 18,6 phút và 31,1 phút, ở sắc ký đồ mẫu<br /> SKTB xuất hiện pic giống như các pic của<br /> mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như<br /> vậy, trong SKTB Thông đỏ có baccatin III<br /> và paclitaxel.<br /> 6. Định lƣợng paclitaxel và baccatin III.<br /> Cân chính xác 500,0 mg SKTB đã<br /> nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm<br /> 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000<br /> vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ<br /> 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy<br /> dịch, SKTB trong ống ly tâm được chiết<br /> <br /> như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml<br /> methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào<br /> bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri<br /> clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2<br /> lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết nhexan. Lớp nước được lắc kỹ với<br /> dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các<br /> dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat<br /> khan. Sau khi lọc xong, rửa lớp natri sulfat<br /> bằng 2 - 3 ml dicloromethan. Gộp các dịch<br /> lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi<br /> dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới<br /> cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol.<br /> Lọc qua màng lọc 0,45 m, được dung dịch<br /> tiêm sắc ký.<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ<br /> (n = 6).<br /> mg<br /> mg<br /> <br /> X<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> PACLITAXEL<br /> (mg)<br /> <br /> KHỐI LƯỢNG<br /> BACCA TIN III<br /> (mg)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 524,5<br /> <br /> 4,98<br /> <br /> 0,1809<br /> <br /> 0,0363<br /> <br /> 0,0324<br /> <br /> 0,0065<br /> <br /> 2<br /> <br /> 498,6<br /> <br /> 5,04<br /> <br /> 0,1747<br /> <br /> 0,0369<br /> <br /> 0,0270<br /> <br /> 0,0057<br /> <br /> 3<br /> <br /> 516,7<br /> <br /> 4,97<br /> <br /> 0,1743<br /> <br /> 0,0355<br /> <br /> 0,0304<br /> <br /> 0,0062<br /> <br /> 4<br /> <br /> 505,2<br /> <br /> 4,45<br /> <br /> 0,1743<br /> <br /> 0,0361<br /> <br /> 0,0304<br /> <br /> 0,0063<br /> <br /> 5<br /> <br /> 501,9<br /> <br /> 4,69<br /> <br /> 0,1708<br /> <br /> 0,0357<br /> <br /> 0,0277<br /> <br /> 0,0058<br /> <br /> 6<br /> <br /> 517,4<br /> <br /> 4,87<br /> <br /> 0,1742<br /> <br /> 0,0354<br /> <br /> 0,0300<br /> <br /> 0,0061<br /> <br /> 0,1749 ± 0,0030<br /> <br /> 0,0360<br /> ± 0,0006<br /> <br /> 0,0297 ± 0,0018<br /> <br /> 0,0061 ±<br /> 0,0003<br /> <br /> ± SD<br /> <br /> Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ lần lượt là 0,0360% và<br /> 0,0061%.<br /> 7. Độ nhiễm khuẩn.<br /> Bảng 5: Kết quả đánh giá độ nhiễm khuẩn của SKTB Thông đỏ.<br /> Y ª u<br /> <br /> 9<br /> <br /> K Õ t<br /> <br /> K Õ t<br /> <br /> Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 104/01 g<br /> <br /> 142 ± 12<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Tống số Enterobacteria không quá 500/01 g<br /> <br /> 94 ± 11<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Nấm và mốc không quá 100/01 g<br /> <br /> 22 ± 2<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Không được có Salmonella/10 g<br /> <br /> Không có<br /> <br /> Đạt<br /> <br /> Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus<br /> aureus./01 g<br /> <br /> Không có<br /> <br /> Đạt<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2