Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blue

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ BẤT THƢỜNG CÔ ĐẶC NHIỄM SẮC THỂ TINH TRÙNG<br /> BẰNG NHUỘM ANILINE BLUE<br /> Nguyễn Thanh Hoa*; Phan Nữ Thục Hiền*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST)<br /> tinh trùng. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu tinh dịch chất lượng bình thường theo tiêu<br /> chuẩn WHO (2010). Tiến hành nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST. Xem xét mối liên quan<br /> giữa mức độ cô đặc NST tinh trùng và hình thái tinh trùng. Kết quả: nhuộm AB cho hình ảnh<br /> tinh trùng bất thường cô đặc NST có đầu bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng bình thường cô đặc<br /> NST không bắt màu thuốc nhuộm. Không có mối liên quan giữa bất thường hình thái và bất<br /> thường cô đặc NST tinh trùng. Kết luận: có thể sử dụng nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc<br /> NST tinh trùng như một xét nghiệm độc lập không liên quan đến hình thái tinh trùng.<br /> * Từ khóa: Cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng; Nhuộm aniline blue; Hình thái tinh trùng.<br /> <br /> Assessment of Mature Sperm by Aniline Blue Stain<br /> Summary<br /> Objectives: Aniline blue stain test evaluated sperm chromatin condensation or sperm<br /> nucleus maturity. Subjects and methods: 40 semen samples with normal quality semen<br /> according to WHO 2010 standard. Using AB stain to evaluate chromatin condensation sperm.<br /> Assess the relationship between abnormal chromatin condensation and abnormal sperm<br /> morphology. Results: Abnormal chromatin condensation sperms (immature chromatin sperms)<br /> had blue-stained nucleus, normal chromatin condensation (mature sperm) had unstained<br /> nucleus. There is no correlation between sperm morphology and sperm maturity. Conclusion:<br /> AB stain can be used to assess sperm chromatin condensation as an independent test that<br /> does not involve sperm morphology.<br /> * Keywords: Sperm chromatin condensation; Aniline blue stain; Morphology sperm.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Vô sinh nam chiếm một nửa nguyên<br /> nhân gây vô sinh nói chung. Tinh dịch đồ là<br /> xét nghiệm đầu tiên được chỉ định để chẩn<br /> đoán nguyên nhân vô sinh nam nhưng<br /> không đánh giá được hết khả năng sinh<br /> sản của nam giới. Trong quá trình sinh tinh,<br /> đóng gói hay cô đặc NST tinh trùng nhằm<br /> <br /> bảo vệ vật chất di truyền, đảm bảo chức<br /> năng sinh sản của tinh trùng. Quá trình này<br /> gồm có sự thay đổi các histone trong ADN<br /> bằng biến thể histone, sau đó là protein<br /> chuyển tiếp và cuối cùng là protamine [1].<br /> Nhiều nghiên cứu chỉ ra bất thường ADN<br /> tinh trùng gặp nhiều hơn ở nam giới vô sinh<br /> và liên quan đến sảy thai tự phát cũng như<br /> thất bại trong hỗ trợ sinh sản.<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Hoa (thanhhoa.mophoi@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> 87<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Các phương pháp đánh giá bất thường<br /> về ADN như SCSA (Sperm chromatin<br /> structure assay), TUNEL (Terminal<br /> deoxynucleotidyl transferase dUTP nick<br /> end labling), phương pháp phân tích sao<br /> chổi (Comet assay) hay các dấu ấn sinh<br /> học... trang thiết bị phức tạp, chi phí cao,<br /> khó áp dụng rộng r i trong điều kiện<br /> Việt Nam hiện nay. Trong khi đó, nhuộm<br /> AB là phương pháp có thể đánh giá được<br /> mức độ hoàn thiện trong khâu đóng gói<br /> ADN tinh trùng, dễ thực hiện, giá thành<br /> rẻ. Nguyên lý của phương pháp này dựa<br /> trên việc AB phản ứng với lysine nên có<br /> thể phân biệt được sự khác biệt trong<br /> thành phần protein nhân cơ bản của tinh<br /> trùng. Nhân tinh trùng chưa trưởng thành<br /> hay bất thường về cô đặc NST rất giàu<br /> histon chứa hàm lượng lysine phong phú<br /> nên bắt màu thuốc nhuộm xanh da trời.<br /> Ngược lại, nhân tinh trùng trưởng thành<br /> giàu protaime có hàm lượng lysine rất<br /> thấp không bắt màu AB.<br /> Trên thế giới, các nghiên cứu vẫn còn<br /> nhiều tranh cãi về tương quan giữa tỷ lệ<br /> tinh trùng bất thường ngưng tụ NST và<br /> các thông số khác của tinh dịch đồ [2, 3].<br /> Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào ứng<br /> dụng phương pháp này. Do đó, chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Thử<br /> nghiệm nhuộm AB và bước đầu đánh giá<br /> mối liên quan giữa bất thường cô đặc NST<br /> của tinh trùng bằng nhuộm AB và hình thái<br /> tinh trùng.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 40 mẫu tinh dịch có chất lượng bình<br /> thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).<br /> 88<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Nghiên cứu mô tả cắt ngang.<br /> * Kỹ thuật:<br /> - Lấy mẫu: mẫu tinh dịch được bệnh<br /> nhân (BN) tự lấy bằng phương pháp thủ<br /> dâm, đựng trong cốc chuyên dụng không<br /> độc với tinh trùng. Sau lấy, để trong tủ ấm<br /> 37°C đợi tinh dịch ly giải hoàn toàn.<br /> - Đánh giá chất lượng tinh dịch trước<br /> nhuộm. Lựa chọn các mẫu chất lượng bình<br /> thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).<br /> - Đánh giá bất thường về hình thái<br /> theo từng đặc điểm: nhuộm lam hình thái<br /> theo quy trình thường quy. Đánh giá hình<br /> thái của 200 tinh trùng dưới vật kính dầu<br /> độ phóng đại x 1.000 lần. Tính tỷ lệ % từng<br /> loại bất thường, gồm bất thường đầu,<br /> bất thường cổ, bất thường đuôi và bất<br /> thường chung.<br /> - Đánh giá bất thường cô đặc NST của<br /> tinh trùng bằng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinh<br /> dịch lên lam kính, dùng lam khác kéo làm<br /> lam đàn; để khô trong nhiệt độ phòng; cố<br /> định bằng nhỏ PFA 4% trong 30 phút; rửa<br /> bằng PBS 0,1 M x 2 lần. Nhỏ 10 μl AB 5%<br /> trong dung dịch axít acetic 4% (pH 3.5)<br /> phủ kín lam đàn. Để trong vòng 5 phút;<br /> rửa sạch bằng PBS 0,1 M x 2 lần; để khô<br /> ở nhiệt độ phòng.<br /> - Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh<br /> trùng bằng kính hiển vi quang học, đếm<br /> 200 tinh trùng sử dụng vật kính dầu độ<br /> phóng đại x 1.000 lần:<br /> + Tinh trùng chưa trưởng thành có phần<br /> đầu bắt màu xanh đậm của AB.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> + Tinh trùng bán trưởng thành có phần<br /> đầu vẫn bắt màu thuốc nhuộm chiếm < 50%<br /> diện tích đầu.<br /> + Tinh trùng trưởng thành đầu không<br /> bắt màu.<br /> <br /> Bảng 1: Đặc điểm chung vi thể tinh dịch<br /> đồ nghiên cứu.<br /> Đặc điểm<br /> <br /> * Chỉ tiêu nghiên cứu:<br /> <br /> Mật độ (triệu/ml)<br /> <br /> - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đầu.<br /> <br /> Di động<br /> <br /> Giá trị Giá trị<br /> lớn<br /> nhỏ<br /> nhất<br /> nhất<br /> <br /> Trung bình<br /> ( X ± SD)<br /> <br /> 210<br /> <br /> 20<br /> <br /> 72,18 ± 36,42<br /> <br /> - Tỷ lệ tinh trùng bất thường cổ.<br /> <br /> PR (%)<br /> <br /> 84<br /> <br /> 38<br /> <br /> 58,68 ± 10,70<br /> <br /> - Tỷ lệ tinh trùng bất thường đuôi.<br /> <br /> PR + NP (%)<br /> <br /> 85<br /> <br /> 42<br /> <br /> 66,90 ± 10,39<br /> <br /> 18<br /> <br /> 4<br /> <br /> 10,30 ± 4,21<br /> <br /> - Tỷ lệ tinh trùng bất thường chung.<br /> - Tỷ lệ tinh trùng bất thường cô đặc.<br /> <br /> NST =<br /> <br /> Hình thái bình<br /> thường (%)<br /> <br /> Nhóm nghiên cứu có chất lượng vi thể<br /> tinh dịch đồ trong giới hạn bình thường.<br /> Bảng 2: Đặc điểm hình thái bất thường.<br /> <br /> * Thời gian và địa điểm nghiên cứu:<br /> từ tháng 10 - 2016 đến 4 - 2017 tại Trung<br /> tâm Hỗ trợ Sinh sản và Công nghệ Mô ghép,<br /> Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.<br /> * Phân tích và xử lý số liệu:<br /> - Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS<br /> 16.0.<br /> - Kiểm tra mối tương quan bằng hàm<br /> Scatter. Xét mối tương quan: |R| < 0,3:<br /> không có mối tương quan; 0,3 < |R| < 0,5:<br /> mối tương quan lỏng lẻo; 0,5 < |R| < 0,7:<br /> mối tương quan trung bình; |R| > 0,7: mối<br /> tương quan chặt chẽ.<br /> <br /> Đặc điểm bất<br /> thƣờng (%)<br /> <br /> Giá trị Giá trị<br /> ớn<br /> nhỏ<br /> nhất<br /> nhất<br /> <br /> Bất thường đầu<br /> <br /> 91<br /> <br /> 77<br /> <br /> 83,88 ± 4,13<br /> <br /> Bất thường cổ<br /> <br /> 49<br /> <br /> 12<br /> <br /> 30,28 ± 8,61<br /> <br /> Bất thường đuôi<br /> <br /> 21<br /> <br /> 2<br /> <br /> 6,75 ± 3,97<br /> <br /> Bất thường chung<br /> <br /> 96<br /> <br /> 82<br /> <br /> 89,25 ± 4,05<br /> <br /> Trong các dạng bất thường, bất thường<br /> đầu gặp tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến là bất<br /> thường cổ, bất thường đuôi ít gặp nhất.<br /> Bảng 3: Đặc điểm về bất thường cô đặc<br /> NST sau nhuộm AB.<br /> <br /> * Đạo đức nghiên cứu:<br /> - Nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng<br /> chăm sóc sức khỏe BN.<br /> <br /> Đặc điểm<br /> cô đặc NST (%)<br /> <br /> - Mẫu sau nghiên cứu sẽ được hủy bỏ.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu nhuộm<br /> AB.<br /> Nghiên cứu sử dụng 40 mẫu tinh dịch<br /> bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).<br /> <br /> Trung nh<br /> ( X ± SD)<br /> <br /> Giá<br /> trị<br /> ớn<br /> nhất<br /> <br /> Giá<br /> trị Trung nh<br /> nhỏ<br /> ( X ± SD)<br /> nhất<br /> <br /> Tinh trùng bất thường<br /> <br /> 29<br /> <br /> 4<br /> <br /> 16,25 ± 5,83<br /> <br /> Chưa trưởng thành<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 8,20 ± 4,84<br /> <br /> Bán trưởng thành<br /> <br /> 15<br /> <br /> 3<br /> <br /> 8,05 ± 2,98<br /> <br /> Tinh trùng bình thường<br /> <br /> 96<br /> <br /> 71<br /> <br /> 83,75 ± 5,83<br /> <br /> Dưới đây là một số hình ảnh nhuộm<br /> mức độ trưởng thành tinh trùng bằng AB.<br /> 89<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> Hình 1: Mức độ trưởng thành của tinh trùng (nhuộm AB; x400).<br /> (1. Tinh trùng trưởng thành; 2. Tinh trùng bán trưởng thành; 3. Tinh trùng chưa trưởng thành)<br /> <br /> 2. Mối liên quan giữa bất thƣờng hình thái và bất thƣờng cô đặc NST.<br /> <br /> Biểu đồ 1: Mối tương quan giữa bất thường hình thái đầu tinh trùng và<br /> bất thường cô đặc NST.<br /> Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa tinh trùng bất thường đầu với bất thường cô<br /> đặc NST (R = 0,330).<br /> <br /> Biểu đồ 2: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ và bất thường cô đặc NST.<br /> Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ với bất thường cô đặc NST<br /> (R = 0,257 < 0,3).<br /> 90<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> Biểu đồ 3: Mối liên quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST.<br /> Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST<br /> (R = 0,03 < 0,3).<br /> <br /> Biểu đồ 4: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường chung và<br /> bất thường cô đặc NST.<br /> Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa bất thường hình thái tinh trùng mức độ vi thể<br /> và bất thường cô đặc NST (R = 0,430).<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Phƣơng pháp đánh giá ất thƣờng<br /> cô đặc NST của tinh trùng ằng nhuộm<br /> AB.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử<br /> dụng phương pháp nhuộm AB để kiểm<br /> tra bất thường cô đặc NST của tinh trùng.<br /> <br /> Phương pháp này có ưu điểm dễ thực hiện,<br /> giá thành rẻ, nhanh chóng và kỹ thuật<br /> tương đối đơn giản so với các kỹ thuật<br /> đánh giá độ trưởng thành của tinh trùng<br /> khác như sử dụng các chất đánh dấu sinh<br /> học của tinh trùng trưởng thành (creatine<br /> kinase, heat shock protein HspA2 chaperone<br /> và hyaluronic axít).<br /> 91<br /> <br />