Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

Chia sẻ: Trần Văn Khải | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

135
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2 trình bày nội dung với kết cấu 4 chương: Tổng quan về đề tài nghiên cứu; Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu; Kết quả nghiên cứu; Kết luận và kiến nghị,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu các điều kiện thích hợp Sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Kim Dung – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu và giảng dạy. Tôi xin chân thành cảm ơn! Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Vũ Kim Dung Phạm Nhật Thành
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tử pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt phải kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trên đối tượng cà rốt. Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích khá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ. Trước đây nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh v ật là lựa chọn hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009). Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sản xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp.
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase 1.1.1. Cơ chất pectin Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid galacturonic bằng liên kết 1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà pectin có khối lượng phân tử 80.000 200.000 Da. Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri, glycerine nóng. Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thành các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid, vì vậy các pectin tan này không đồng dạng vớinhau. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là D galacturonan hay Dgalacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị Dgalactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu 1,4). Mặt khác, mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa
các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl. Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid. Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòa tan. 1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase 1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin 1.1.2.2. Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng như bảng 1.1. Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase 3. Enzym(t 1. 2. Enzym (tên ên thường Phản ứng xúc tác STT gọi theo hệ thống) gọi) Pectin + H2O = n metanol + 1 Pectinpectinhydrolase pectinesterase pectic acid Thủy phân liên kết 1,4 Poly 1,4 Endopoly Dgalacturonid trong 2 galacturonidglycano galacturonase galacturonid không theo hydrolasePG (endoPG) một trật tự nào Thủy phân liên kết 1,4 Poly 1,4D Exopoly Dgalacturonid trong pectat, 3 galacturonidgalacturo galacturonase trong galacturonic với sự nhydrolase (exoPG) đứt mạch của acid galacturonic Thủy phân liên kết 1,4 Poly 1,4D Endopolymetil Dgalacturonid trong pectin 4 galacturonidmetilester galacturonase không theo một trật tự nhất glycanohydrolase (EndoPMG) định. Thủy phân liên kết 1,4 Poly 1,4D Dgalacturonid trong pectat Exopectatliase 5 galacturonid với sự tạo thành 4,5 (exoPKTE) digalacturonoliase aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. 6 Poly 1,4D Endopectatlias Thủy phân liên kết 1,4 galacturonid e (PETE) Dgalacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự glicanoliase tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định Thủy phân liên kết 1,4 Poly 1,4D Dgalacturonid trong pectin galacturonid Endopectinlias 7 với sự tạo thành nối đôi metylester e (EndoPTE) không theo một trật tự nhất glicanoliase định Polygalacturonase (PG): còn có tên gọi khác là poly 1,4 galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết 1,4 glycoside. Các exoPG (exopoly 1,4Dgalacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ đầu không khử, và endoPG (endo poly 1,4Dgalacturonide) glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không không bị ester hóa. Cả hai enzyme exoPEL (exopoly (1,4 D galacturonide)lyase) và endoPEL (endopoly (1,4 Dgalacturonic) lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,011, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: Pectintranseliminase (poly 1,4 galaturonidmethylesteglucanolise) là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid.
Polygalactorunatetranseliminase (poly1,4 galaturonid– glucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hóa. Tất cả các PNL đều là endoenzyme. 1.1.2.3. Ứng dụng của enzyme pectinase Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase duới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0,03 0,05 đến 0,10%. Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng thành phẩm. Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáu nhóm enzyme sau: Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được luợng sản phẩm lớn. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và thuỷ phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả.
Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang. Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong sản suất siro thành phẩm. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây được chia làm hai loại:  Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi…  Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận đen, dâu…  Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzyme sau: - Enzym endoPmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả. - Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly - Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc. 1.1.2.3.1. Làm trong nước quả Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên
rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm lượng pectine đáng kể. Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như sau: •Syrup mơ: 0,107% •Syrup mận: 0,153% •Nước mận: 0,452% Lượng pectin này làm cho syrup quả bị keo và đục, có độ nhớt cao, nhất là khi quả có độ acid và hàm lượng đường cao như các lọai syrup kể trên Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì pectinase phải có enzym endo và exopolygalacturonase, enzym pectinestenase. Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm. Vì endo và exo polygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũng góp phần vào tác dụng của enzym này. Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của cellulase và hemicellulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép có enzyme pectinaseliminase và enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả trong cũng không được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase, poliphenoloxydase). Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase và cellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm.Trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ protopectin của mô quả. Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm không chứa enzym oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không chứa enzym phá huỷ các chất này. Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase, người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhanh được đem xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá trình ép sau này. Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn toàn. Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất hoà tan. Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại trừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn. Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn toàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn.
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm 3 giai đoạn: + Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ” + Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi kết tủa hoàn toàn. + Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các pectin kết tủa bởi ion canxi Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt độ 1,950 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cupectat) hoặc 0,768 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp so màu). Dưới tác dụng của pectinase, pectine một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử acid galacturonic (C6H10O7) mà một phần đã được este hoá với rượu metylic (CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic. Pectine là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm () dọc theo chiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (COO) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong toàn bộ dung dịch có chứa pectin. Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó phần tử thịt quả có kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn nên không bền vững về mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng là những phân tử tích điện nên dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành những phân tử lớn dễ dàng lắng xuống. Trong nước quả, sự có mặt của hợp chất polyphenol (đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa không tan v.v... Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên. Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thời gian để so sánh tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu.
Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 9095%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 6070% là tối đa. Khi ta cho pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 1530%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ. Dịch quả thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ. 1.1.2.3.2. Trong sản xuất rượu vang Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ. Enzyme pectin được thêm vào các loại trái cây trước khi bổ sung các men rượu trong quá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục. Rượu vang đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme. Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme. 1.1.2.4. Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase 1.1.2.4.1. Nguồn gốc thu nhận Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú. Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:  Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…  Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …  Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum… 1.1.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt  Quy trình sản xuất
 Thuyết minh quy trình: Môi trường nuôi cấy Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác (mầm mạ, nước khoai tây… để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali…). Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh. Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm. Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 300C thì tiến hành cấy giống. Giống Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh nhiễm tạp. Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường
để cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín. Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kg môi trường. Nuôi cấy Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió. Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30320C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme. Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau:  Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.  Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ.  Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ: giai đoạn này có những thay đổi sau: Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 400 450C. Thời kì này
cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 300 C và độ ẩm trong phòng khoảng 90%. Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng. Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này có những biến đổi Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở 300C. Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn được hình thành ở giai đoạn này. Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô. 1.1.2.4.3. Thu nhận enzyme a. Phương pháp thu nhận Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách và thu nhận riêng: Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch. Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh