Đề tài: Quy trình sản xuất amylase và ứng dụng trong sản xuất mật tinh bột

Chia sẻ: Lương Thi | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:39

Thêm vào BST

Báo xấu

1.295
lượt xem 151
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài: Quy trình sản xuất amylase và ứng dụng trong sản xuất mật tinh bột trình bày tổng quan về enzyme amylase, nguồn thu nhận enzyme amylase, tổng quan về nguồn giống vi sinh vật, quy trình công nghệ sản xuất enzyme α amylase từ aspergyllus oryzae và vai trò và ứng dụng của enzyme amylase.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Quy trình sản xuất amylase và ứng dụng trong sản xuất mật tinh bột

MỤC LỤC : TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE 1.1. Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đ ường ở nhiệt độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme lúc bấy giờ. Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: R.R` + H-OH → RH + R`OH 1.2. Phân loại, đặc tính, cơ chế tác dụng 1.2.1. Phân loại Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase và Exoamylase. Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau
 Endoamylase: - α– amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4- glucoside của cơ chất một α– amylase cách ngẫu nhiên, là enzyme nội bào. α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn.  Enzyme khử nhánh: - Khử trực tiếp (Pullulanase) Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng nhất trong chế biến tinh bột. Enzyme này được sử dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các ngành công nghiệp sirô maltose. Pullulanase là một loại enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa tinh bột thành glucose hoặc maltose. Pullulanase thủy phân α-1,liên kết 6- glycosidic của chuỗi phân nhánh và α-1, 4-glycosidic. Nhóm 6 Trang 2
- Khử gián tiếp Transglucosylase (oligo-1,6- glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase: Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6- glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có thể lên men được.  Exoamylase - β–amylase Nhóm 6 Trang 3
(β-1,4-glucan-maltohydrolase) β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose được hình thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β. γ–amylase (glucose amylase) Glucose amylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6- glucoside, ngoài ra còn có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3- glucoside. Glucose amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác. 1.2.2. Đặc tính Khả năng dextrin hóa: Thủy phân tinh bột --> dextrin + một ít maltoza. Dextrin có khả năng họat hóa cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này. Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme. loãng Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu 2+, + 2+. Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu Ag ,Hg Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và glycogen. • Đặc tính riêng α – amylase có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt: Nhóm 6 Trang 4
Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: với nấm mốc có pH từ 4.5 – 4.9, nấm sợi có pH từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4. 5 – 5.8), vi khuẩn có pH từ 5.9 – 6. 1 (pH
PHẦN 2: NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 2.1. Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành công nghiệp chế biên thực phẩm vd như kẹo mạch nha, bia..khi đó, hạt ngũ cốc được cho nảy màm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp và khi đó ta thu được malt. 2.1.1. Malt đại mạch Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là α-amylase và β-amylase, quá trình nảy màm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa enzyme từ trạng thái khong hoạt đông sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp them hang loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn. hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực của enzyme α-amylase, khi hạ trải qua 3-4 ngày trong giai đoạn nảy màm thì hoạt lực đạt tới mức cực đại vào ngày t7. Sau đosex giảm xuống 2.1.2. Lúa Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy mầm,hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng. Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. khi hạt nảy mầm, chúng lại chuyển sang hoạt động. 2.1.3. Vi sinh vật Trong ba nguồn thực vật, đông vật, vi sinh vật thì vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất để thu nhận enzyme. Cơ bản là do các lí do sau: - Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn Nhóm 6 Trang 6
khác. - Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú. - Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền. - Tốc độ sinh sản rất nhanh. - Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp. PHẦN 3: TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VI SINH VẬT 3.1. Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định: o Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy. o Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzyme). o Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất. o Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm. 3.2. Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme Amylase 3.2.1. Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn. Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase. Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa, Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh Nhóm 6 Trang 7
trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác. 3.2.2. Giới thiệu Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae Đặc điểm cấu trúc hình thái của Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae - Ưu điểm: + Không sinh tổng hợp độc tố + Sinh tổng hợp hợp hợp chất chính cao + Thích nghi nhanh , sinh tổng hợp mạnh + Điều kiện nuôi cấy đơn giản rẻ tiền + Dễ dàng tách khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu enzyme ngoaị bào Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những Nhóm 6 Trang 8
sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus Oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…. o Bào tử cùng thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50 C cho đến khi o độ ẩm
- Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên - Phân lập giống trong điều kiện sản xuất - Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp. mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là một số ưu điểm Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào(thích ứng mạnh mẽ . Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô sản xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự mạnh. Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa vào đặc điểm này chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập vsv có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm. Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua dại. Mật độ tế bào vi sinh quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hóa hơn các giống vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước Nhóm 6 Trang 10
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận của những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất cao. Phân lập giống trong môi trường giống đã hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tế bào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt. Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo đảm chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rửa sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nylon và mang về phòng thí nghiệm. Tiền hành thí nghiệm phân lập: • Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây • Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo mẫu. • Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. • Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. • Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar ) Nhóm 6 Trang 11
• Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày. • Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sánh xung quanh khuẩn lạc. • Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. • Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ ).  Đổ 10ml H O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử 2 nấm.  Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.  Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4 mg NH4NO3 10 mg KCl 0,5 mg MnSO4.7H2O 0,1 mg FeSO4.7H2O 0,01 mg Hồ tinh bột 20 g pH =6,5 Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi 0 Autoclave ở 73 - 121 C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó 0 đem ủ ở 25 – 30 C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng / phút. Sau khi nhân Nhóm 6 Trang 12
giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ. Để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp. 3.2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme là đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của hoạt tính enzyme. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau:  Cấy truyền và bảo quản lạnh Phương pháp dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này vi sinh vật có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzyme. Cách thực hiện : Ống giống vi sinh vật được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản. Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống. Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điểu kiện nhiệt độ 0 lạnh từ 4-7 C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục.  Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vi sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp.oryzae. Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp.oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.  Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc Nhóm 6 Trang 13
Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài. Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều. 3.3. Yêu cầu đối với giống vi sinh vật Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là: o Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng. o Giống phải cho năng suất sinh học cao. o Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. o Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động. o Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. o Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống. Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản. Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết. Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành Nhóm 6 Trang 14
phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase.Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản quan trọng nhất. PHẦN 4: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME Α- AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE 4.1. Bảo quản giống Aspergyllus oryzae: o - Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130 C trong 30 phút. - Trộn bào tử vào cát. o - Sấy chân không < 40 C (độ ẩm 5%). - Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông. - Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn. 4.2. Nguyên liệu: - Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%. - Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị chua Nhóm 6 Trang 15
hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. - Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: trấu, mạt cưa…. 4.3. Sơ đồ công nghệ: sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt Nuôi cấy bề mặt: Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. 4.4. Thuyết minh quy trình: - Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10- 14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%. - Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị chua Nhóm 6 Trang 16
hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. - Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: trấu, mạt cưa… - Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các tạp chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo. o - Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95 C trong 60 phút. Đồng thời phải thanh trùng khay lên men. - Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi trường/khay. - Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so với khối lượng của môi trường ở mỗi khay. - Đưa khay lên các giá đỡ o - Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30 C, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí. - Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô. Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme o - Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ 30-40 C, độ ẩm sau sấy là 10%. - Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột thạch anh. Cát và bột thạch anh được rửa sạch, sấy khô trước. - Trích ly: sau khi nghiền, dùng nước để trích ly. Cứ 1lít enzym thô, cho 4-5lít nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch. - Lọc: dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp tuyến. Nhóm 6 Trang 17
- Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện bằng ethanol phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym.Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ o để tránh hiện tượng biến tính. Nhiệt độ từ 3-10 C và dùng 2lít ethanol cho 1lít enzyme. - Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như: amylase, proteinase, cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel đ ể thu được enzyme amylase. Gel sử dụng là Sephadex G200. o - Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40 C để bảo đảm hoạt tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%. 4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp này: a. Ưu điểm Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. b. Nhược điểm: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích 4.6. Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme: a. Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng: Nhóm 6 Trang 18
Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat…) Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Bảng ảnh hưởng của nguồn Nito tới sinh tổng hợp các enzyme amylase Nguồn Liều lượng Hoạt động enzyme sau 6 ngày Nito muối, % theo N nuôi đối với 100ml α-amylase Glucomyla se NaNO3 0.3 145 8000 NaNO3 0.15 26 3300 (NH4)2SO2 0.15 - - NH4NO3 0.15 98 4100 Nhóm 6 Trang 19
NH4NO3 0.3 45 4900 NH4H2PO4 0.3 5.5 8000 b. Ảnh hưởng của amino acid: - Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa là nguồn năng lượng. - Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid...) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong quá trình chuyển amine hóa. - Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi. - Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả. c. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: 2+ - Mg có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO sẽ có ảnh 4 hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α- amylase là 0.05%. - Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối phospho thường được dùng với nồng độ Nhóm 6 Trang 20