Giáo trình -Chọn giống cây trồng - chương 12

Chia sẻ: Song Song Cuoc | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

473
lượt xem 70
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 12: Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng Chọn giống cây trồng là một quá trình sáng tạo liên tục để thỏa mãn nhu cầu thay đổi của con người. Cho tới một tương lai gần các phương pháp chọn giống thông thường vẫn là phương pháp phổ biến, trong đó tái tổ hợp giửa các kiểu gen

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình -Chọn giống cây trồng - chương 12

133 CHƯƠNG XII NG D NG CÔNG NGH SINH H C TRONG CH N T O GI NG CÂY TR NG M c tiêu h c t p c a chương 1. N m ñư c vai trò c a công ngh sinh h c là công c b sung cho ch n gi ng cây tr ng. 2. Hi u ñư c nguyên lý cơ b n v k thu t di truy n và cây chuy n gen 3. Gi i thích ñư c nguyên lý ch th phân t và ng d ng trong quá trình ch n gi ng 1. M ñ u Ch n gi ng là m t quá trình sáng t o liên t c ñ th a mãn nhu c u thay ñ i c a con ngư i. Cho t i m t tương lai g n các phương pháp ch n gi ng thông thư ng v n là nh ng phương pháp ph bi n, trong ñó tái t h p gi a các ki u gen ưu tú v n là khâu then ch t ñ t o ra v t li u ch n gi ng cho quá trình ch n l c. Các phương pháp ch n gi ng truy n th ng d a vào s tái t h p c a gen và nhi m s c th thông qua sinh s n h u tính theo nguyên lý di truy n Mendel. S phát tri n c a t bào h c, ña b i th , c m ng ñ t bi n, di truy n s lư ng, di truy n t bào ch t và các lĩnh v c có liên quan ñã h tr tích c c và nâng cao hi u qu c a các phương pháp truy n th ng. Trong nh ng năm g n ñây, công ngh sinh h c (CNSH), và ñ c bi t di truy n phân t và k thu t di truy n phát tri n vư t b c t o ñi u ki n cho vi c ng d ng các phương pháp m i trong ch n t o gi ng cây tr ng. Ngày nay CNSH ho c ñ c l p ho c k t h p v i các phương pháp truy n th ng làm tăng kh năng c i ti n cây tr ng v năng su t, kh năng thích ng và ch t lư ng s n ph m. CNSH bao g m m t lo t các phương pháp và quy trình s d ng cơ th s ng và các h th ng sinh h c ñư c bi n ñ i ñ t o ra s n ph m m i và tăng năng su t cây tr ng và v t nuôi. Trong tr ng tr t và nh t là trong c i lương gi ng cây tr ng, h u h t các quy trình CNSH s d ng nuôi c y mô và t bào in vitro t m nh mô, t bào phân l p, mô s o, t bào tr n ho c mô phôi ñ th c hi n quá trình bi n ñ i r i sau ñó tái sinh cây hoàn ch nh. T nh ng th p k 80, nh k thu t ADN tái t h p các nhà ch n gi ng ñã t o ra cây tr ng chuy n gen, vư t qua hàng rào c n tr trong lai h u tính cây tr ng. 2. Nuôi c y mô và t bào ð u thé k 20 Haberlandt ñã khám phá tính toàn v n c a t bào xô ma th c v t và ch ra kh năng t o ra cây hoàn ch nh b ng con ñư ng nuôi c y mô và t bào. Tuy nhiên ph i trên 50 năm sau vi c tái sinh cây hoàn ch nh t t bào ñơn ho c t bào tr n (protoplast) m i tr thành hi n th c. Nuôi c y mô và t bào là nuôi c y t bào th c v t phân l p hay m nh mô th c v t tách r i trên môi trư ng dinh dư ng trong ñi u ki n vô trùng. Sau ñó các mô nuôi c y ñư c tái sinh thành cây hoàn ch nh. Ngư i ta ñã xây d ng nh ng quy trình tương ñ i hoàn ch nh ñ tái sinh cây cho m t s loài m u như thu c lá, khoai tây, mía, hoa lan và m t s cây ăn qu và hoa khác nhau, nhi u loài trong chúng sinh s n vô tính d dàng. ð i v i ph n l n cây trông ñ ng ru ng, như cây c c, bông và ñ u l y h t vi c thi t l p các quy trình ñ áp d ng r ng rãi khó hơn nhi u. nh ng loài cây này t n s tái sinh th p và k t qu tái sinh t nuôi c y không ch thay ñ i theo loài mà còn v i ki u gen trong m t loài, ngu n mô c y, tu i và s c kh e c a cây cho mô c y, môi trư ng dinh dư ng và nhi u y u t khác. Nhìn chung, công ngh nuôi c y mô và t bào cho phép nhân nhanh nh ng ki u gen có giá tr Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….119
134 hay v t li u ch n gi ng trong m t môi trư ng có ki m soát. M t s kh năng ng d ng c a nhân nhanh ñ i v i cây tr ng là: - Nhân quy mô l n ki u gen d h p t - Nhân ki u gen t b t h p - Nhân b m b t d c trong chương trình t o gi ng lai - Nhân v t li u s ch b nh - B o qu n và trao ñ i ngu n gen qu c t Tuy nhiên, trong khuôn kh chương này chúng tôi ch th o lu n m t s k thu t nuôi c y in vitro liên quan tr c ti p t i quá trình ch n gi ng. 2.1. Nuôi c y phôi, nuôi c y noãn và th ph n in vitro Các nhà ch n gi ng ch y u ñã và ñang t n d ng bi n d di truy n hi n có trong trong ngu n gen tr ng tr t b ng cách s d ng nhi u sơ ñ lai và ch n l c khác nhau. Tuy nhiên v i thâm canh và ñ c canh m t ít ki u gen ch n l c v nh ng tính tr ng có ý nghiã kinh t bi n d di truy n ngày m t gi m trong ngu n gen tr ng tr t. Th m chí trong m t s trư ng h p bi n d ñ i v i m t s tính tr ng có ý nghĩa kinh t không còn tho ñáng hay thi u hoàn toàn, ví d tính kháng b nh vàng l i, sâu ñ c thân, ch u m n lúa, sâu h ng ñ c qu bông, và b nh kh m vàng ñ u xanh. ð kh c ph c nh ng y u t nh hư ng ñ n năng su t, nhà ch n gi ng c n ngu n di truy n hay ngu n gen ñ kháng t các loài hoang d i thân thu c hay không thân thu c. M t khó khăn l n khi s d ng các loài hoang d i ñ lai v i cây tr ng là tính b t h p khi lai. Trong m t s trư ng h p phôi lai t các t h p lai gi a các loài có quan h xa nhau thư ng y u và không có kh năng s ng do s cung c p dinh dư ng c a n i nhũ không ñ y ñ . Nh ng phôi như v y thư ng b ch t trong m t th i gian ng n sau khi hình thành h p t và không th phát tri n thành h t có kh năng s ng. Vì v y nuôi c y phôi hay c u phôi là m t phương pháp ñ kh c ph c hàng rào b t h p, b o ñ m ñ phôi non sinh trư ng, n y m m, và phát tri n thành cây con. Thông qua s d ng phương pháp này ngư i ta ñã t o ra nhi u con lai khác loài nhi u lo i cây tr ng như lúa mì, lúa nư c, ñ i m ch, bông, ñ u ñ , các loài cây ăn qu và cây c nh và nh v y nhi u gen có ích ñã ñư c chuy n vào cây tr ng. Noãn ñã th tinh ñôi khi ñư c nuôi c y ñ c u phôi t các t h p lai xa mà không c n tách phôi ra kh i noãn. Noãn ch a phôi lai non ñư c tách ngay sau khi th tinh trong ñi u ki n vô trùng r i nuôi c y trên môi trư ng dinh dư ng. B ng con ñư ng nuôi c y noãn phôi có th nuôi c y giai ño n s m hơn so v i nuôi c y phôi tách r i. Hơn n a, phôi phát tri n trong noãn có môi trư ng hoá h c và lý h c thu n l i hơn phôi nuôi c y bên ngoài noãn. Th ph n và th tinh in vitro g m vi c thu th p noãn chưa th tinh, c y noãn trên môi trư ng dinh dư ng trong ñi u ki n vô trùng, và th ph n cho noãn v i các h t ph n tươi. ng ph n xuyên qua thành noãn vào túi phôi s th tinh cho t bào tr ng. Phương pháp này ñã ñư c áp d ng ñ t o con lai gi a các loài mà ng ph n không th sinh trư ng và xuyên vào noãn bình thư ng sau khi th ph n. 2.2. Nuôi c y bao ph n và s n xu t cây ñơn b i Trong ph n l n các chương trình ch n gi ng vi c t o gi ng m i c i ti n bao g m vi c gieo tr ng qu n th F2 l n và ch n l c các dòng mong mu n trong các th h phân ly t F2 ñ n F7 ñ cu i cùng t o ra các dòng ñ ng h p t . Nuôi c y bao ph n hay h t ph n là Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….120
135 m t k thu t h hi u ñ t o ra các dòng ñ ng h p t ngay t th h ñ u tiên (dòng ñơn b i kép), do ñó ti t ki m ngu n l c và rút ng n th i gian c n thi t ñ t o ra gi ng m i. Nuôi v y bao ph n là nuôi c y in vitro các bao ph n ch a ti u bào t hay h t ph n chưa thành th c trên môi trư ng dinh dư ng ñ t o ra cây ñơn b i. S nhi m s c th c a cây ñơn b i ñư c nhân ñôi ñ t o ra cây lư ng b i ñ ng h p t hoàn toàn, g i là th ñơn b i kép. Nuôi c y bao ph n có ích ñ i v i nhà ch n gi ng vì th ñơn b i kép có th ñư c s d ng ngay làm các dòng thu n c cây t th ph n và cây giao ph n. Th i gian c n thi t ñ t o ra m t gi ng hay m t dòng t ph i b ng phương pháp ñơn b i kép ñư c rút ng n nhi u th h so v i phương pháp truy n th ng ñ ñ t ñ ñ ng h p t b ng t th ph n. Các dòng ñơn b i kép t o ra cơ h i duy nh t ñ c i ti n hi u qu ch n l c ñ i v i nhi u tính tr ng vì trong qu n th không có phương sai tr i, ñ ng th i gen l n cũng bi u hi n ra ki u hình. K thu t này ñã ñư c áp d ng thành công Trung Qu c trong vi c t o ra các gi ng lúa nư c và lúa mì. Tuy nhiên h n ch trong vi c áp d ng r ng rãi phương pháp này là kh năng nuôi c y khó và tính ñ c thù cao c a ki u gen. Ví d , các nhà ch n gi ng lúa Indica không th s d ng k thu t này có hi u qu b ng các nhà ch n gi ng lúa Japonica do các ki u gen Indica khó nuôi c y. Ngoài nh hư ng c a loài và ki u gen trong loài, kh năng t o ñơn b i b ng con ñư ng nuôi c y bao ph n/h t ph n còn b nh hư ng b i giai ño n phát tri n c a bao ph n, ñi u ki n sinh lý c a cây cho ph n, ñi u ki n x lý trư c khi nuôi c y, môi trư ng dinh dư ng, ñi u ki n nuôi c y và hi u qu lư ng b i hoá b ng colchicine. 2.3. Bi n d dòng xô ma và ch n l c dòng t bào Ban ñ u nuôi c y mô ñư c s d ng làm k thu t m i ñ t o sinh kh i và phương pháp nhân gi ng lý tư ng ñ s n xu t hàng lo t cây ñ ng nh t và như b m ban ñ u c a các gi ng ưu tú. Tuy nhiên, v i th i gian và các công trình nghiên c u nhi u loài cây tr ng có giá tr kinh t ngư i ta th y r ng t bào và mô ñư c nuôi c y trong môi trư ng nhân t o thư ng xu t hi n các bi n ñ i di truy n bao g m s thay ñ i v s lư ng và c u trúc nhi m s c th , s x p x p l i trong nhi m s c th , ñ t bi n gen, ho t hóa các gen di ñ ng, vv. Các bi n d này ñư c truy n cho cây khi tái sinh. T p h p các bi n d di truy n hình thành do quá trình nuôi c y ñư c g i là bi n d dòng xô ma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Bi n d dòng xô ma ch u nh hư ng b i loài cây, ki u gen trong loài và mô c y, ch ñ nuôi c y (th i gian c y chuy n, ñi u ki n lý h c c a môi trư ng, thành ph n môi trư ng...) th i gian nuôi c y in vitro, và tính n ñ nh c a genom. Như v y b n thân nuôi c y mô và t bào là m t ngu n bi n d di truy n quan tr ng, m i m và phong phú trong các ki u gen ñã thích ng r t có ích cho s c i lương gi ng cây tr ng. M t s th bi n d dòng xô ma có ích ñã ñư c phân l p, ñó là kh năng ñ kháng virut Fiji và b nh ñ m vàng vi n nâu và b nh sương mai mía (Heinz và c ng s , 1977); kh năng kháng b nh ñ m lá nh ngô (Bretell và Ingram, 1979); kh năng kháng sương mai khoai tây (Shepard và c ng s , 1980); và kh năng ch u h n và l nh lúa (Lê Tr n Bình và c ng s , 1996) . M t ưu ñi m quan tr ng c a bi n d di truy n trong quá trình nuôi c y là kh năng ch n l c dòng t bào in vitro. Có th nuôi cây và x lý hàng tri u t bào trong m t không gian h n ch , ch ng h n trong ñĩa pe tri và ch n l c b ng cách x lý t bào nuôi c y ñi u ki n b t l i g i là tác nhân ch n l c. Cũng có th k t h p x lý ñ t bi n trong nuôi c y ñ tăng t n s bi n d di truy n. Tuy nhiên, ch nh ng tính tr ng bi u hi n m c t bào m i có th xác ñ nh ñư c b ng cách sàng l c t bào nuôi c y, bao g m các ñ c tính như kháng thu c tr c , ch u m n hay ch u kim lo i như s t hay nhôm, a xit amin tương ñ ng, ch u Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….121
136 nhi t ñ th p, các y u t dinh dư ng và kh năng kháng ñ c t t o ra do các tác nhân gây b nh. Các ki u gen phân l p kháng v i các ñi u ki n b t l i này có th ñư c s d ng tr c ti p trong chương trình ch n gi ng. Tính tr ng s lư ng di truy n ph c t p như năng su t, kh năng ch ng ñ hay ch t lư ng ít thích h p v i ch n l c m c t bào. Ch n l c dòng t bào in vi tro bao g m các bư c sau: 1) Nuôi cây t bào t m t ki u gen ñã thích nghi nhưng có như c ñi m m t tính tr ng nh t ñ nh và c n ñư c c i ti n, 2) X lý t bào nuôi c y b ng tác nhân ch n l c thích h p nh m c ch sinh trư ng c a m i t bào, tr t bào có kh năng ñ kháng, 3) Tái sinh cây t các t bào s ng sót. Các t bào có th ti p xúc v i tác nhân ch n l c thông qua nuôi c y các n ng ñ hay m c khác nhau c a tác nhân ch n l c. Có th x lý t bào trong nuôi c y huy n phù ñ ng nh t hơn nhi u so v i t bào trong nuôi c y callus. T bào s ng sót ñư c chuy n sang môi trư ng tái sinh ñ ch i và r phát tri n. Các ñ c tính bi u hi n trong nuôi c y t bào ph i bi u hi n cây tái sinh. cây sinh s n b ng h t ñ c tính ph i bi u hi n không ñ i các th h sinh s n h u tính c a cây tái sinh. Ch n l c các dòng ch ng ch u trên ñ ng ru ng r t c n thi t ñ th m tra tính di truy n kh năng ch ng ch u ñã ch n m c t bào. 3. Dung h p t bào tr n Trong các phương pháp ch n t o gi ng truy n th ng lai h u tính là phương pháp cơ b n nh t ñ t o ra bi n d t h p thông qua dung h p giao t . Tuy nhiên lai h u tính ch th c hi n ñư c gi a các cá th trong m t loài hay các loài có quan h thân thu c. Lai gi a các loài có quan h xa nhau thư ng r t khó khăn và hàng rào c n tr vi c lai xa làm gi m tính h u d ng c a k thu t lai trong vi c tăng ngu n bi n d di truy n c n thi t cho vi c c i lương cây tr ng. Vì v y m t phương pháp m i ñư c ñ xu t t năm 1973(Keller và Melchers, 1973) ñ kh c ph c hàng rào lai h u tính gi a các loài có quan h h hàng xa nhau là phương pháp dung h p t bào xô ma hay dung h p t bào tr n. Dung h p t bào tr n là s h p nh t c a các t bào xô ma không có thành t bào c a các cá th ho c các loài khác nhau và sau ñó tái sinh cây lai t các t bào ñã dung h p. Trong lai h u tính, các tính tr ng do ADN c a cơ quan t ki m soát hoàn toàn gi ng cây m vì không có s t h p các cơ quan t c a b và m . Trong dung h p t bào tr n , ngoài kh năng dung h p nhân, còn có kh năng x y ra h n h p t bào ch t, hình thành t h p di truy n hoàn toàn m i. Ti th và l p th c a hai t bào khác nhau có th h p nh t ho c/và tái t h p t o ra m t t bào d t bào ch t, g i là cybrid. Như v y, b ng con ñư ng lai xôma ngư i ta có th thu ñư c t h p m i c a l p th hay/và ti th và tương tác m i gi a nhân và t bào ch t. Dung h p t bào tr n là m t quá trình nhi u giai ño n, bao g m vi c phân l p t bào tr n t các loài khác nhau, dung h p t bào tr n c a hai loài khác nhau, giám ñ nh và nhân s n ph m dung h p và cu i cùng là tái sinh cây lai h u d c t s n ph m dung h p. Trư c khi t bào xôma dung h p ph i lo i b thành t bào ñ t o ra t bào tr n. T bào th t lá, r , thân m m và các lo i mô khác ho c t bào trong nuôi c y huy n phù ñư c x lý v i các enzym phân gi i thành t bào ñ thu nh n t bào tr n. Y u t h n ch cơ b n trong vi c ng d ng r ng rài lai xôma là khó tái sinh cây t protoplast và không có kh năng s d ng m t cách có ch n l c các ph n nh genom c a m t loài ñ k t h p v i loài kia (Vasil, 1990). Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….122
137 Lai xôma ñư c s d ng có hi u qu ñ k t h p kh năng kháng các b nh virut khoai tây t các ki u gen trong m t loài cũng như t các loài khác nhau (Wenzel, 1994). Lai xôma là m t phương ti n có hi u qu ñ chuy n b t d c ñ c t bào ch t và ña d ng hoá ngu n b t d c trong vi c t o gi ng lai. 3.1. Dung h p t bào và s phát tri n c a s n ph m dung h p T bào th c v t tích ñi n âm và ñ y nhau c n tr quá trình dung h p t phát. Vì th bư c ñ u tiên ñ k t dính t bào là làm cho chúng ti p xúc v i nhau, qua ñó t o ra c u n i t bào ch t gi a hai t bào tr n. L n ñ u tiên vào năm 1973 Keller và Melchers ñã ñ xu t phương pháp dung h p nh ch t hoá h c. Ngày nay ph n l n ngư i ta s d ng tác nhân dung h p là h n h p polyethylene glycol, nitrat canxi và dimethylfoxid. M t phương pháp khác r t có hi u qu , nh t là ñ i v i cây h cà, là dung h p b ng ñi n. Trư c tiên t bào tr n ñư c ti p xúc v i nhau thông qua trư ng ñi n xoay chi u không ñ ng nh t gi a hai ñi n c c. Sau ñó quá trình dung h p s di n ra thông qua xung ñi n c a dòng ñi n m t chi u có ñi n th cao (500-2000 V/cm) trong kho ng th i gian c c ng n (1 - 50 µs - micro giây). Trong s n ph m dung h p, s dung h p nhân thư ng không di n ra ngay mà di n ra trong vài ngày. Hai nhân cũng có th h p nh t vào th i ñi m c a l n phân bào nguyên nhi m ñ u tiên. Nhi m s c th c a hai nhân cùng m t lúc t o ra ñĩa trung kỳ và dung h p nhân x y ra vào kỳ cu i. Cũng có th m t nhân phân chia nguyên nhi m còn nhân th hai b m t ñi t o nên cây có ki u nhân gi ng v i m t trong hai b m . Trong quá trình phân bào sau khi dung h p, các cơ quan t trong t bào d nhân có th phân ly, ñào th i hay tái t h p t o thành các d ng con lai khác nhau (Hình 8 - 1). N u m c ñích ch k t h p nhân c a m t loài v i toàn b t bào ch t c a loài kia, ngư i ta x lý loài cho t bào ch t b ng tia X ho c tia gamma và x lý loài kia v i hoá ch t như iodoacetate ho c iodoacetamide ñ lo i tr các cơ quan t trư c khi dung h p. Phương pháp này g i là phương pháp “th cho — th nh n” (Galun và Aviv, 1986). 3.2. Ch n l c s n ph m dung h p Khi h n t bào tr n c a hai loài b m trong môi trư ng dung h p s thu ñư c 5 lo i t bào tr n khác nhau: Nh ng t bào không dung h p có ki u nhân gi ng b và m ; s n ph m dung h p hình thành do dung h p t bào tr n c a b ho c m (s n ph m dung h p ñ ng nhân); s n ph m lai t bào xô ma hình thành do dung h p c a t bào tr n b và m (s n ph m dung h p d nhân). T l s n ph m dung h p hay con lai t bào xô ma thư ng th p ph thu c vào loài cây b m , tính tương h p c a chúng và phương pháp dung h p. M t khó khăn trong vi c phân l p con lai t bào xô ma là phương ti n ñ giám ñ nh con lai (s n ph m dung h p) và tách chúng ra kh i h n h p các t bào tr n. V cơ b n có 3 phương pháp ñư c s d ng ñ tách s n ph m dung h p. Phương pháp th nh t d a vào kh năng nh n bi t t bào lai ngay sau khi dung h p. T bào tr n c a m t b m không có chlorophyll (di p l c) dung h p v i t bào tr n ch a chlorophyl c a b m kia. S n ph m dung h p (m t n a có màu xanh) có th phân bi t và ch n l c nh kính hi n vi. Cũng có th ch th t bào tr n b ng ch t màu huỳnh quang r i cho dung h p và ch n t bào lai b ng máy phân lo i t bào (Galbrath, 1984). Phương pháp th hai d a vào kh năng kháng kép c a con lai xôma v i các ch t ñ c như ch t kháng sinh (hygromycin, kanamycin) ho c amino a xit tương ñ ng. B và m (hai loài ch ng h n) ch có kh năng kháng m t ñ c t hay m t axit amin tương ñ ng. Sau Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….123
138 khi dung h p t bào tr n c a b và m có th ch n l c các t bào lai d dàng vì chúng kháng ñư c c hai. Phương pháp th ba là ch n l c con lai xôma b ng cách so sánh s bi u hi n ki u hình c a tính tr ng trên cây hoàn ch nh v i các cây b m . Tuy nhiên phương pháp này ch áp d ng khi t l dung h p cao. Có th thu ñư c t l con lai xôma cao b ng cách áp d ng phương pháp dung hp nh ñi n. B ng cách này Schilde-Rentschler và Ninnemann (1988) ñã thu ñư c nhi u con lai xôma khoai tây. 4. K thu t di truy n K thu t di truy n th c v t nh m chuy n m t ño n ADN l , thư ng là m t gen có ch c năng mã hoá cho m t thông tin hay ñ c ñi m có l i nh t ñ nh vào t bào th c v t như kh năng kháng sâu h i, kháng virut hay kháng thu c tr c . Cây tái sinh t t bào chuy n n p có gen l ñư c l ng vào genom, bi u hi n ra ki u hình và di truy n n ñ nh ñư c g i là cây chuy n gen (transgenic plants hay genetically engineered plants). Gen l có th có ngu n g c vi sinh v t, th c v t, ñ ng v t, th m chí gen t ng h p. Quá trình chuy n gen bao g m nhi u bư c: Xác ñ nh và phân l p gen có ích, nhân gen, chuy n gen vào t bào th c v t, tái sinh t bào chuy n n p thành cây hoàn ch nh và ñánh giá s bi u hi n c a gen. Trong các bư c trên, k thu t chuy n gen ñóng m t vai trò quy t ñ nh ñ i v i k t qu chuy n gen. Chuy n gen vào t bào th c v t có th th c hi n gián ti p thông qua vectơ hay tr c ti p (B ng 1.12). B ng 1.12: Các phương pháp chuy n gen PHƯƠNG PHÁP V T LI U CƠ CH NH N XÉT 1. 1. Phương pháp gián ti p Chuy n gen nh Protoplast, Chuy n gen n m H th ng hoàn h o và có hi u meristem, trong T-ADN c a qu cao ñ i v i cây hai lá m m Agrobacterium mô lá Ti-plasmid tumefaciens 2. Phương pháp tr c ti p Thông qua PEG Protoplast L nh màng t Ch s d ng ñư c v i t bào bào tr n có kh năng tái sinh Chích ñi n Protoplast L nh màng t Ch s d ng ñư c v i tê bào (Electroporation) bào tr n có kh năng tái sinh B n h t (Microprojectile/ T bào, phôi xô H t vàng hay S d ng cho nhi u lo i cây bombardment/ biolistics) ma và h p t , lá wolfram b c tr ng và mô, d dàng và kinh m m, mô ADN t Vi chích (Microinjection) Protoplast Chích ADN b ng Kh năng s d ng có h n vì xy lanh m i l n ch chích ñư c 1 t bào, ñòi h i k năng cao Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….124
139 4.1. Chuy n n p thông qua Ti-plasmid c a vi khu n Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens là vi khu n gây kh i u cây hai lá m m và ph n ng hình thành kh i u là k t qu c a c a s ki n chuy n gen t nhiên. M u ch t c a s hình thành kh i u là Ti-plasmid (Ti= tumor inducing) c a vi khu n ch a các gen mã hoá sinh t ng h p các hooc môn (auxin và xitokinin) ch u trách nhi m cho s hình thành kh i u. Các gen này n m trong vùng T-ADN (transferred DNA) c a plasmid. Khi plasmid xâm nh p vào t bào c a cây, vùng T-ADN ñư c chuy n vào genom. ðo n T-ADN là ph n t di ñ ng trong quá trình chuy n gen. Ý nghĩa c a Agrobacterium trong k ngh di truy n là kh năng chuy n ño n ADN vào t bào th c v t. L i d ng phương th c chuy n n p gen t nhiên các nhà khoa h c th c v t d a vào k thu t phân t ñi u khi n T-ADN ñ thi t k h vec tơ b ng cách l ng ño n ADN c n chuy n g n vào vùng T-ADN c a vi khu n, sau ñó cho cây nhi m các vi khu n ch a plasmid ñã bi n ñ i. ð lây nhi m ngư i ta nuôi c y t bào tr n th c v t, t bào ñơn trong môi trư ng l ng, ho c ñ t mô c y trong dung d ch huy n phù ch a vi khu n có plasmid bi n ñ i trong m t th i gian nh t ñ nh. Qúa trình chuy n n p thông qua Agrobacterium g m các bư c sau ñây: - Phân l p gen có ích t th cho (ADN l ) và nhân - Lo i b T-ADN kh i Ti-Plasmid c a các dòng vi khu n ñã ch n l c - Chuy n ADN l vào Ti-Plasmid cùng v i gen kh i ñ ng và m t gen ch th có kh năng ch n l c d dàng (ví d gen uidA c a vi khu n mã hoá β- glucuronidaza thư ng g i là gen GUS, hay gen kháng kháng sinh) - ðưa plasmid ñã bi n ñ i tr l i Agrobacterium ñ nhân - Chuy n plasmid ñã bi n ñ i vào t bào th c v t - Ch n t bào ñư c chuy n n p gen - Tái sinh t bào chuy n n p - Ch n cây bi u hi n gen chuy n n p (cây chuy n gen) m t s loài cây d nuôi c y, như khoai tây và cà chua ch ng h n, các m u lá c t r i ñư c nhúng vào dung d ch ch a vi khu n trong m t th i gian ng n. Sau ñó các m u lá ñư c ñưa vào môi trư ng dinh dư ng. Trong kho ng th i gian ñó vi khu n ti p t c sinh trư ng và xâm nh p các t bào lá r i t o ra m t s t bào chuy n gen. Vì ch m t ph n nh t bào ñư c chuy n n p nên c n ph i ti n hành ch n l c. Vi c ch n l c thông thư ng d a vào gen có kh năng ch n l c, ñó là gen kháng kháng sinh hay kháng thu c tr c . Sau ñó các m u lá ñư c chuy n vào môi trư ng khác ch a m t ch t kháng sinh ñ di t Agrobacterium còn sót l i và m t ch t kháng sinh khác hay thu c tr c ñ lo i tr các t bào không chuy n gen. Các t bào ñư c ch n ñư c chuy n sang m t lo t các các môi trư ng dinh dư ng ñ tái sinh cây. K t q a tái sinh và t o cây chuy n gen ph thu c vào loài cây. Phương pháp chuy n gen thông qua Agrobacterium ñư c áp d ng r t thành công nhi u loài cây hai lá m m như thu c lá, khoai tây và cà chua. 4.2. Chuy n n p tr c ti p H vec tơ thông qua vi khu n Agrobacterium ch có hi u qu cao m t s loài cây hai lá m m. Các cây tr ng kinh t chính, ñ c bi t các lo i cây c c và nhi u lo i ñ u ñ ít ho c không phù h p v i chuy n n p thông qua Agrobacterium. Nhi u c g ng ñã ñư c ti n hành ñ phát tri n k thu t chuy n gen tr c ti p vào t bào không thông qua kí ch trung gian. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….125
140 Chuy n gen thông qua Polyethylene glycol (PEG): Ban ñ u PEG ñư c s d ng trong dung h p t bào r i sau ñó ñư c phát tri n thành k thu t ñơn gi n ñ chuy n n p di truy n. PEG 6000 n ng ñ 15-20% gi m thi u tác ñ ng ñ y nhau gi a ADN và màng t bào và b o v ADN kh i ho t tính phân gi i c a nucleaza. PEG kích thích s h p th c a t bào ñ i v i các ph n t nh tách r i như l c l p, liposom hay vi khu n. Do ñó PEG làm k t t a ADN c a plasmid lên màng t bào t o ñi u ki n ñ ADN xâm nh p vào t bào. Chích ñi n (electroinjection hay electroporation): Chích ñi n là áp d ng xung ñi n có hi u ñi n th cao lên t bào tr n ñ t o ra khe h nh t th i màng t bào làm cho các ñ i bào t như ADN có th xâm nh p vào t bào. Th i gian và cư ng ñ xung ñi n ñư c ñi u ch nh sao cho t bào s ng sót và h p th ADN m t cách to ñáng. Phương pháp này d l p l i hơn so v i phương pháp PEG và ñư c s d ng ñ t o ra các t bào và cây chuy n gen các loài, ch ng h n lúa. Phương pháp b n h t (microprojectile bombardment): H t vàng hay won-fram, ñư ng kính 1-4 µm b c ADN, ñư c k t t a v i CaCl2, spermidine ho c PEG. H t b c ADN ñư c tăng t c (300-600 m/s) b ng m t thi t b ñ c bi t g i là máy b n h t. V i t c ñ này h t xâm nh p qua thành và màng t bào. M t ñ h t s d ng ph i ñư c ñi u ch nh sao cho không làm t n thương t bào. Nh ng cây tr ng ñã áp d ng thành công phương pháp b n gen là ñ u tương, bông, ñu ñ , ngô, lúa nư c, lúa mì, mía, cao lương, vv. Phương pháp này cũng ñư c s d ng ñ chuy n gen vào l p th và ti th . Phương pháp vi chích: Dùng micropipet hay xylanh nh ñ ñưa tr c ti p ADN vào t bào tr n. 4.3. Các tính tr ng ch y u ñư c c i ti n b ng con ñư ng chuy n gen a. T o gi ng kháng sâu hai Gen t o ra ñ c t có tác d ng di t sâu, ví d gen n i ñ c t Bt t vi khu n Bacillus thuringiensis, Gen t o ra ch t c ch men phân gi i protein làm h n ch kh năng tiêu hoá th c ăn c a sâu h i (ch t c ch trip-sin). Phòng tr sâu h i b ng hoá h c không nh ng t n kém mà còn gây h u qu x u t i môi trư ng. Do ñó t o ra các gi ng kháng sâu h i thông qua k ngh di truy n d a vào gen ñ c t Bt c a vi khu n Bacillus thuringiensis là m t ti n b quan tr ng trong ch n gi ng kháng sâu. ð c t Bt là nh ng tinh th t o ra trong quá trình t o bào t c a vi khu n. Nh ng protein tinh th này có ho t tính kháng m t s lo i côn trùng nhưng không ñ c v i ngư i. Khi sâu h p th tinh th protein, ñ pH cao trong ru t gi a phân các gi i tinh th và gi i phóng protein. Vào giai ño n này protein chưa có ho t tính ñ c, nhưng các men proteaza ñ c bi t trong d ch ru t phân hu protein ch còn l i b lõi kháng men proteaza, b lõi này hoàn toàn có ho t tính. B lõi này liên k t v i ch t nh n ñ c thù t bào bi u mô n m d c theo ru t gi a và t l ng vào màng nguyên sinh c a t bào. Tích t các protein làm cho t bào b rò r ch t dinh dư ng và ch t. Côn trùng ng ng ăn và ch t ñói trong vòng 24 ti ng ñ ng h . ð c t Bt có ho t tính v i nhi u loài sâu h i, ñ c bi t sâu thu c b cánh v y Lepidoptera. Bt gen ñã ñư c chuy n vào cây ñ phòng tr sâu h i như phòng tr Manduca sexta h i thu c lá, sâ xanh h i cà chua và sâu xanh ñ c qu bông Helicoverpa zea, v.v.. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….126
141 M t s cây tr ng chuy n gen Bt ñư c tr ng trên quy mô thương m i là cà chua, bông, ngô, khoai tây (James và Krattiger, 1996; James, 1997). M t protein n a có kh năng di t sâu là ch t c ch proteinaza tách chi t t m t cây nhi t ñ i, cây khoai môn kh ng l . Cây này t o ra m t lư ng ch t c ch cao trong c . Ch t c ch tinh khi t có tác d ng làm gi m kh năng sinh trư ng c a sâu non Heliothis armigera, do làm m t ho t tính c a men proteaza tiêu hoá nên chúng b ch t ñói. Tương t , gen mã hoá ch t c ch tripsin c a ñ u bò cũng ñư c chuy n vào thu c lá ñ phòng tr sâu h i lá. b. T o gi ng kháng virut C n tr s truy n virut, C n tr s nhân lên c a virut trong t bào Ch ng l i s bi u hi n c a b nh (tri u ch ng) K ngh di truy n là m t k thu t có hi u qu ñ t o ra gi ng cây tr ng kháng virut. Các gen s d ng ñ chuy n vào cây ñ u ñư c phân l p t virut. Phương pháp ph bi n nh t là chuy n gen mã hoá v protein c a virut vào cây - m t cơ ch ñư c g i là b o v chéo. T bào th c v t bi u hi n gen mã hoá v protein c n tr quá trình nhân c a virut. B ng phương pháp này ngư i ta ñã t o gi ng kháng ñư c 36 lo i virut ñ i di n cho 16 nhóm khác nhau (Larkin, 1995), trong ñó có nh ng b nh có ý nghĩa kinh t như kh m hoa lá c medi, hoa lá dưa chu t, virut xoăn lá khoai tây, virut ñ m vòng ñu ñ , v.v. Chi n lư c t o gi ng kháng virut th hai s d ng gen mã hoá replicaza c a virut. Enzym replicaza là m t enzym giúp cho virut t ng h p axit nucleic trong t bào th c v t. Cây ñư c chuy n gen ch a m t ñ u nh t ñ nh c a gen replicaza s t ng h p m t phân t ARN nh ch a m t ñi m nh n bi t ñ liên k t v i replicaza . Do ñó phân t ARN này c nh tranh v i ARN c a virut trong quá trình liên k t v i enzym replicaza. N u t bào th c v t sao mã ñ lo i ARN này thì có kh năng c ch quá trình nhân c a virut. Kh năng th ba là s d ng các gen có trình t ngư c chi u (anti-sense) v i các gen nh t ñ nh c a virut. Gen có trình t ngư c sao mã mARN có trình t b sung v i ARN c a virut. A RN ngư c chi u can thi p tr c ti p vào s bi u hi n gen c a virut b ng cách k t h p v i ARN c a virut t o thành phân t kép, ngăn c n quá trình d ch mã hay s v n chuy n ARN t nhân ra t bào ch t. Nh ng cây tr ng chuy n gen kháng virut tr ng trên di n tích l n g m thu c lá, cà chua, bí ñ và ñu ñ (James và Krattiger, 1996; James, 1997 ). c. T o gi ng kháng thu c tr c S n xu t dư th a lo i protein (enzym) m n c m v i thu c tr c , b o ñ m ñ lư ng c n thi t cho các ch c năng c a t bào khi có m t c a thu c, Gi m kh năng liên k t c a protein m n c m v i thu c b ng cách thay ñ i c u trúc c a protein, Trang b cho cây kh năng làm m t ho t tính chuy n hoá c a thu c tr c . S n xu t dư th a protein (enzym) m n c m v i thu c tr c ñã ñư c áp d ng thành công ñ i v i nhi u loài cây tr ng ñ tăng tính kháng thu c tr c , ví d Phosphinothricin (thương ph m là Basta) và bialaphos. Phosphinothricin c ch enzym t ng h p glutamin (glutamin synthaza - GS). c ch GS gây ra s tích lu amonia nhanh chóng trong cây làm cho cây ch t. Tăng s t ng h p GS trong cây lên nhi u l n có th kh c ph c ñư c nh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….127
142 hư ng c a thu c tr c . De Block (1987) ñ xu t m t chi n lư c liên quan t i m t enzym có kh năng kh ñ c c a thuôc tr c Basta. Gen Bar phân l p t Steptomyces hygroscopicus tham gia vào quá trình sinh t ng h p bialaphos và mã hoá enzym phosphinothricin exetyltranferaza (PAT). enym này axetyl hoá nhóm NH2 t do c a phosphinotricin và làm cho cây không b ng ñ c. ð t bi n c a gen protein m c tiêu làm m t kh năng liên k t c a thuôc tr c cũng tăng kh năng káng hay ch u thu c tr c , ch ng h n như thu c tr c glyphosate, atrazine và sulphonylurea. M t s cây tr ng ñư c chuy n gen kháng thu c tr c và tr ng trên quy mô thương m i là ñ u tương, ngô, bông, c i d u, thuôc lá (James và Krattiger, 1996; James, 1997). d. Tăng ch t lư ng s n ph m Cây th c ph m chuy n gen ñư c ñưa vào s n xu t năm 1994 M là gi ng cà chua “Flavr Savr”. các gi ng cà chua thông thư ng, m t s enzym ñư c t o ra trong quá trình chín, trong ñó có poly-galacturonaza, phân gi i thành t bào làm m m qu cà chua. Nh ng gi ng cà chua như v y ph i thu ho ch khi qu chưa chín ñ v n chuy n và x lý ñ qu chín trư c khi tiêu th . ð làm ch m quá trình chín c a qu , ngư i ta ñã phân l p gen mã hoá enzym poly- galacturonaza và chuy n vào b gen c a cà chua. Tuy nhiên gen chuy n vào ngư c chi u v i gen bình thư ng (anti-sense), do ñó làm m t ch c năng c a gen bình thư ng trong vi c t ng h p poly-galacturonaza. Gi ng cà chua như v y ñã ñư c s n xu t thương m i M (gi ng Flavr Savr) (James và Krattiger, 1996). 5 Ch n l c d a vào ch th (Marker-assisted selection) Giám ñ nh chính xác các gi ng, dòng và ngu n v t li u kh i ñ u cho ch n gi ng c c kỳ quan tr ng ñ i v i vi c ch n l c b m ñ t o ra ngu n bi n d di truy n. Ví d , quan h h hàng là m t y u t xác ñ nh vi c ch n b m c cây t th ph n l n cây giao ph n. T o gi ng dòng thu n thư ng d a vào vi c s d ng các dòng có quan h thân thu c, trong khi ñó con lai t t nh t ñư c t o thành t t h p c a các b m t ph i có quan h xa nhau. Có th xác ñ nh m c ñ thân thu c b ng cách ki m tra gia ph , năng su t c a con lai và nh ng ñ c ñi m hình thái. Các phương pháp xác ñ nh này thư ng không chính xác. ð tăng ñ chính xác trong giám ñ nh ngu n gen, nh ng năm g n ñây các nhà ch n gi ng ñã áp d ng phương pháp ñi n di isozym và tính ña hình v ñ dài c a phân ño n h n ch (restriction fragment length polymorphism, vi t t t là RFLP), AFLP và các k thu t phân tích genom khác. ði n di enzym d a vào vi c ñ nh lư ng m t lo t các enzym ch a trong các mô ñ c thù, ch ng h n trong cây ñang n y m m. Trong m i enzym có th xác ñ nh ñư c các alen khác nhau (allozym hay isozym) nh tính di ñ ng khác nhau trên màng polyacrylamide gel trong m t ñi n trư ng. Tính di ñ ng c a enzym ph thu c tr ng lư ng phân t , ñi n tích và c u trúc ba chi u. RFLP là nh ng phân ño n ADN t o ra khi ADN ñư c phân gi i b i các enzym phân gi i ADN g i là enzym c t hay enzym h n ch ( restriction enzymes hay restriction endonuleases). Enzym h n ch c t ADN nh ng ñi m ñ c thù tuỳ theo trình t bazơ. Ví d enzym BAM HI c t b t kỳ ñi m nào c a ADN có trình t guanin-guanin-adenin- thymidin-xytosin - xytosin (GGATCC). Các phân ño n c t có ñ dài khác nhau và tr ng lư ng phân t khác nhau ñư c tách ra trên môi trư ng ñi n di. Các ki u gen khác nhau t o Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….128
143 ra m t b RFLP khác nhau khi ñư c c t b i cùng m t enzym và ñây là cơ s ñ phân bi t các cá th khác nhau. Cu i cùng s khác nhau này có th nh n bi t b ng cách chuy n các phân ño n ADN sang màng m ng và ti p xúc v i ño n m u ADN ch th v i P32 (probe) thông qua k thu t g i là Southern blot. ðo n m u ADN là m t ño n ADN m ch ñơn có trình t bi t trư c dùng cho m c ñích giám ñ nh. Kh năng ng d ng l n nh t c a isoym và RFLP l p b n ñ di truy n và h tr cho ch n l c các ki u gen mong mu n v i s h tr c a ch th di truy n. Trư c ñây ch th hình thái ñư c s d ng ñ xây d ng b n ñ di truy n. Ch th hình thái không th áp d ng có hi u qu trong các chương trình ch n gi ng do không có cơ s nông h c, s lư ng ít, có tính l n và các hi u ng ña hi u khác. S ra ñ i c a ch th isozym (protein) vào gi a nh ng năm 1970 và ch th ADN t nh ng năm 1980 cho phép ngư i ta ñ nh v gen v i m t ñ cao hơn và ng d ng hi u qu hơn. Vi c ch n l c m t tính tr ng m c tiêu d a vào vi c phân tích gián ti p s có m t hay v ng m t c a m t ño n nhi m s c th (hay ño n ADN) mang gen hay alen mong mu n trên gel hay phóng x ñ g i là ch n l c thông qua ch th di truy n. Ch th isozym có nhi u ưu ñi m so v i ch th hình thái. K thu t ñơn gi n, c n m t lư ng v t li u nh , và có th phân tích nhi u m u giai ño n cây non. Vì th ch nh ng ki u gen mong mu n ñư c gi l i còn nh ng ki u gen khác ñư c ñào th i. B n ch t tr i song song c a isozym cho phép xác ñ nh m i ki u gen. Kh năng ng d ng liên k t c a ch th isozym ñã ñư c minh ho cà chua. Gen kháng tuy n trùng M1 liên k t ch t v i gen Aps-1 (Acid phosphatase-1). Trong nhi u chương trình ch n tao gi ng cà chua ngư i ta sàng l c qu n th phân ly ñ i v i s có m t c a alen Aps-1 (Acid phosphatase) thay cho vi c ñánh giá kh năng kháng tuy n trùng. lúa, gen m n c m quang chu kỳ liên k t ch t và n m gi a gen Est-2 (Esterase) và gen Pg1-2 trên nhi m s c th s 6. Nhi u tính tr ng nông h c liên k t ch t v i isozym ñã ñư c phát hi n cà chua như gen Prx-2 (Peroxidase) v i ms-10, gen Got-2 (Glutamate oxaloacetate transaminase) v i I-3 c a n m Fusarium oxysporum. Tuy nhiên, h n ch c a ch th isozym là không ñ ñ bao trùm toàn b b n ñ nhi m s c th . ð ñ nh v gen b ng m t ch th c n ph i có liên k t r t ch t (dư i 5 cM). T nh ng năm 1980 các nhà nghiên c u ñã xây d ng b n ñ di truy n d a vào RFLP, AFLP ho c ña hình khu ch ñ i ng u nhiên (random amplified polymorphic DNA (RAPD) nh k thu t ph n ng dây chuy n c a polymeraza (Polymerase chain reaction, vi t t t là PCR) . Khác v i isozym, ch th ADN có s lư ng r t l n cho phép xây d ng b n ñ bão hoà c a toàn b genom. Tương t như ch th isozym, ch th ADN tr i song song, không b nh hư ng c a môi trư ng và phân ly theo quy lu t Mendel. Các tính tr ng c n c i ti n có th tương quan v i m t RFLP trong b n ñò liên k t. ð c bi t có ích là v t li u ch th ADN cho phép xây dư ng b n ñ và ñ nh v các locut ki m soát các tính tr ng s lư ng. Hi n nay b n ñ RFLP ñã ñư c thi t l p cho m t s cây tr ng chính như lúa, ngô, cà chua, khoai tây, ñ u xanh... Các b n ñ này có th dùng ñ ñ nh v các gen ki m soát các tính tr ng nông h c khác nhau, g m c các locut ki m soát tính tr ng s lư ng. Ví d cà chua RFLP ñã ñư c s d ng ñ ñ nh v gen kháng virut kh m thu c lá, 6 locut ki m soát kh i lư ng qu , 4 locut ki m soát hàm lư ng ch t r n hoà tan, 5 lo cut ki m soát ñ pH c a qu . ð nh v gen b ng RFLP giúp các nhà ch n gi ng gám ñ nh và mô t ñ c ñi m c a gi ng và ch n l c các tính tr ng ph c t p khó th c hi n ñư c b ng các phương pháp truy n th ng. Hơn n a k thu t PCR giúp nhà ch n gi ng xác ñ nh s có m t c a gen có ích r t có hi u qu , ñ c bi t các gen kháng b nh - nh ng gen mà trư c ñây ch kh ng ñ nh ñư c khi có m t c a ký sinh. M t s ưu ñi m c a ch n l c d a vào ch th phân t là: Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….129
144 Kh năng ch n l c s m t giai ño n cây con ñ i v i nh ng tính tr ng bi u hi n mu n trong ñ i s ng c a cây, do ñó rút ng n th i gian ph i gieo tr ng và ñánh giá (ch t lư ng qu và h t, tính m n c m quang chu kỳ), Kh năng giám ñ nh và sàng l c các tính tr ng khó ch n l c, t n kém, ho c t n th i gian ñ ñánh giá (kh năng kháng b nh, kh năng ch ng ch u ñi u ki n b t thu n), Kh năng phân bi t ñi u ki n ñ ng h p t và d h p t nhi u locut trong m t th h mà không c n ph i ñánh giá th h con, Kh năng ch n l c ñ ng th i nhi u tính tr ng, Kh năng ch n l c chính xác ñ ph c h i nhanh ki u gen c a b m và gi m nh ng liên k t b t l i v i gen m c tiêu trong quá trình lai l i và chuy n gen có ích vào cây tr ng trong lai xa. D ñoán các t h p cho con lai có năng su t cao TÀI LI U THAM KH O 1. Agrawal, R. L. 1998. Fundamentals of plant breeding and hybrid seed production 2. Shepard, J., F. D. Bidney and E. Shahin. 1980. Potato protoplast in crop improvement. Science, 28: 17-24. 1. Công ngh sinh h c và m t s ng d ng Vi t Nam. T p II. 1994. Nhà xu t b n Nông nghi p . 2. Cell and tissue culture techniques for cereal crop improvement. Science Press, Beijing and IRRI 1983. 3. Biotechnology for Asian Agriculture. 1991. Asian and Pacific Development Center . 4. David R. Murray. 1991. Advanced methods in plant breeding and biotechnology. CAB International . 5. Vũ ðình Hoà. 1997. Công ngh sinh h c trong nông nghi p - Nh ng ti m năng và t n t i. T p chí Ho t ñ ng khoa h c. Câu h i ôn t p 1. Th nào là công ngh sinh h c? 2. Nh ng ng d ng c a nuôi c y mô và t bào là gì? Cho ví d . 3. Th nào là bi n d dòng xô ma? T i sao nói bi n d dòng xô ma là phương pháp ch n l c m c t bào? 4. Th nào là ADN tái t h p (hay k thu t di truy n)? 5. Li t kê các phương pháp chuy n gen, so sánh ưu như c ñi m c a các phương pháp ñó. 6. Li t kê các bư c trong quá trình chuy n gen s d ng vi khu n Agrobacterium. 7. Th nào là ch th di truy n? Tiêu chu n m t ch th t t. 8. Uư ñi m c a ch n l c d a vào ch th . Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình Ch n gi ng cây tr ng………….…..…………….130