Kết quả nghiên cứu các týp gen cagA và vacA của helicobacter pylori trong ung thư dạ dày

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TÝP GEN cagA VÀ vacA<br /> CỦA HELICOBACTER PYLORI TRONG UNG THƯ DẠ<br /> DÀY<br /> Trần Thiện Trung*, Lê Châu Hoàng Quốc Chương* Trần Anh Minh*, Lý Kim<br /> Hương*, Hồ Huỳnh Thùy Dương**, Nguyễn Tuấn Anh**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu ñịnh týp gen cagA và các týp gen vacA của vi khuẩn<br /> Helicobacter pylori (H. pylori), và mối liên quan ñến ung thư dạ dày ở bệnh nhân khu<br /> vực Miền nam Việt Nam và thành phố Hồ Chí Minh.<br /> Bệnh nhân và phương pháp: Từ tháng 12/2008 ñến tháng 5/2010, tại Bệnh viện Đại<br /> học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí<br /> Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các týp gen của vi khuẩn H. pylori bằng<br /> phương pháp multiplex PCR. Nghiên cứu bệnh chứng gồm 126 bệnh nhân ung thư<br /> ñược mổ cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2, trong số này có 96 bệnh nhân ung thư dạ dày;<br /> và 93 bệnh nhân viêm dạ dày có H. pylori-dương tính ñược chẩn ñoán bằng PCR,<br /> CLO test, và Giải phẫu bệnh.<br /> Kết quả: Trong 162 bệnh nhân (71 ung thư và 91 viêm dạ dày), gen cagA (+) là<br /> 95,7% (150/157), ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 100% so với 92,3% (84/91) viêm dạ<br /> dày, p = 0,018, tỷ số chênh = 1,845 (KTC 95%, 1,597 – 2,133). Gen vacA s1 là 98,1%<br /> (156/159), ở ung thư dạ dày là 100% (68/68) so với 96,7% (88/91 ) viêm dạ dày; gen<br /> vacA s2 là 3,3% (3/91) và chỉ gặp ở viêm dạ dày, với p= 0,261. Gen vacA m1 là<br /> 50,6% (81/160), ở ung thư dạ dày là 63,8% (44/69) so với 40,7% (37/91) viêm dạ<br /> dày; Gen vacA m2 là 49,4% (79/160), ung thư dạ dày là 36,2% (25/69) so với 59,3%<br /> (54/91) viêm dạ dày, p= 0,004, tỷ số chênh = 2,569 (KTC 95%, 1,348 – 4,895). Liên<br /> quan giữa gen cagA và vacA trên 157 bệnh nhân (66 ung thư dạ dày, 2 cagA (+)<br /> không xác ñịnh m, và 3 cagA (+) không xác ñịnh s; và 91 viêm dạ dày) ñã ñược xác<br /> ñịnh. Ở 66 bệnh nhân ung thư dạ dày, cagA (+) là 100%, các týp gen vacA s1/m1 ở<br /> 63,6%, và vacA s1/m2 là 36,4%. Ở 91 viêm dạ dày, cagA (+) là 92,3% và cagA (-) là<br /> 7,7%. Các týp gen vacA trong nhóm này lần lượt là s1/m1 (42%), s1/m2 (55%) và<br /> s2/m2 (3%). Trong các trường hợp cagA (+), có sự khác biệt của các týp gen vacA<br /> s1/m1 và vacA s1/m2 giữa ung thư và viêm dạ dày, p=0,025, tỷ số chênh = 2,118<br /> (KTC 95%, 1,094 – 4,1).<br /> Kết luận: Gen cagA (+) có ở tất cả các trường hợp ung thư dạ dày, và cagA (-) chỉ<br /> gặp ở viêm dạ dày. Gen cagA (+) kết hợp với kiểu gen vacA m1 của các chủng H.<br /> pylori. Đặc biệt, ở chủng H. pylori có gen cagA (+) và gen vacA s1/m1 cho thấy nguy<br /> cơ cao liên quan ñến bệnh ung thư dạ dày.<br /> Từ khóa : Gen cagA và vacA; Helicobacter pylori; Ung thư dạ dày.<br /> *Bệnh viện - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.<br /> **Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh<br /> Địa chỉ liên lạc: Trần Thiện Trung, PGS TS BS Bộ môn Ngoại, Đại học Y Dược TP.<br /> Hồ Chí Minh. Điện thoại: 0903645659; Email: drtranthientrung@ yahoo.com.<br /> ABSTRACT<br /> <br /> 1<br /> <br /> RESULTS OF VACA GENOTYPES AND CAGA GENE OF HELICOBACTER<br /> PYLORI IN GASTRIC CANCERS<br /> Aim: The main objective of this study was to determine cagA and vacA genotypes of<br /> Helicobacter pylori and evaluating the relation of these genotypes to gastric cancer in<br /> patients in Ho Chi Minh city and the southern area of Vietnam.<br /> Patients and methods: From December 2008 to May 2010, at University Medical<br /> Center and University of Natural Science in Ho Chi Minh city. We underwent a study<br /> to investigate cagA gene and vacA genotypes of Helicobacter pylori in infected<br /> patients with gastric cancer by multiplex polymerase chain reaction assay. The casecontrol study includes 126 patients with gastric cancer, operated by subtotal<br /> gastrestomy, R2 ganglion curage and 93 patients with gastritis. All patients were<br /> diganosed H. pylori infection by PCR, urease test (CLO test), or pathology.<br /> Results: Of the 162 patients, including 71 gastric cancers and 91 gastritis, the ratio of<br /> cagA-positive was 95.7% (150/157). All patients with gastric cancer and 92.3%<br /> patients with gastritis were cagA-positive (p=0.018, OR=1.845, CI=1.597-2.133).<br /> The vacA s1 was 98.1%. In gastric cancer group, allele s1 was 100%, compared to<br /> 96.7% in gastritis group; Allele s2 was 3.3% and just identified in gastritis group<br /> (p=0.261). The vacA m1 and m2 were 50.6 (81/160) and 49.4% (79/160). In gastric<br /> cancer group, allele m1 was 63.8% and allele m2 was 36.2%, while in gastritis group<br /> allele m1 was 40.7% and m2 was 59.3% (p=0.004, OR=2.569, CI=1.348-4.895)<br /> The relation between cagA gene and vacA genotypes with gastric cancer was<br /> identified. 157 patients were studied. Of 66 patients with gastric cancer, cagApositive was 100% within this group, vacA s1m1 and s1m2 genotypes were 63.6% and<br /> 36.4%. Of 91 patients with gastritis, cagA-positive was 92.3% and cagA-negative was<br /> 7.7%. In this group, there were three genotypes for vacA gene: s1m1 (42%), s1m2<br /> (50.5%), s2m2 (3%). In patients with cagA-positive, there was a significant difference<br /> between vacA genotype s1/m1 and s1/m2 in two groups (p=0.025, OR=2.118,<br /> CI=1.094 - 4.100).<br /> Conclusion: The cagA-positive genotype existed in all gastric cancer patients and<br /> cagA-negative just appeared in gastritis. The cagA-positive genotype always<br /> coexisted with vacA m1 genotype. Specially, H. pylori with cagA-positive and vacA<br /> s1m1 genotype showed a significant association with gastric cancer.<br /> Keywords: cagA and vacA genotypes; Helicobacter pylori; Gastric cancer<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Vi khuẩn H. pylori ñược tìm ra vào tháng 4 năm 1982, kể từ ñó ñã có rất nhiều<br /> công trình nghiên cứu về vi khuẩn này gây ra các bệnh ở dạ dày-tá tràng như viêm,<br /> loét và ung thư dạ dày [15]. Năm 1983, Marshall là một trong hai người tìm ra H.<br /> pylori lần ñầu tiên ñưa ra giả thuyết về sự kết hợp giữa nhiễm H. pylori và ung thư dạ<br /> dày [7]. Năm 1994, Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency<br /> for Research on Cancer-IARC) dựa trên các bằng chứng dịch tễ học ñã nêu lên sự liên<br /> quan giữa nhiễm H. pylori với carcinom hay là ung thư dạ dày, và Tổ chức Y tế Thế<br /> giới (WHO) ñã công nhận và xếp H. pylori là tác nhân quan trọng hàng ñầu hay nhóm<br /> 1 các tác nhân gây carcinom dạ dày [8].<br /> Liên quan ñến bệnh sinh, ngoài các yếu tố môi trường, yếu tố ký chủ có các thay<br /> ñổi về di truyền như thay ñổi về gen... là những tác nhân có khả năng gây bệnh. Một<br /> yếu tố quan trọng khác ñó là ñộc lực của vi khuẩn H. pylori có thể nhiều hay ít hoặc là<br /> 2<br /> <br /> cao hay thấp tùy thuộc vào các chủng H. pylori liên quan ñến các gen cagA và gen<br /> vacA. Gen cagA (cytotoxin-associated gene) và gen vacA (vacuolating toxin gene) là<br /> các gen ñược coi là yếu tố ñộc lực chủ yếu có khả năng gây bệnh và ñặc trưng của vi<br /> khuẩn H. pylori [1, 6]. Sự kết hợp giữa các gen cagA và các týp gen vacA có thể liên<br /> quan ñến nguy cơ với các mức ñộ biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh [5]. Gen<br /> cagA có thể không có ở tất cả các chủng H. pyori [3]. Protein cagA, có kích thước từ<br /> 128 ñến 140 kDa, có khả năng kích thích phản ứng phosphoryl hóa tyrosine trong tế<br /> bào ký chủ, dẫn ñến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ dày [11]. Gen<br /> vacA có chứa ít nhất hai vùng biến ñổi gồm vùng tín hiệu và vùng giữa. Vùng giữa<br /> (middle) của gen vacA có các týp gen là m1/m2 và vùng tín hiệu (signal) có thể có các<br /> týp gen là s1/s2. Mức ñộ ñộc tố cao hay thấp của gen vacA phụ thuộc vào các týp gen<br /> của hai vùng này. Chủng H. pylori với týp gen vacA s1/m1 có ñộc tố trên tế bào mạnh<br /> hơn týp gen vacA s1/m2, trong khi ñó chủng H. pylori với týp gen vacA s2/m2 không<br /> gây ñộc tố [1].<br /> Để hiểu rõ hơn về tính ña dạng và vai trò của các týp gen vacA của H. pylori liên<br /> quan ñến các bệnh dạ dày, Rhead và cs [12] ñã nêu lên ngoài 2 vùng giữa của gen vacA<br /> có các týp gen là m1 hoặc m2 và vùng tín hiệu có các týp gen là s1 hoặc s2 còn có<br /> vùng trung gian (intermediate) ký hiệu là i. Ở vùng trung gian có 2 cặp alleles khác<br /> nhau gồm i 1 (vacuolating) và i 2 (nonvacuolating). Tất cả các cặp gen vacA s1/m1<br /> thuộc týp i 1, tất cả các gen vacA s2/m2 thuộc týp i 2, và vacA s1/m2 có thể thuộc týp<br /> i 1 hoặc i 2.<br /> Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm H. pylori cao, và ung thư dạ<br /> dày hiện ñang là một vấn ñề lớn, thời sự trong các bệnh ung thư ñường tiêu hoá. Vì<br /> vậy việc nghiên cứu ñể hiểu rõ hơn về bệnh sinh của ung thư dạ dày nhằm tìm ra<br /> những chiến lược can thiệp có hiệu quả ñể ñiều trị và phòng ngừa là vấn ñề hết sức<br /> quan trọng và cấp thiết.<br /> Công trình nghiên cứu này của chúng tôi dựa trên phương pháp multiplex PCR<br /> ((Polymerase Chain Reaction) ñể xác ñịnh các týp gen cagA và vacA với các týp gen<br /> vacA s1/s2; vacA m1/m2 của H. pylori, và mối liên quan giữa các týp gen này với ung<br /> thư dạ dày ở bệnh nhân khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và Miền Nam Việt Nam.<br /> Trên cơ sở ñó nhằm mục ñích tầm soát và theo dõi những bệnh nhân nhiễm H. pylori<br /> với các týp gen mắc phải có nguy cơ cao của bệnh ung thư dạ dày.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 ñến tháng 5/2010, tại Bệnh viện Đại<br /> học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các týp gen của vi<br /> khuẩn H. pylori.<br /> Thiết kế nghiên cứu bệnh chứng gồm 2 nhóm: (1) 126 bệnh nhân ung thư dạ dày<br /> (hang vị) ñược mổ cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2, trong số này có 96 bệnh nhân ung thư<br /> dạ dày có H. pylori-dương tính và 30 H. pylori-âm tính ; và (2) nhóm chứng 93 viêm<br /> dạ dày có H. pylori-dương tính ñược ñưa vào nghiên cứu.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> 3<br /> <br /> Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ: chọn các bệnh nhân sau mổ cắt bán phần<br /> dưới dạ dày do ung thư biểu mô tuyến (carcinoma). Loại trừ các trường hợp: bệnh<br /> phẩm không ñạt yêu cầu về kích thước và bảo quản, các thương tổn khác như<br /> Limphoma, Sarcoma dạ dày.<br /> Thu thập mẫu<br /> Bệnh nhân sau mổ cắt bán phần dưới dạ dày do ung thư. Tiến hành lấy 6<br /> mẫu mô : Mẫu mô ung thư (mô bệnh) ñược lấy ở ranh giới mô lành và mô ung thư,<br /> mẫu mô lành lấy cách thương tổn ít nhất 5 cm về phía trên của bờ cắt dạ dày. Hai mẫu<br /> mô (khoảng 0,5 cm) chẩn ñoán CLO test. Bốn mẫu mô kích thước khoảng 1 cm - 1,5<br /> cm gồm : 1 mô lành và 1 mô bệnh ñược gửi làm mô bệnh học tại Bộ môn Giải phẫu<br /> bệnh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Hai mẫu mô còn lại ñược gửi xác ñịnh týp<br /> gen tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh.<br /> Nhóm chứng bệnh nhân viêm dạ dày có H. pylori-dương tính ñược lấy từ 3<br /> mẫu sinh thiết dạ dày trong lúc nội soi, kích thước các mẫu khoảng 0,5 cm gồm : 1<br /> chẩn ñoán CLO test, 1 chẩn ñoán mô bệnh học, và 1 gửi ñịnh danh týp gen của H.<br /> pylori.<br /> Chẩn ñoán nhiễm H. pylori : bệnh nhân trong nghiên cứu ở cả 2 nhóm ung<br /> thư và viêm dạ dày có H. pylori-dương tính ñược chẩn ñoán ñồng thời bằng 3 thử<br /> nghiệm : (1) thử nghiệm urease (CLO test) ; (2) Giải phẫu bệnh ; và (3) Phản ứng<br /> chuỗi trùng hợp (PCR). H. pylori-dương tính ñược ñịnh nghĩa khi có ít nhất 2 trong 3,<br /> và hoặc cả 3 thử nghiệm dương tính.<br /> Xác ñịnh các týp gen của H. pylori: Sử dụng Master mix PCR kết hợp với các<br /> cặp mồi ñặc hiệu. Mồi ñược tổng hợp từ công ty IDT (Hoa Kỳ). Mồi dùng cho phản<br /> ứng PCR xác ñịnh VacA và cagA ñược lấy từ công trình của Kumar S, Kumar A,<br /> Dixit V K và cs năm 2008 [9] và Chattopadhyay và cs năm 2004 [5]. Mồi dùng phát<br /> hiện gene urease ñược chúng tôi thiết kế dựa trên các phần mềm chuyên dụng. Chúng<br /> tôi cũng khảo sát tính ñặc hiệu của mồi ñã chọn trên chứng dương là các chủng H.<br /> pylori J99 (s1m1cagA+) ; và chứng âm là trên một số vi khuẩn khác và trên mẫu<br /> không chứa H. pylori. DNA bộ gen H. pylori sau khi tách chiết ñược dùng ñể tiến<br /> hành phản ứng multiplex PCR trong hệ thống PCR CFX96TM Real-Time (BioRad).<br /> Mẫu DNA H. pylori chứng trong các phản ứng PCR là các sản phẩm nhân bản có týp<br /> gen cagA (+) vacA s1m1 và cagA (+) vacA s1m2 ñược xác ñịnh bằng phương pháp<br /> giải trình tự.<br /> Kết quả ñiện di các sản phẩm của phản ứng multiplex PCR (hình 1) tương ứng với<br /> các kiểu gen cagA (+)/(-), vacA s1/s2, vacA m1/m2 và gen hGSTP từ mẫu sinh thiết<br /> chứa H. pylori của 4 bệnh nhân. Kết quả cho thấy các sản phẩm PCR tạo ra có kích<br /> thước phù hợp với kích thước dự kiến: vacA m1/m2 (567/642 bp), cagA (349 bp),<br /> vacA s1/s2 (259/286 bp) và hGSTP (192 bp). Tín hiệu thu ñược mạnh và ñặc hiệu,<br /> không có sản phẩm ký sinh. Điều này cho thấy bộ mồi gồm 4 cặp mồi sử dụng trong<br /> phản ứng multiplex PCR hoạt ñộng tốt với nồng ñộ và chương trình ñã xác ñịnh. Các<br /> sản phẩm nhân bản ñược kiểm tra bằng giải trình tự cho thấy phù hợp với trình tự gen<br /> của H. pylori ñã công bố. Phản ứng multiplex PCR dùng phát hiện và ñịnh týp gen<br /> của vi khuẩn H. pylori ñạt hiệu quả và ñộ chính xác cao, với cường ñộ tín hiệu ñặc<br /> trưng cho từng gen không chênh lệch. Điều này cho thấy các ñiều kiện của phản ứng<br /> ñã ñược tối ưu hóa và phù hợp cho sự nhân bản của các gen.<br /> <br /> 4<br /> <br /> Kết quả áp dụng quy trình trên một số bệnh phẩm của bệnh nhân viêm và ung thư<br /> dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ưu thế của týp gen cagA (+), vacA<br /> s1m1; và cagA (+), vacA s1m2.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả multiplex PCR phát hiện và phân týp gen cagA và vacA của H.<br /> pylori<br /> Giếng (+), chứng dương là DNA H. pylori có kiểu gen cagA (+), vacA s1m2;<br /> giếng (-), chứng âm; giếng 1, cagA (-), vacA s1m2; giếng 2, cagA (+), vacA s1m2;<br /> giếng 3, cagA (+), vacA s1m1. Giếng 4, cagA (-), vacA s2m2; giếng M, thang phân<br /> tử 100-bp (Bio-Rad)<br /> Xử lý và phân tích thống kê : Dữ liệu thu thập ñược nhập, xử lý và phân tích<br /> bằng phần mềm SPSS 15.0. Các phép kiểm T-test, Fisher’s exact, chi bình phương<br /> (χ2 ) ñược dùng trong nghiên cứu có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Xác ñịnh các yếu<br /> tố nguy cơ bằng tỷ số chênh (Odds Ratio) với khoảng tin cậy 95%.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Đặc ñiểm bệnh nhân xác ñịnh týp gen<br /> a.<br /> <br /> 96 bệnh nhân ung thư dạ dày có H. pylori-dương tính ñược xác<br /> <br /> ñịnh týp gen, trong số này:<br /> <br /> • 25 trường hợp PCR không có kết quả cả vacA và cagA<br /> • 2 trường hợp cagA (+) nhưng không xác ñịnh ñược m<br /> • 3 trường hợp cagA (+) nhưng không xác ñịnh ñược s<br /> b. Nhóm chứng 93 viêm dạ dày có H. pylori-dương tính, trong số<br /> này 2 trường hợp PCR không có kết quả cả cagA và vacA.<br /> Tuổi của bệnh nhân<br /> Bảng 1. Tuổi trung bình của bệnh nhân<br /> Nhóm bệnh<br /> nhân<br /> <br /> Số bệnh<br /> nhân<br /> <br /> Tuổi trung<br /> bình<br /> <br /> Ung thư dạ dày<br /> <br /> 71<br /> <br /> 59,54 ± 12,74<br /> <br /> Viêm dạ dày<br /> <br /> 91<br /> <br /> 46,42 ± 12,75<br /> <br /> Nhận xét: Tuổi trung bình của bệnh nhân ở 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm<br /> dạ dày khác biệt có ý nghĩa với p< 0,001 (T test).<br /> 5<br /> <br />