Khóa luận tốt nghiệp: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên động học lên men Cellulose của vi khuẩn Acetobacter Xylinum

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

68
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum; khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum; khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên động học lên men Cellulose của vi khuẩn Acetobacter Xylinum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG ab LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Sinh viên thực hiện : Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên : 1511539376 Lớp : 15DTP1A Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Quốc Duy Tp.HCM, tháng 12 năm 2019
TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KỸ THUẬT THỰC PHẨM & MÔI TRƯỜNG Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Tp. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2019 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Hoàng Thị Lệ Hoa Mã số sinh viên: 1511539376 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Lớp: 15DTP1A 1. Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT LÊN ĐỘNG HỌC LÊN MEN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 2. Nhiệm vụ luận văn ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. ˗ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/6/2019 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ luận văn: 15/11/2019 5. Người hướng dẫn: Họ và tên Học hàm, học vị Đơn vị Phần hướng dẫn Nguyễn Quốc Duy ..... Thạc sĩ .......................... BM CNTP...................... 100% Nội dung và yêu cầu của luận văn đã được thông qua bộ môn. Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) ThS. Nguyễn Thị Vân Linh ThS. Nguyễn Quốc Duy
LỜI CẢM ƠN Để có được thành công như ngày hôm nay, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn của em, thầy Nguyễn Quốc Duy về những hướng dẫn và lời khuyên có giá trị. Em cảm thấy có động lực hơn trong suốt ba tháng làm thí nghiệm. Thầy đã truyền cảm hứng cho em rất nhiều để hoàn thành dự án này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường đã cung cấp cho em những thông tin, hướng đi và nền tảng kiến thức cần thiết cho em đạt được những mục đích học tập của mình. Em muốn cảm ơn các anh chị trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong khoảng thời gian qua. Nếu không có sự hiểu biết của anh chị về các thiết bị thì việc hoàn thành dự án của em sẽ rất khó khăn. Cuối cùng, em dành một sự cảm ơn đến gia đình, bạn bè cho một tình yêu thương và giúp đỡ ấy. Em xin kính chúc Quý thầy cô Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường và thầy Nguyễn Quốc Duy dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh trồng người cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. iv
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi đã thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Quốc Duy. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, không sao chép của bất cứ ai, và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học của nhóm nghiên cứu nào khác cho đến thời điểm hiện tại. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình và chấp nhận những hình thức xử lý theo đúng quy định. Tp.HCM, ngày 25 tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn (Ký và ghi rõ họ tên) Hoàng Thị Lệ Hoa v
TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 50, 100, 200 g/L. Quá trình lên men celulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng, hàm lượng glucose, số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men và hiệu suất sinh tổng hợp cellulose. Với lượng đường ban đầu 100 g/L theo thời gian, hàm lượng acid tăng do vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng, pH không thay đổi đáng kể trong 2 ngày đầu từ (4.203–4.093); sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 (3.346) và không thay đổi ở các ngày cuối quá trình lên men. Hàm lượng đường giảm mạnh từ ngày 0–5 từ (95.189–43.643 g/L) là do vi sinh vật đang ở pha phát triển bắt đầu sử dụng đường. Với lượng đường ban đầu 200 g/L hàm lượng đường giảm dần từ ngày 0–8 từ (206.784–118.993 g/L) do vi sinh vật đang ở pha tăng trưởng nên nguồn cung cấp carbon ban đầu giảm, vi khuẩn bắt đầu sử dụng acid gluconic trong quá trình trao đổi chất và trong thời gian này độ kết tinh của màng BC tăng dần. Khi hàm lượng đường giảm dẫn đến tổng hàm lượng vi sinh vật tăng và thời gian lên men tăng thì tổng hàm lượng vi sinh vật tăng. Theo khảo sát cho thấy hàm lượng glucose và màng BC tỷ lệ nghịch với nhau, glucose là nguyên liệu chính để tổng hợp màng BC. vi
MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ............................................................ iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ iv LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... v TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP .............................................................. vi MỤC LỤC ............................................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH............................................................................................... ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... xi Chương 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI....................................... 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 1 1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 1 1.2.2 Mục tiêu cụ thể........................................................................................ 2 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 2 Chương 2. TỔNG QUAN................................................................................ 3 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM............................................... 3 2.1.1 Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3 2.1.2 Đặc điểm sinh lý ..................................................................................... 4 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE ................................................... 4 2.2.1 Thành phần môi trường lên men ............................................................. 4 2.2.2 Phương pháp lên men ............................................................................. 4 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ............................................................................. 5 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN .......................................................................... 6 Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 7 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT ..................................................... 7 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị .................................................................................... 7 3.1.2 Hóa chất .................................................................................................. 7 vii
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................ 8 3.2.1 Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 8 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 8 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 8 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật............................................................. 8 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose ............................................. 9 3.3.3 Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 9 3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................................................................. 9 3.4.1 Xác định hàm lượng cellulose sinh tổng hợp ......................................... 9 3.4.2 Xác định hàm lượng vi sinh vật .............................................................. 9 3.4.3 Xác định hàm lượng đường khử ............................................................. 9 3.4.4 Xác định độ acid tổng ........................................................................... 10 3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................... 10 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 11 4.1 SỰ THAY ĐỔI pH VÀ ĐỘ ACID TỔNG ..................................................11 4.2 SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT ........................................... 13 4.3 SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG GLUCOSE VÀ CELLULOSE ........... 15 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................ 19 5.1 KẾT LUẬN ................................................................................................. 19 5.2 KHUYẾN NGHỊ ........................................................................................ 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 20 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi ................................. 4 Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu Schweiz GmbH) .................................. 7 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom Company Ltd.) ..................................................... 7 Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Instruments Co.,Ltd.) ......................................... 8 Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Co.KG)..................................................... 8 Hình 4.1 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L ..................................................................................................................... 11 Hình 4.2 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L ................................................................................................................... 12 Hình 4.3 Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L ................................................................................................................... 13 Hình 4.4 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L ...................................................................................... 14 Hình 4.5 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L .................................................................................... 14 Hình 4.6 Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L .................................................................................... 15 Hình 4.7 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 50 g/L 16 Hình 4.8 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L ............................................................................................... 16 ix
Hình 4.9 Sự thay đổi hàm lượng glucose (g/L) và cellulose (g DW/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L ............................................................................................... 17 x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt BC Bacterial cellulose Cellulose vi khuẩn BC_W Width of bacterial cellulose layer Chiều dày lớp cellulose HS Hestrin-Schramm medium Môi trường Hestrin-Schramm TA Total acidity Độ acid tổng DW On a dry weight Theo chất khô xi
Chương 1. MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT VÀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của -1,4-glucose. Mức độ trùng hợp của cellulose thay đổi từ 100–15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Khi cellulose được xử lý bằng acid đậm đặc ở nhiệt độ cao thì cấu trúc của nó sẽ bị phân hủy thành các đơn vị glucose [2]. Cellulose là thành phần cấu trúc chính tạo nên thành tế bào của hầu hết các loại thực vật và nó chủ yếu được lấy từ các nguồn thực vật từ sợi lông, gỗ có chứa khoảng 40-90% là cellulose. Cellulose có giá trị thương mại trong sản xuất giấy, sợi nano cellulose [3], [4]. Ngoài thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial cellulose – BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [5]. Các nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các loại vi khuẩn Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi. Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá nhiều trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho đến nay chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ [6]–[8]. Hơn nữa, một môi trường tiêu chuẩn được sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như môi trường Hestrin-Schramm rất tốn kém và đòi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy [9]. Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên việc sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu nguồn sinh tổng hợp cellulose từ vi sinh vật với nhiều ưu điểm so với cellulose từ thực vật ứng dụng trong công nghiệp vật liệu và y học. 1
1.2.2 Mục tiêu cụ thể Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi số lượng vi khuẩn của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. 2
Chương 2. TỔNG QUAN 2.1 VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp : Alpharoteobacteria Bộ : Rhodospirillales Họ : Acetobacteraceae Chi : Acetobacter Loài : Acetobacter xylinum 2.1.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum là một loại vi sinh vât Gram âm, hiếu khí được biết đến như Gluconacetobacter xylinum, có đặc tính sinh tổng hợp cellulose. Độ dài của A. xylinum nằm trong khoảng 2–10 µm, với chiều rộng nằm trong phạm vi 0.5–1 µm [6]. A. xylinum thường phát triển ở độ pH từ 5.4-6.3 và nhiệt độ khoảng 28–31C và có thể tích lũy 4.5% acid acetic. Một tế bào A. xylinum có khả năng polymer hóa 200000 phân tử glucose/giây tạo thành β-1,4-glucan và sau ñó được bài tiết vào môi trường xung quanh tạo thành dạng sợi. A. xylinum được tìm thấy trên trái cây, ngũ cốc, trà thảo dược, rau hư, đất, nước, hoa, trái cây và mật ong, nơi xảy ra quá trình lên men đường [10]. Sự tăng trưởng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý và sinh hóa. Các yếu tố vật lý bao gồm pH, nhiệt độ, oxy nồng độ, độ ẩm, áp suất (thủy tĩnh và thẩm thấu) và bức xạ. Mặt khác, các yếu tố sinh hóa bao gồm sự sẵn có của carbon, nitrogen, lưu huỳnh, phosphor, và vitamin [11]. Những vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn acid acetic có khả năng tạo thành acid từ glucose, rượu ethyl, rượu propyl chứ không phải oxy hóa acid thành carbon dioxide và nước với sự có mặt của oxy. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng trùng hợp glucose thành cellulose chỉ qua quá trình tổng hợp, những vi khuẩn này được hình thành khi có sự kết hợp của 6 đến 8 tế bào và không tạo thành sắc tố nội bào. A. xylinum có khả năng chống lại những thay đổi đột ngột như khi giảm lượng nước hoặc khi có sự hiện diện của các chất độc hại và những sinh vật gây bệnh. Mặc dù thời tiết không thuận lợi nhưng A. xylinum có thế phát triển và sản xuất cellulose trong màng bao. Có 23% tế bào vi khuẩn được bao bọc cellulose tồn tại sau khi được 3
xử lý bằng bức xạ UV, loại bỏ các polysaccharide để có thể bảo vệ cellulose khỏi tế bào vi khuẩn dẫn đến việc giảm mạnh tỷ lệ sống của vi khuẩn là 3% [12]. Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 2.1.2 Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ từ 28–32C. Ở nhiệt độ 37C, hầu hết các tế bào đều bị suy thoái hoàn toàn ngay cả ở môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn nhiều khảo sát khác nhau về các yếu tố như nhiệt độ và pH tối ưu cho vi khuẩn A. xylinum sinh trưởng và tạo màng. Vi khuẩn A. xylinum có thể chịu được pH thấp, do đó có thể bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế được sự nhiễm khuẩn lạ. 2.2 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CELLULOSE 2.2.1 Thành phần môi trường lên men Nước dừa được sử dụng tốt nhất trong sản xuất biocellulose, vì chứa nhiều amino acid giúp tăng trưởng, phát triển hoạt động của A. xylinum. Để tăng trưởng và hoạt động, A. xylinum đòi hỏi các yếu tố đa lượng và vi lượng. Các yếu tố đa lượng được làm từ carbon và nitrogen. Ngoài carbohydrate và protein, trong nước dừa còn chứa nhiều khoáng chất cần thiết cho A. xylinum như: K, Na, Mg, Ca, P. Loại nước dừa tốt nhất có thể được lấy từ trái dừa già. Mặt khác trong nước dừa non hầu như không chứa khoáng chất cần thiết [13]. 2.2.2 Phương pháp lên men Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A. xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn, rìa mép khuẩn lạc thường gợn sóng có màu trắng, khuẩn lạc lồi lên thuận tiện cho việc dễ tách ra khỏi môi trường. Do vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường lỏng ở điều kiện 4
tĩnh nên chúng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose. Trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành những hạt nhỏ có kích thước không bằng nhau và phân tán trong môi trường tạo thành những đặc tính hình thái khác với cellulose được nuôi cấy ở điều kiện tĩnh [14]. 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 2.2.3.1 Nguồn carbon Trong số các nguồn carbon, sucrose, glucose và mannitol là những nguồn carbon tối ưu cho sự hình thành cellulose. Sucrose 60 g/L là hàm lượng cơ chất tối ưu cho sinh tổng hợp cellulose trong khi 70 g/L là giá trị tối ưu cho glucose và mannitol với hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là 5.0 g/L. Ngoài ra, lactose, galactose, acid citric , tinh bột và maltose cũng cho hiệu suất sinh tổng hợp celllulose là 2.0 g/L [15]. 2.2.3.2 Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen có thể được sử dụng trong hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ. Chiết xuất men và casein là những sản phẩm tốt được sử dụng cho sự tăng trưởng và hình thành biocellulose. Những nguồn nitrogen có thể được sử dụng bao gồm casein hydrolysate, peptone, glutamate và ammonium sulfate [15]. Tuy nhiên, ammonium sulfate và ammonium phosphate là những vật liệu phù hợp hơn được sử dụng về mặt kinh tế và năng suất chất lượng của biocellulose [16]. Trong môi trường lên men chứa sucrose, việc bổ sung bột đậu nành hoặc ammonium sulfate thu được ít cellulose hơn khi sử dụng peptone hay casein hydrolysate. Điều này cho thấy rằng nguồn nitrogen cũng đóng góp vào việc cải thiện sự sinh tổng hợp cellulose [15]. 2.2.3.3 pH A. xylinum là một loại vi khuẩn ưa acid có thể phát triển trong môi trường pH thấp. Nó có thể sống ở pH thấp tới 3.5 [17]. Độ pH tối ưu nằm trong khoảng từ 5.4–6.3 [18]. Các giá trị pH thuận lợi nhất cho sự hình thành cellulose của vi khuẩn ở pH 4.0 và 5.0 [10]. Những giá trị pH thúc đẩy tăng trưởng tối ưu và ảnh hưởng đến oxy hấp thu trong quá trình lên men. Hầu hết các nhà nghiên cứu đã sử dụng pH 5.0 [17], [19]. 2.2.3.4 Nhiệt độ Nhiệt độ để A. xylinum phát triển tối ưu từ 28–31C. Ở nhiệt độ dưới 28C vi khuẩn phát triển chậm trong khi ở nhiệt độ trên 31C bắt đầu gây ra thiệt hại cho A. xylinum và có thể dẫn đến tử vong [16]. 5
2.2.3.5 Oxy Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí do đó chúng rất cần oxy trong quá trình sinh trưởng, phát triển. Khi thiếu oxy vi khuẩn này sẽ bị gián đoạn tăng trưởng có thế dẫn đến tử vong. Do đó những thùng chứa được sử dụng cho quá trình lên men cần phải được mở thoáng [16]. 2.3 CELLULOSE VI KHUẨN Cellulose tương đối tinh khiết được sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum. Vi sinh vật này đã được nghiên cứu trong hơn 100 năm. Không giống như cellulose từ bột gỗ, cellulose vi khuẩn không có các polysaccharide tạp khác như lignin và hemicellulose. Ngoài ra, sự phân lập và tinh chế của nó tương đối đơn giản, không cần các quá trình sử dụng nhiều năng lượng hoặc hóa học [20]. Vi khuẩn này đã được sử dụng làm hệ thống mô hình trong việc khám phá các quá trình sinh học [21], [22]. Các vi sinh vật sản xuất polysacchride rất đơn giản và có khả năng tạo nên một polymer từ các nguyên liệu đơn giản có sẵn và các nguồn nguyên liệu thứ cấp. Các sản phẩm từ củ cải đường (mật đường, syrup đường và sucrose), ngô (tinh bột, tinh bột thủy phân, syrup glucose và glucose), và khoai tây (tinh bột thủy phân và tinh bột) có thể được sử dụng để sản xuất các polymer như vậy. Các chất không ăn được như gỗ, chất thải sản xuất dextran, chất thải hóa dầu và các sản phẩm, ethanol, methanol, glycerin và ethylene glycol thường phù hợp [23]. BC có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau tùy thuộc vào loại vi sinh vật sinh tổng hợp ra chúng. Trong số các vi khuẩn đã nói ở trên, các vi sinh vật hiệu quả nhất để sản xuất BC là A. xylinum, A. hansenii và A. pasteurianus. Trong số này, A. xylinum đã được sử dụng để sản xuất BC thương mại do năng suất cao. Mặc dù cả cellulose thực vật và BC đều được sản xuất trong tự nhiên, nhưng sự thay đổi đáng kể đã được tìm thấy giữa chúng về độ tinh khiết, tính chất phân tử và đặc tính. So với cellulose thực vật, BC có giá trị module Young cao [24]–[26], khả năng hấp thụ nước cao [27] làm cho nó trở thành vật liệu hữu ích trong nhiều ngành công nghiệp, như thực phẩm, sản xuất giấy và ứng dụng dược phẩm. 6
Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT 3.1.1 Dụng cụ - thiết bị Cốc thuỷ tinh Giá ống nghiệm pH kế Pipet Erlen Bình định mức Nhiệt kế Ống nghiệm Bình định mức Ống ly tâm Cốc thuỷ tinh Phễu Micropipet Đũa thuỷ tinh 3.1.2 Hóa chất Chế phẩm enzyme cellulase (Viscozyme®L, Novozymes, Đan Mạch) dạng lỏng có hoạt tính 100 FBG/g. Glucose, peptone, chất chiết men, Na2HPO4, citric acid monohydrate, ammonium sulfate, acid acetic, sodium acetate, nước cất… đều đạt chuẩn phân tích. Hình 3.1 Máy quang phổ UV-1800 Hình 3.2 Máy ly tâm 80-2 (Wincom (Shimadzu Schweiz GmbH) Company Ltd.) 7
Hình 3.3 Cân phân tích PA (OHAUS Hình 3.4 Tủ sấy UN55 (Memmert GmbH + Instruments Co.,Ltd.) Co.KG) 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 10 năm 2019. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH Nguyễn Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12, Tp.HCM. 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Quá trình nhân giống vi sinh vật Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0), peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na2HPO4 (2.7), và citric acid monohydrate (1.15) và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [28]. Môi trường được bổ sung thêm ammonium sulfate (4 g/L) để kích thích quá trình tăng sinh khối. Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú, Giồng Trôm, Bến Tre) trên môi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4 g/L) và diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 30C. Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ giống cấy 10% ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và 8
tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men còn lại được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn. 3.3.2 Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 50, 100 và 200 g/L với tỷ lệ giống cấy 10%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 15 ngày ở nhiệt độ 30C. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý. 3.3.3 Bố trí thí nghiệm HS, Giống o 10%, 30 C, 5 ngày Cấy 10% HS HS HS (Glucose50g/L) (Glucose100g/L) (Glucose200g/L) Lên men tĩnh o 30 C, 15 ngày Màng cellulose Dịch lên men Xử lý Vi sinh Đường pH Acid tổng vật khử Xác định khối lượng 9