Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận là: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). Đánh giá tác dụng ức chế enzym anpha-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học: Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS. BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS. ĐẶNG KIM THU Hà Nội – 2020
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận với đề tài “Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)”, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình của PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu. Bên cạnh đó là sự giảng dạy tâm huyết của các thầy cô giáo tại Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội và sự khích lệ, cổ vũ của gia đình đã luôn bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu cho việc hoàn thành khóa luận. Với những tình cảm chân thành, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới 2 thầy cô đã hướng dẫn tôi trong khóa luận này là PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược, người không chỉ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này mà còn định hướng cho tôi trên con đường sự nghiệp sắp tới. Nhân dịp này, tôi cũng chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi cơ sở vật chất và cho phép tôi sử dụng các dụng cụ, phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Trong quá trình thực hiện tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô tại các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bào chế, Dược liệu – Dược cổ truyền và Hóa dược – Kiểm nghiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Mặc dù bản thân đã nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót. Kính mong quý thầy, cô giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 6 năm 2020 Tác giả khóa luận Ngô Hà Linh Trang
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 3 MỤC LỤC.............................................................................................................. 4 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................................... 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .......................................................... 7 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 8 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh tiểu đường .................................................................. 3 1.1.1. Khái niệm.............................................................................................. 3 1.1.2. Phân loại đái tháo đường ....................................................................... 3 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường tuýp 2 .......................................... 4 1.1.4. Dịch tễ học ............................................................................................ 4 1.1.5. Các biến chứng...................................................................................... 5 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường............................................. 5 1.2. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase ................. 5 1.2.1. Tổng quan về enzym và chất ức chế enzym ........................................... 5 1.2.2. Enzym α-glucosidase ............................................................................. 6 1.2.3. Các chất ức chế enzym α-glucosidase .................................................... 7 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa ...................... 8 1.3.1. Khái niệm.............................................................................................. 8 1.3.2. Các chất chống oxy hóa ......................................................................... 9 1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và tác dụng chống oxy hóa in vitro............................................................................ 11 1.4.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro ...................................................................................................................... 11 1.4.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ................ 12 1.5. Tổng quan về Hồng đảng sâm.................................................................. 13 1.5.1. Nguồn gốc, phân loại........................................................................... 13 1.5.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................... 14 1.5.3. Bộ phận dùng ...................................................................................... 15 1.5.4. Thành phần hóa học ............................................................................ 15 1.5.5. Tác dụng và công dụng........................................................................ 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 18 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................ 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 18 2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .................................................................... 18 2.1.3. Hóa chất, dung môi ............................................................................. 18 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 19 2.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................. 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 19 2.3.1. Phương pháp chiết xuất ....................................................................... 19 2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH ............................................................................... 20 2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao rễ Hồng đảng sâm ................................................................................... 21 2.4. Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................... 22 Chương 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 24 3.1. Quy trình chiết xuất và phân đoạn dịch chiết của cao rễ Hồng đảng sâm .......................................................................................................................... 24 3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH ............................................................... 25 3.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm........................................................................... 27 Chương 4. BÀN LUẬN........................................................................................ 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 1
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FDA Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) iNOS Nitric oxide synthase cảm ứng (Inducible nitric oxide synthase) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) n-BuOH n-buthanol pNP p-nitrophenol pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính RSS Sulfur hoạt tính SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) 𝑿 Giá trị trung bình
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên Trang 1.1. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase. 6 1.2. Nguyên tắc khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 12 1.3. Hình ảnh cây Hồng đảng sâm 12 1.4. Một số hợp chất được phân lập từ rễ Hồng đảng sâm. 16 2.1. Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm. 18 2.2. Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 20 3.1. Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm. 24 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của cao chiết toàn 3.2. phần và các phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm ở các nồng độ 26 khác nhau. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của acid 3.3. ascorbic. 27 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 3.4. của cao toàn phần và các phân đoạn của rễ Hồng đảng sâm ở 28 các nồng độ khác nhau. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 3.5. của Acarbose. 28
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Trang 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. 3 1.2. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase. 7 1.3. Các chất chống oxy hóa nội sinh. 9 Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng 1.4. hợp. 10 Khả năng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết toàn phần và 3.1. các phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm và chất đối 25 chứng ở các nồng độ khác nhau. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase in vitro của cao toàn 3.2. phần, các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm và chất đối 27 chứng ở các nồng độ khác nhau.
MỞ ĐẦU Trên toàn thế giới, đái tháo đường đang ngày một tăng về tỷ lệ, mức độ ảnh hưởng lên các vấn đề sức khỏe khác, là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, gây ra nhiều biến chứng trầm trọng và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống. Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đôi trong vòng 3 thập kỉ gần đây. Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực phẩm không thích hợp, ít hoặc không hoạt động thể lực ở trẻ em, bệnh ĐTĐ tuýp 2 đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng. Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, và cắt cụt chi [6]. Mặc dù có nhiều tiến bộ mới trong điều trị bệnh tiểu đường bằng các thuốc tân dược đường uống, việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới vẫn đang được tiếp tục vì chi phí cao và tác dụng phụ gây ra cho người bệnh. Tại Việt Nam, khuynh hướng quay về với thiên nhiên, tìm tòi, phát triển thuốc Đông y hoặc thuốc Y học cổ truyền ngày càng được chú trọng nhiều hơn khi kết hợp với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật và y học. Với lãnh thổ trải dài từ Bắc tới Nam, thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta có một nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng. Việc sử dụng thảo dược trong y học có nhiều mục đích như là cơ sở cho công nghiệp xanh và công dụng của thảo dược được nhắm đến nhiều đích, hỗ trợ điều trị được nhiều bệnh. Các nhà khoa học cũng tiến hành rất nhiều nghiên cứu chứng minh được các loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, mang lại nhiều kết quả khá khả quan, có thể được đưa vào sử dụng lâm sàng. Những loài thảo dược này có đặc điểm là chứa lượng lớn các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase. Đây là hai đích thường được sử dụng khi nghiên cứu các tác dụng của thảo dược hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica) là một vị thuốc cổ truyền được sử dụng phổ biến tại nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản,… [45] Từ nhiều loài thuộc chi Codonopsis như C.lanceolata, C.pilosula, C.ussuriesis, C. subglobosa người ta đã chiết được các triterpen glycosid và các polysaccharid có tác dụng lên hệ miễn dịch giúp điều trị ung nhọt, cải thiện trí nhớ. Ở Việt Nam, chi Codonopsis có 3- 4 loài, trong đó loại Hồng đảng sâm Việt Nam Codonopsis javanica đã được sử dụng từ lâu trong dân gian với nhiều công dụng quý như điều hòa huyết áp, tăng cường sinh lực. Các nghiên cứu phân lập các thành phần hóa học của rễ Hồng đảng sâm cho kết quả có nhiều nhóm chất quý từ tự nhiên như axit phenolic, flavonoid, alcaloid, ... Một số nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy Hồng đảng sâm có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn và hạ đường huyết nhưng qua tìm hiểu thì Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh nhằm phát triển loại thảo dược này thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường. Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.)” được thực hiện nhằm mục tiêu sau: 1
1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). 2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym anpha-glucosidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.). 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh tiểu đường 1.1.1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh [6]. 1.1.2. Phân loại đái tháo đường Đái tháo đường tuýp 1 Đái tháo đường tuýp 1 do tế bào beta bị phá hủy nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, 95% do cơ chế tự miễn (tuýp 1A), 5% vô căn (tuýp1 B). Đái tháo đường tuýp 2 Đái tháo đường tuýp 2 do suy giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin. Bảng 1.1. Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát. Các nguyên nhân ĐTĐ tuýp 1 ĐTĐ tuýp 2 Tiền sử gia đình Kháng nguyên HLA- Đặc tính dân tộc Yếu tố nguy cơ DR3, HLA-DR4 Ăn nhiều, ít tập luyện thể lực Nhiễm độc Nhiễm virus Béo phì Yếu tố khởi phát Stress chuyển hóa/ Stress chuyển hóa/ yêu cầu quá mức yêu cầu quá mức Các tế bào tại đảo tụy thoái hóa/ suy Phá hủy đảo tụy theo yếu dần Yếu tố bệnh sinh cơ chế tự miễn Giảm receptor insulin Đái tháo đường thai kỳ ĐTĐ thai kỳ là ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ tuýp 1, tuýp 2 trước đó. Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ - Đái tháo đường thứ phát Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác như ĐTĐ do bệnh lý nội tiết, do thuốc, hóa chất, bệnh lý tụy; khiếm khuyết gen liên quan đến hoạt tính 3
insulin, khiếm khuyết trên nhiễm sắc thể thường, di truyền theo gen tại tế bào beta; các hội chứng bất thường nhiễm sắc thể khác, ... [3, 4, 6] 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường tuýp 2 Hai yếu tố cơ bản trong cơ chế bệnh sinh là kháng insulin và rối loạn tiết insulin. 1.1.3.1. Cơ chế liên quan đến kháng insulin Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin. Kháng insulin do nhiều nguyên nhân: tế bào beta tiết insulin bất thường, có chất đối kháng insulin lưu thông trong máu như: glucagon, cortisol, catecholamine, hormon GH, axit béo tự do (FFA), kháng thể kháng insulin, kháng thể kháng thụ thể insulin, resistin, TNF alpha (Tumor Necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6) [20]. 1.1.3.2. Cơ chế liên quan đến rối loạn tiết insulin Khi mới mắc tiểu đường tuýp 2, insulin có thể ở mức bình thường hoặc tăng lên nhưng tốc độ tăng không tương ứng với mức tăng của glucose máu. Tế bào beta đảo tụy đáp ứng lại việc nồng độ glucose trong máu tăng quá cao bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này kéo dài khiến chức năng của tế bào beta bị suy giảm [24]. Tăng insulin máu bù trừ, tăng tiền chất không có hoạt tính proinsulin, mất tính chất tiết insulin theo từng đợt là các nguyên nhân gây rối loạn tiết insulin. 1.1.4. Dịch tễ học Đái tháo đường là căn bệnh rối loạn chuyển hóa đáng báo động nhất trên toàn thế giới ngay cả ở những nước phát triển và đang phát triển. Nó gây ra gánh nặng lên xã hội, hệ thống tài chính, y tế một cách nghiêm trọng. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), trong năm 2019, trên toàn thế giới có 463 triệu người trong độ tuổi 20-79 (chiếm 9,3% tổng số người trưởng thành trong độ tuổi này) mắc bệnh tiểu đường, dự kiến sẽ tăng lên 578,4 triệu vào năm 2030 và 700,2 triệu vào năm 2045. Phân loại bệnh học của bệnh tiểu đường chủ yếu phân tách thành tuýp 1 và tuýp 2, với ĐTĐ tuýp 2 chiếm phần lớn (> 85%) trong tổng tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ. Trong năm 2019, hơn một nửa trong số những người mắc tiểu đường (231,9 triệu người) không biết họ đang mắc bệnh, có 4,2 triệu ca tử vong trên toàn thế giới là do bệnh tiểu đường ở độ tuổi từ 20-99 và chi phí chăm sóc sức khỏe toàn cầu cho người mắc bệnh tiểu đường được ước tính là 760.3 tỷ USD. Tại Việt Nam, có 3,77 triệu người đang chung sống với bệnh đái tháo đường, chiếm 5,7% dân số từ 20 – 79 tuổi. Trong đó, 53,4% người bệnh chưa được chẩn đoán và 70% bệnh nhân đã được chẩn đoán ĐTĐ tuýp 2 song chưa đạt mục tiêu điều trị [40]. 4
1.1.5. Các biến chứng Một số biến chứng nguy hiểm và các bệnh cấp tính, mạn tính kèm theo xuất hiện khi bệnh tiểu đường không được điều trị tốt và quá trình điều trị không chặt chẽ. Biến chứng cấp tính giai đoạn đầu của đái tháo đường thường gặp: nhiễm toan ceton – hay xảy ra đối với đái tháo đường tuýp 2, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu, hạ đường huyết – hay gặp ở người bệnh dùng thuốc hạ đường huyết quá liều hoặc dùng thuốc trong khi đói bỏ bữa. Một số biến chứng mạn tính như: biến chứng mạch máu lớn (tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, bệnh mạch vành, ...), bệnh lý mạch máu nhỏ (bệnh lý thận, bệnh lý về võng mạc, bệnh lý thần kinh, ...) [4, 6]. Các biến chứng của bệnh đái tháo đường tuýp 2 có liên quan đến quá trình phát sinh và phát triển của bệnh. Do đó ngay khi phát hiện bệnh trên lâm sàng, bác sĩ đã phải tìm được các biến chứng của bệnh. 1.1.6. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh ĐTĐ được chia thành 3 nhóm chính:  Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như sulfonylurea, nateglinid (starlix)  Các thuốc làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể với insulin, giảm đề kháng insulin như: các biguanid (metformin), các thuốc nhóm thiazolidincdion.  Các thuốc chống tăng glucose máu sau bữa ăn, thuốc ức chế enzyme α- glucosidase như: acarbose, voglibose, miglitol, ... làm chất đường trong ruột được hấp thụ chậm vào cơ thể và đường ngay sau khi ăn sẽ không tăng cao trong máu. Ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2, cần kết hợp điều trị bằng thuốc, chế độ ăn và luyện tập thể chất để đạt hiệu quả quả tốt nhất. Ngoài ra, sẽ có một số đối tượng có bệnh lý mắc kèm hay thể trạng khác nhau nên cần kết hợp các thuốc trong nhóm với nhau và lưu ý tương tác thuốc nhằm giảm đường huyết an toàn và hữu hiệu. 1.2. Enzym α-glucosidase và các chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.1. Tổng quan về enzym và chất ức chế enzym Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong mọi tế bào sinh vật dưới dạng hợp chất protein có cấu trúc hóa học đặc thù. Nhờ có enzym mà nhiều phản ứng hóa học xảy ra với hiệu suất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Các phần tử tham gia vào ngay lúc đầu của quá trình phản ứng được gọi là chât nền và enzym biến đối chất nền thành các phân tử khác. Enzym có tính đặc hiệu và chọn lọc rất cao đối với các chất nền của nó, đóng vai trò định hướng tất cả mọi phản ứng xảy ra trong tế bào [16, 27]. Chất ức chế enzym có khả năng làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzym. Bản chất hóa học của các chất ức chế enzym rất khác nhau, có thể là các protein, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ, các anion hoặc các ion hóa kim loại, tạo 5
phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch với enzym. Thường sẽ có hai loại ức chế thuận nghịch là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [16, 27]. Đối với chất ức chế cạnh tranh: chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất, gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzym, làm chức năng xúc tác của enzym chậm lại. Đối với chất ức chế không cạnh tranh: chất kìm hãm gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzym (gọi là vị trí dị lập thê) chứ không gắn vào vị trí xúc tác và làm thay đối cấu hình, vị trí hoạt động của enzym khiến không phù hợp để cơ chất gắn vào. Khi giải phóng các chất ức chế, hoạt tính xúc tác của enzym sẽ bình thường trở lại [16]. 1.2.2. Enzym α-glucosidase Enzym α-glucosidase là enzym một thành phần, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym làm gãy các liên kết bằng thủy phân), có trong màng bề mặt đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa carbohydrat [21, 44]. Enzym α-glucosidase có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α- glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase: glucose được cung cấp bởi carbohydrat chứa trong thức ăn. Sau khi vào cơ thể, carbohydrat được các enzym ở tụy (α-amylase) và ruột non (α-glucosidase) tiết ra, thủy phân thành những phân tử đường đơn rồi thẩm thấu vào máu, tỏa ra để nuôi các tế bào cơ thể. Enzym α- glucosidase có chức năng xúc tác việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất đề giải phóng α-D-glucose [49]. Có thể làm giảm sự thủy phân carbohydrat và chậm sự thẩm thấu glucose vào máu bằng việc kiểm soát hoạt động của enzym α- glucosidase [35]. Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase. 6
1.2.3. Các chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.3.1. Chất ức chế enzym α-glucosidase tổng hợp Các thuốc tân dược có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tại ruột, làm giảm sự hấp thu glucose vào máu sau ăn như Acarbose, Miglitol, Voglibose được sử dụng rộng rãi trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 [3]. Acarbose là một tetrasaccharid, ít hấp thu ở đường tiêu hóa và ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase mà không gây hạ đường huyết và không gây tăng tiết insulin. Tuy vậy, nó lại để lại nhiều tác dụng phụ trên đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, tiêu chảy, buồn nôn, ... nhất là khi ăn đường mía và thực phẩm có đường do carbohydrat không được hấp thụ và lên men ở đại tràng [5]. 1.2.3.2. Chất ức chế enzym α-glucosidase tự nhiên Việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang rất được quan tâm để khắc phục những nhược điểm của các hợp chất tổng hợp. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được một số nhóm hợp chất ức chế enzym α-glucosidase như flavonoid, alcaloid, curcuminoid, phenolic, terpinoid, ... Bảng 1.2. Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [44]. STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất Quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl (1’”→2”)-β- dgalactopyranoside, Luteolin, Apigennin, Hesperetin, (+)-catechin, Cyanidin-3-galactoside, 1 Flavonoid Cyanidin-3-galactoside 2R,3R.4R,5R)2,5- bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, 1- deoxynojirmycin ... Piperumbellactam A 2 Alcaloid Piperumbellactam B Piperumbellactam C Axit 3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-a-l- 3 Saponin-triterpenoid arabinopyranosyl-(I→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)- α-Irhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester Curcumin 4 Curcuminoid Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin Chebulanin 5 Phenolic Chebulagic axit 7
Chebulinic axit (-)-3-O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin Bromophenols 6 Miscellaneous 2,4,6-trbromophenol 2,4-dibromophenol 1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa 1.3.1. Khái niệm Oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học, khi mà các electron chuyển thành chất oxy hóa, hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do sinh ra các phản ứng dây chuyền, dẫn đến phá hủy tế bào cơ thể. Các gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân thử có một điện tích lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng, bao gồm các nguyên tử, phân tử, ion, electron chưa ghép gặp. Chúng rất không ổn định và tạo phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của gốc tự do là ROS (Oxy hoạt tính), RNS (Nitrogen hoạt tính), RSS (Sulfur hoạt tính) [2, 32]. Các gốc tự do rất kém ổn định, có khả năng phản ứng cao với các chất, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà nó tồn tại [23, 32]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể:  Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể.  Từ quá trình peroxyd hóa lipid.  Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể. Đích phân tử chính của các gốc tự do gồm các aicd deoxyribonucleic (ADN), acid ribonucleic (ARN), protein, lipid và đường. Một số bệnh nghiêm trọng liên quan đến phản ứng của các gốc tự do như ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì, lupus ban đỏ, loét dạ dày, Parkinson, bệnh Alzheimer, viêm khớp dạng thấp, ung thư ... [23, 28, 50] Các cơ chế chống oxy hóa [46]:  Ức chế enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS.  Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy quá trình chống oxy hóa của tế bào.  Phản ứng trực tiếp với các gốc tự do tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính. Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các chất oxy hóa và chống oxy hóa, dẫn đến gián đoạn tín hiệu và kiểm soát oxy hóa khử, làm ảnh hưởng xấu đến các 8
phân tử sinh học thông qua việc sản sinh các peroxid và các gốc tự do [31]. Vai trò của stress oxy hóa trong sự phát triển các biến chứng đã được nghiên cứu nhằm bổ sung thêm các phương pháp điều trị các biến chứng của bệnh tiểu đường [30]. Do đó, các chất có khả năng chống oxy hóa và cân bằng chất oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường và các biến chứng của đái tháo đường gây ra. 1.3.2. Các chất chống oxy hóa 1.3.2.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có 2 loại là các chất có bản chất là enzym và các chất không phải enzym. Chúng đều có tác dụng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa nội sinh không phải là enzym được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu đến từ thực phẩm bổ sung [32]. Các nhóm chất như flavonoid, carotenoid, ... đến từ thực vật có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Các chất chống oxy hóa nội sinh có thể tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng với nhau để chống lại các gốc tự do. Nhờ vậy mà quá trình oxy hóa trong cơ thể chỉ xảy ra ở mức độ nhất định, duy trì được cân bằng trao đổi chất. Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới trong thảo dược có thể hỗ trợ điều trị các bệnh có liên quan đến sự oxy hóa trong cơ thể. Bảng 1.3. Các chất chống oxy hóa nội sinh. Bản chất là enzym Không phải enzym Catalase Vitamin A, vitamin C, vitamin E Superoxid dismutase Coenzym Q10 Glutathion peroxidase Hợp chất chứa nito (non-protein): axit Glutathion reductase uric Glucose – 6 phosphat dehydrogenase Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion 1.3.2.2. Các chất chống oxy hóa tổng hợp Các chất chống oxy hóa tổng hợp đã được chiết xuất trong phòng thí nghiệm để sử dụng trong hệ thống đo lường tiêu chuẩn chống oxy hóa so sánh với các chất chống oxy hóa tự nhiên và sử dụng trong ngành thực phẩm. Bảng 1.4. báo cáo các chất chống oxy hóa tổng hợp quan trọng nhất và có sẵn rộng rãi cũng như công dụng của chúng, cho thấy trọng tâm chính của chất chống oxy hóa tổng hợp là ngăn ngừa quá trình oxy hóa thực phẩm, đặc biệt là axit béo. BHT (butylated hydroxytoluene) và BHA (butylated hydroxyanisole) là những chất chống oxy hóa hóa học được sử dụng rộng rãi nhất [32]. 9
Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp. Tên hợp chất Công thức cấu tạo Ứng dụng BHA (butylated Chống oxy hóa thực phẩm hydroxyanisole) BHT (butylated Chống oxy hóa thực phẩm hydroxytoluene) TBHQ Chống oxy hóa thực phẩm (tert- chế biến từ động vật butylhydroquinone) PG Chống oxy hóa thực phẩm (propyl gallate) Chống oxy hóa thực phẩm OG và mỹ phẩm (octyl gallate) Kháng nấm 2,4,5-Trihydroxy Chống oxy hóa thực phẩm butyrophenone NDGA (nordihydroguaiaretic Chống oxy hóa thực phẩm acid) Ngăn ngừa thực phẩm bị 4-Hexylresorcinol thâm đen 10
1.3.2.3. Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật Một số thực phẩm, đặc biệt là các thực vật, rất giàu chất chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Trong đó, đáng chú ý nhất là các dẫn xuất của phenol và các vitamin:  Vitamin C (axit ascorbic): axit ascorbic bao gồm hai hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa (axit L-ascorbic, axit L-dehydroascorbic) được hấp thụ qua đường tiêu hóa, loại bỏ các gốc tự do anion superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl, oxy nhóm đơn và oxit nitơ phản ứng ở pha nước của tế bào, tái tạo lại vitamin E ở dạng oxy hóa thành dạng khử [32, 33].  Vitamin E (tocopherol): vitamin E bao gồm tám đồng phân, với bốn tocopherol (α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol) và bốn tocotrienols (α-tocotrienol, β-tocotrienol, γ-tocotrienol, δ- tocotrienol). Nó ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid bằng cách liên kết gốc hydro phenolic của nó với các gốc peroxyl, tạo thành các gốc tocopheroxyl không thể tiếp tục phản ứng chuỗi oxy hóa [32].  Vitamin K: hòa tan trong chất béo, cần thiết cho quá trình chuyển đổi glutamate liên kết với protein thành γ-carboxyglutamate. Cấu trúc 1,4- naphthoquinone có tác dụng chống oxy hóa. Hai đồng dạng tự nhiên của vitamin này là K1 và K2 [32].  Flavonoid: Flavonoid là một nhóm các hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol, flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone và flavones. Các nhóm hydroxyl phenolic của flavonoid có cấu trúc vòng, có đặc tính chống oxy hóa hoạt động như các chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide và tạo phức chelat. Chúng cũng kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, giảm các gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử, giảm nitro hóa, tăng mức axit uric và các phân tử trọng lượng phân tử thấp. Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao là catechin, catechin-gallate, quercetin, kaempferol, EGCG từ trà xanh, Genistein trong đậu nành [32, 39].  Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như axit phenolic, lingin, carotenoid,... 1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và tác dụng chống oxy hóa in vitro 1.4.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Phương pháp nghiên cứu ức chế enzym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường tuýp 2 có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy... như các phương pháp khác [37]. 11
Phương pháp nghiên cứu in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của một số hợp chất thiên nhiên dựa trên nguyên tắc:  Enzym α-glucosidase khi gặp liên kết a-D-glucopyranosyl sẽ cắt đứt để giải phóng đường D-glucose.  Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α- D-glucopyranosid (pNPG), dưới tác dụng của enzym α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP).  p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.  Khi sử dụng chất ức chế α-glucosidase sẽ làm cho phản ứng của enzym bị ngừng lại, không tạo ra được sản phẩm D-glucose. α-glucosidase + Hình 1.2. Nguyên tắc khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase. 1.4.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Ngày nay, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính chống oxy hóa, chia làm 2 loại là phương pháp in vitro và phương pháp in vivo. Một số thử nghiệm đánh giá in vitro thường được sử dụng: thu dọn gốc tự do DPPH, dọn gốc tự do superoxid O2•, dọn gốc tự do hydroxyl •OH, ... [19] Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng. Ưu điểm: phổ biến nhất, nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên, phép thử này chí mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử vì DPPH không tổn tại trong cơ thể sống. Dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2• Nguyên tắc: Gốc tự do O2• được hình thành trong quá trình oxy hóa xanthin thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2• tạo thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại 560 12