TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ TRANG
NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật
HÀ NỘI, 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN HOÀNG THỊ TRANG
NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
TS. Cao Bá Cường
HÀ NỘI, 2019
HÀ NỘI, 2019
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn TS. Cao Bá Cường, Trường Đại học“Sư phạm Hà
Nội 2, người đã hướng dẫn, chỉ dạy và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn
thành khoá luận”này.
Em“xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Tổ bộ môn Sinh lý người”và
động vật, Khoa Sinh – KTNN, và các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và
ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho em trong việc thực
hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Mặc dù đã cố gắng rất nhiều nhưng bài khóa luận tốt nghiệp này vẫn còn nhiều
những hạn chế, sai sót. Vì vậy, em rất mong nhận được các ý kiến nhận xét từ thầy
cô và các bạn để bài khoá luận của em hoàn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Hoàng Thị Trang
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Khoá luận “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc
neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy
trong một số môi trường” là nghiên cứu do cá nhân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn
của TS. Cao Bá Cường cùng các thầy, cô trong Viện nghiên cứu khoa học và ứng
dụng. Các kết quả mà tôi trình bày trong khoá luận là trung thực, khách quan, không
trùng lặp với các nghiên cứu trước đây.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Hoàng Thị Trang
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ...............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................................2
NỘI DUNG ................................................................................................................ 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC) ......................................................................3
1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose ....................................................................... 3
1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus ............................................................ 3
1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn ...................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp
thuốc ..........................................................................................................................6
1.2.1.Trên thế giới ....................................................................................................... 6
1.2.2.Tại Việt Nam ...................................................................................................... 6
1.3.Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate .................................................................7
1.3.1. Công thức .......................................................................................................... 7
1.3.2. Tính chất lí hoá .................................................................................................. 7
1.3.3. Dược lý và dược động học ................................................................................ 7
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định ............................................................................... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam ....................8
1.4.1.Trên thế giới ....................................................................................................... 8
1.4.2.Tại Việt Nam ...................................................................................................... 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU10 2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................10
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu .........................................................10
2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................10
2.3.1. Chủng vi khuẩn ............................................................................................... 10
2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................. 10
2.3.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 10
2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................10
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường .... 10
2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc. .......... 11
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC ................................................ 12
2.4.4. Chế tạo VLC hấp thụ neomycin sulfate .......................................................... 12
2.4.4.1. Chuẩn bị bộ đệm .......................................................................................... 12
2.4.4.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate. ........................... 12
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ vào màng
Cellulose vi khuẩn. .................................................................................................... 13
2.4.6. Xử lý thống kê ................................................................................................. 14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 15 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4) ..........15
3.2. Tạo VLC của Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường ..................16
3.3. Thu màng VLC thô từ môi trường .....................................................................16
3.4. Xử lý màng VLC thô trước khi hấp thụ thuốc ...................................................17
3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng ........................................................................18
3.6. Tỷ lệ hấp thu Neomycin sulfate vào màng CVK trong 3 môi trường ...............18
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................24
1. Kết luận .................................................................................................................24
2. Kiến nghị ...............................................................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 25 PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Cs: Cộng sự
Môi trường chuẩn MTC:
Gluconacetobacter xylinus G. xylinus
Môi trường dừa MTD:
Môi trường gạo MTG:
Neomycin sulfate NS:
Phosphate bufered saline PBS:
Vật liệu Cellulose VLC:
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn ........................................................................5 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1] ..............................................7 Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong môi trường PBS (pH = 7,4). .................................................................................................................15 Hình 3.2. VLC được nuôi cấy trong một số môi trường ...........................................16 Hình 3.3. VLC thô có độ dày khác nhau 0,3 cm, 0,5 cm ..........................................17 Hình 3.4. Màng Cellulose sau khi hấp trong NaOH và xả dưới vòi nước 1 ngày ....17 Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của glucose ................................................18 Hình 3.6. VLC tinh khiết hình dạng viên thuốc (đường kính 1,5 cm) ......................18 Hình 3.7. VLC đang hấp thụ neomycin sulfate ở 400C ............................................19 Hình 3.8. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS của các loại VLC.................................................23
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21] ......................................... 3 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10] .......................................... 4 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo .................................................. 4 Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose ............................................... 11 Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 .......................................................... 12 Bảng 3.1. Bảng giá trị đo OD trung bình của dung dịch thuốc NS ở các nồng độ ... 15 Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch thuốc Neomycin Sulfate khi ngâm VLC (n=3) ở các môi trường........................................................................................................... 20 Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK tại thời điểm 2 giờ (n=3) ........ 21
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến“trong các sản phẩm chăm
sóc sức khoẻ, vì có khả năng tái tạo, tính tương thích sinh học, phân huỷ sinh học của chúng.”Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên là vật liệu Cellulose
vi khuẩn (VLC), đã được các nhà khoa học trong và nước ngoài nghiên cứu. Vật liệu
cellulose là một loại vật liệu mới, đã được ứng dụng trong các lĩnh vực như y học,
hoá mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm,..."Theo nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy màng
cellulose vi khuẩn được tạo ra từ các nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền như nước vo gạo, nước dừa già"có thể thực hiện được trên quy mô lớn so với các vật liệu Cellulose
khác thì VLC được tạo ra từ vi khuẩn có độ tinh sạch cao hơn, có khả năng phân huỷ
sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, màng cellulose vi khuẩn còn có
độ bền tinh thể cao, khả năng đàn hồi tốt, khối lượng thấp và kích thước ổn định;
VLC có cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano nên nó có khả năng hút và giữ nước tốt,"có
tính xốp, độ ẩm cao và giải phóng nước kéo"dài. Vì vậy VLC đã được dùng làm vật
liệu hấp thụ và giải phóng thuốc qua nhiều con đường khác nhau như da, đường uống
và ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học…[4], [6], [10].
Ngày nay khi"nền công nghiệp ngày càng phát"triển, dẫn đến môi trường ngày
càng ô nhiễm thì các bệnh liên quan về da cũng xuất hiện ngày càng nhiều, như"các
bệnh viêm da do dị ứng, viêm da do nhiễm"trùng, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá.
Để chữa các"bệnh này thì thường dùng các loại thuốc kháng sinh trong đó có
neomycin"sulfate.
Neomycin sulfate là loại thuốc"kháng sinh nhóm"aminoglycosid, có tác dụng
với phần"lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn
ngoài"da. Chế phẩm của Neomycin sulfate như dưới dạng viên nén, dung dịch uống,
dịch nhỏ mắt, nhỏ tai, mỡ tra mắt, mỡ và kem bôi ngoài da. Tuy nhiên, khi ở dạng
chế phẩm thì khả năng thẩm thấu qua da của thuốc không cao chỉ đạt 45%, thuốc nhanh khô bề mặt; hay ở dạng dung dịch uống thì kém hấp thu qua đường tiêu hoá 97% liều uống được bài tiết ra ngoài dưới dạng không đổi [1].
Để tăng hiệu quả của Neomycin sulfate, làm giảm các nhược điểm của thuốc, khắc phục hạn chế của neomycin sulfate thì giải pháp cần đặt ra là"sử dụng vật liệu có khả năng giữ ẩm vết thương"và cản trở vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương,… Vật liệu Cellulose (VLC) có tiềm năng như"hệ thống vận chuyển và phân phối
thuốc"do cấu trúc siêu mảnh và kích thước nano của nó vì vậy hệ mạng lưới cấu trúc
1
CVK được nạp Neomycin sunlfate có thể tạo hệ trị liệu phóng thích kéo dài để giảm
thiểu những tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc Neomycin sunlfate.
Từ những nghiên cứu về CVK, và đặc điểm của neomycin sulfate trong điều
trị bệnh về da, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ
thuốc Neomycin Sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus
nuôi cấy trong một số môi trường ”
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Neomycin sulfate của màng VLC lên men từ một số môi trường ( môi trường chuẩn, môi trường"nước vo gạo, môi trường nước
dừa"già), để nâng cao hiệu quả chữa các bệnh về da do nhiễm khuẩn ở người của
thuốc neomycin sulfate. Tìm ra được loại vật liệu cellulose lên men từ ba loại môi
trường thì môi trường nào hấp thu thuốc cao hơn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng và xử lý màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn
(MTC), môi trường nước vo gạo (MTG), môi trường nước dừa già (MTD).
- Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK thu từ một số môi trường.
- Khảo sát so sánh sự hấp thụ thuốc neomycin sulfate của VLC thu từ 3 môi
trường.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Việc nghiên cứu và ứng dụng màng cellulose vi khuẩn để làm giảm tác dụng
không mong muốn của thuốc neomycin sulfate sẽ mở ra hướng đi mới [5]. Việc hạn
chế được nhược điểm của neomycin sẽ"mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho nhiều
thuốc khác nhau, từ đó giúp nền y học phát triển"hơn.
Từ quá"trình thực hiện nghiên cứu có thể phát hiện ra ưu và nhược điểm của VLC, từ đó sẽ tìm được cách phát huy những ưu điểm và hạn chế"được nhược điểm
của màng Cellulose vi khuẩn.
Tìm ra"được thời gian hấp thu thuốc Neomycin sulfate cao hơn trong ba"loại
VLC.
Ý nghĩa thực tiễn
Khắc"phục những nhược điểm của Neomycin sulfate như hấp thu qua da kém, bề mặt khô"nhanh,… nhờ vào việc sử dụng VLC lên men từ một số môi trường nghiên
cứu, được dùng làm vật liệu nạp thuốc Neomycin sulfate. Có thể áp dụng"kết quả nghiên cứu"vào thực tiễn.
2
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vật liệu Cellulose vi khuẩn (VLC)
1.1.1. Vi khuẩn sinh ra màng cellulose
VLC là sản phẩm thải của vi khuẩn có khả năng sinh màng thải ra trên bề mặt
môi trường"nuôi"cấy"như"những"loài"thuộc"chi"Acetobacter,"Achromobacter, Gluconacetobarter, Rhizobium, trong đó có"chi Gluconacetobacter xylinus tạo cellulose hiệu quả nhất. Các giống vi khuẩn trong chi Acetobacter trước đây được dùng để lên men thu màng Cellulose vi khuẩn đều được chuyển sang chi
Gluconacetobacter dựa trên nghiên cứu trình tự gen 16S rARN và đặc tính sinh màng
của nó [6].
Giống vi khuẩn G. xylinus sử dụng được mua giống từ Nhật Bản.
1.1.2. Một số môi trường nuôi cấy G. xylinus
Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, để nuôi cấy
được G. xylinus cần cung cấp các nhân tố sinh trưởng, các vitamin cho sự phát triển
của chúng [7]. Môi trường nuôi cấy G. xylinus là các môi trường tổng hợp và bán
tổng hợp như môi trường cao nấm men (MTC), môi trường nước dừa già và môi
trường nước vo gạo. Các môi trường trên là những môi trường có đầy đủ chất hữu cơ
cần thiết như cacbon hiđrat, protêin, lipit,…các chất vô cơ chứa các nguyên tố vi
lượng như Zn, Mn, Fe, Cu, Mn, P, S,… các chất hữu cơ khác như axit amin,
vitamin,… thích hợp cho nuôi cấy G.xylinus. Thành phần dinh dưỡng của 3 loại môi
trường trên được trình bày ở Bảng 1.1, 1.2, 1.3.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men [21]
Thành phần Hàm lượng trong 100 g
Prôtêin 24 g
Cacbohyđrat 20 g
Vitamin B12 0,5 µg
Các"nguyên tố vi lượng" Fe (4 mg), Mg (180 mg), Ca (67 mg), Kali (2,1 mg)
Đường 1,6 g
Thành phần dinh dưỡng có trong cao nấm men thích hợp cho sự nuôi cấy vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus.
Nhu “cầu sử dụng đường của G. xylinus là rất lớn giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo màng, trong khi đó môi trường nước dừa già có hàm lượng đường khá lớn thích hợp cho”nuôi cấy G. xylinus [9].
3
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già [10]
Thành phần Hàm lượng
94,99% Nước
7,2% Prôtêin
0,2% Chất béo
3,17% Cacbohyđrat
2,16% Đường
0,032 (mg/100 g) Vitamin B6
7,68 mg/l Vitamin C
24 mg/100 g Canxi
25 mg/100 g, 0,29 mg/100 g Magie, Sắt
0,29 mg/100 g; 250 mg/100 g Phot pho, Kali
Đồng, Mangan, Selen 0,04 mg/100 g; 0,142 mg/100 g; 1 mg/100 g
Thành phần dinh dưỡng có trong nước dừa già có chứa nhiều khoáng chất, các
chất hữu cơ thiết yếu cần cho chu trình sống của G. xylinus để tạo vật liệu Cellulose
vi khuẩn.
Ngoài ra, nước vo gạo cũng được dùng để nuôi cấy G. xylinus vì trong nước
vo gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, đường, nhiều loại vitamin nhóm
B, acid amin, và khoáng chất phù hợp với sự nuôi cấy G. xylinus. Thành phần các
chất dinh dưỡng có trong nước vo gạo được trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần Hàm lượng
Protein 15,7%
Đường 2%
Sắt 7% -8%
Kẽm 12% - 13%
Acid amin Leucine, Valine, Lysine
Vitamin nhóm B (B1,B2,B5,B6) 30% -60%
Trong vòng ba tiếng sau khi vo, nước vo gạo phải được sử dụng, không sử dụng nước đã để quá lâu có mùi chua, vì các chất dinh dưỡng có trong nước gạo đã
mất, dẫn đến hiệu quả nuôi vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus kém.
4
1.1.3. Cấu trúc, một tính chất của màng Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mảnh, đường kính sơi nhỏ hơn đường kính của cellulose thực vật, và các sợi nhân tạo khác được tổng hợp hoá học. Cellulose vi
khuẩn là một polyme không phân nhánh gồm các gốc glucopyranose nối với nhau
bằng liên kết β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản đã cho thấy cấu trúc của Cellulose vi
khuẩn giống cấu trúc cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc cao phân tử và một số đặc tính [14]. Theo AJ. Brown (1886) Cellulose vi khuẩn được cấu tạo từ các sợi sơ cấp (subfibril) là những sợi mảnh nhất đường kính 1,5 nm, có nguồn gốc tự nhiên, các sợi này lại kết hợp với nhau thành các vi sợi (microfibril),
các vi sợi tập hợp thành bó (bundle), cuối cùng tạo thành các dải (rinbon), mỗi dải
dài khoảng 100 nm, rộng 3 – 8 nm [3,9].
Hình 1.1. Cấu trúc Cellulose vi khuẩn
Một số tính chất của Cellulose vi khuẩn như: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ
học, độ bền hoá học cao, có khả năng giữ nước, giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới
cellulose, có thể bị thủy phân bởi enzyme, có thể tái chế và dễ dàng bị một số nhóm vi
sinh vật phân huỷ, thân thiện với môi trường, an toàn sinh học... Màng Cellulose vi
khuẩn đã được công nhận là an toàn bởi FAD (Park et al. 2009; Ullahet al. 2016a), và nó đã được sử dụng làm phụ gia thực phẩm (Khan etal. 2007) [20]. Ngoài ra, màng
cellulose vi khuẩn còn được sử dụng để làm mặt nạ dưỡng da,..."từ những nghiên cứu
trên đã xác nhận màng Cellulose vi khuẩn là an toàn và phù hợp để sử dụng trong các công thức thuốc, và được sử dụng như để phân phối thuốc"là nguyên liệu cho y sinh và dược phẩm [18]. Trong y học, VLC"thu được từ điều kiện nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo"để điều trị vết thương lớn do bỏng, làm mạch máu nhân tạo, sử dụng trong nha khoa. Ở Philipines, màng Cellulose vi khuẩn được dùng nhiều trong thực phẩm, bao gồm BC gel, và được tiêu thụ như một món tráng miệng truyền thống ở đây [15]. Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng VLC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy VLC giúp vết thương nhanh lành và làm giảm sự nhiễm trùng vết thương
5
do các yếu tố ngoài môi trường gây ra [7]. Ngoài ra, VLC còn được sử dụng như vật
liệu thay thế gạc thông thường trong băng bó vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [10].
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu
nạp thuốc
1.2.1. Trên thế giới
Celllose"vi khuẩn có tính chất hút nước và giữ nước"cao, độ tinh khiết cao, tính an toàn cao và"cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano, nên nó được sử dụng để vận chuyển và phân phối thuốc"đến vết thương.
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng nạp thuốc của
màng Cellulose vi khuẩn, như nghiên cứu của tác giả Hanif Ullah và Cs (2017) [19];
đã nghiên cứu và chế tạo vỏ nang bao thuốc từ màng Cellulose vi khuẩn thay cho vỏ
nang bao thuốc thông thường bằng gelatin; nghiên cứu này chỉ ra VLC"có khả năng
cản khuẩn để tránh sự nhiễm trùng từ bên ngoài, làm giảm đau, giúp vết thương mau
lành, giảm sự hình thành"sẹo, giúp cho việc tháo ra, kiểm tra vết thương một cách dễ
dàng ( Cazaja et al (2006)). Ngoài ra, VLC không làm mất độ ẩm của da, tránh tình
trạng da bị khô đối với những vết thương lớn, rộng, nhiễm trùng trên da.
Muhammad Mustafa Abern và Cs (2014) đã có"nghiên cứu đánh giá về hệ
thống phân phối thuốc dựa trên màng cellulose vi khuẩn, kết quả của nghiên cứu cho
thấy VLC có tính linh hoạt và tiềm năng của nó đối với điều trị tại"chỗ, đúng vị trí bị
bệnh, một trong những ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn trong dược phẩm và y
sinh đó là nó được áp dụng chủ yếu cho các công thức qua da để cải thiện kết quả lâm
sàng [17].
Các"đánh giá của các tác giả trên cho thấy tính khả thi và lợi ích tiềm năng lớn
của VLC trong việc phát triển hệ thống phân phối thuốc"của nhiều loại thuốc khác nhau.
1.2.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam tác giả Đinh Thị Kim Nhung và Cs đã tiến hành nuôi cấy màng Cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trong điều trị bỏng trên thỏ. Kết quả nghiên cứu cho thấy màng Cellulose vi khuẩn dùng để băng vết thương có tỉ lệ lành vết thương cao hơn so với dùng gạc có tẩm các chất có hoạt tính tương ứng, màng CVK làm giảm hiện tượng nhiễm trùng, hoại tử vết thương, so với việc bôi trực tiếp kem nghệ và tinh
dầu mù u lên vết thương [6]. Tác giả Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum” đã tạo ra được màng trị bỏng từ
6
màng Cellulose tinh chế có tẩm tinh dầu mù u, kháng khuẩn tốt hơn so với gạc thông
thường, khả năng lành vết thương nhanh hơn.
Kết quả"nghiên cứu của các tác giả trên cho thấy tiềm năng của VLC trong việc
sử dụng màng Cellulose vi khuẩn như hệ thống vận chuyển và phân"phối thuốc. Đây
cũng là một hướng trong nghiên cứu sử dụng VLC để hấp thu thuốc neomycin sulfate
nhằm hạn chế những tác dụng phụ không mong muốn của thuốc đối với cơ thể.
1.3. Tổng quan về thuốc Neomycin sulfate
Neomycin sunlfate"là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside. Neomycin sulfate có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương
gây nên các bệnh nhiễm khuẩn"ngoài da.
1.3.1. Công thức Công thức phân tử:C23H46N6O13.xH2SO4. Khối lượng phân tử: 712,72 g/mol
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Neomycin sulfate [1]
1.3.2. Tính chất lí hoá
Ở dạng"tinh khiết, neomycin sulfate có màu trắng hoặc trắng ngà, hút ẩm, tan
dễ trong"nước, khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton. Quang"phổ hấp
thụ cực đại của neomycin sulfate ở bước sóng Abs"277 nm. Các chế phẩm của thuốc ở dạng viên nén, dung dịch, kem bôi da, để tiến hành"định tính neomycin sulfate trong các chế"phẩm dùng phương pháp sắc kí lớp mỏng [1].
1.3.3. Dược lý và dược động học
Neomycin sulfate là thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có"tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các bệnh nhiễm khuẩn
ngoài da. Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin như: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Neomycin không có tác dụng với
7
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus bao gồm cả Streptococcus pneumonia hoặc
Streptococcus tan"máu.
* Cơ chế tác dụng: Neomycin là chất ưa nước, tan trong nước, thuộc nhóm
kháng sinh aminoglycoside. Cơ chế tác dụng là ức chế quá trình tổng hợp protein của
vi khuẩn, bằng cách liên kết với tiểu đơn vị 30S của Ribosome của vi khuẩn, làm đọc
sai thông tin của t-ARN, làm cho vi khuẩn không thể tổng hợp được các protein quan trọng đối với sự phát triển của nó. Ngoài ra, còn làm tách các polysomes thành các monosome phi chức năng [1,13].
* Dược động học: Neomycin"được hấp thu kém qua đường tiêu hoá, khảng
97% liều uống được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân. Sau khi uống 3 g, nồng
độ huyết thanh đạt được 4 microgam/ml và khi thụt sự hấp thu cũng tương tự. Hấp
thu thuốc có thể tăng lên khi niêm mạc bị viêm hoặc bị tổn thương. Khi thuốc đã được
hấp thu, nó sẽ giải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt"tính. Thời gian bán thải của
Neomycin khoảng 2-3 giờ [2].
1.3.4. Chỉ định và chống chỉ định
Neomycin sulfate được"dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai
và mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm với neomycin sulfate. Thuốc còn
được chỉ định để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật và làm giảm vi khuẩn
NH3 trong ruột khi bị hôn mê"gan. Không được sử dụng neomycin sulfate qua đường tiêm hoặc toàn thân, tránh"sử dụng thuốc quá lâu tại một chỗ vì với liều lượng cao vì
thuốc có thể gây khô da, khiến da dễ mẫn"cảm, và gây ra hiện tượng kháng chéo với
các thuốc thuộc nhóm kháng sinh aminoglycosid khác [1-2].
1.4. Tình hình nghiên cứu Neomycin sulfate trên thế giới và Việt Nam 1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về Neomycin sulfate như: Amita H. Patel, và Riddhi M. Dave, có công trình xác định và đánh giá sự giải phóng bền
vững của Neomycin sulfate trong Situophthalmic gel, thuốc có khả năng kháng
khuẩn tốt trong hệ thống gelling tại chỗ [12]. Ngoài ra"nghiên cứu Blanchard C. (2015) [16] cho rằng khi có sự phối hợp giữa neomycin và sulfate thì ít gây dị ứng
cho da hơn"khi chỉ có neomycin đơn thuần.
Bên cạnh đó, Anjali, D. V. Gowda, Gowrav M. P., Atul Srivastava and Riyaz Ali M. Osmani (2016), đã nghiên cứu về các hạt nano Chitosan chứa Neomycin
sulfate để chữa các vết thương, chỉ ra rằng các polyme"tự nhiên được sử dụng làm
vật"liệu để phân phối thuốc và điều trị các bệnh khác nhau. Sự kết hợp giữa Neomycin sulfate và các sợi nano trong cấu trúc của polyme tự nhiên đã cải thiện được nhược
8
điểm của Neomycin sulfate, làm vết thương nhanh lành so với việc chỉ sử dụng kem
neomycin đơn thuần [13].
1.4.2. Tại Việt Nam
Neomycin sulfate là một loại thuốc thiết yếu có trong “Danh mục thuốc tân
dược thiết yếu lần thứ” được bộ y tế chỉnh sửa và ban hành năm 2009 [2]. Chế phẩm
của neomycin như dạng viên nén, dạng kem bôi da, thuốc nhỏ mắt.
Tại Việt Nam"việc nghiên cứu và màng Cellulose vi khuẩn làm vật liệu nạp thuốc và vận chuyển thuốc đang còn khá"mới. Các nghiên cứu về màng Cellulose vi khuẩn hầu như chỉ dừng lại ở điều kiện phòng thí nghiệm, việc sản xuất màng CVK
với quy mô lớn chưa nhiều.
Trong"những năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu về màng cellulose vi
khuẩn"làm vật liệu mang thuốc, đã có nghiên cứu về thuốc Neomycin sulfate nhưng
cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu chưa ứng dụng được vào trong thực tế.
9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu:
"Khả năng hấp thụ thuốc"Neomycin sulfate của VLC (tạo ra từ các môi trường
nuôi cấy khác nhau).
2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu
* Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở phòng thí nghiệm.
* Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng
dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Gluconacetobarter xylinus lên men tạo vật liệu Cellulose, được
mua tại Nhật Bản
2.3.2. Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: nước dừa già, nước vo gạo, nước cất hai lần, cao nấm men.
Hóa chất:
- Thuốc Neomycin sulfate dạng tinh khiết.
- Vật liệu Cellulose (99% là nước) được thu nhận từ việc nuôi cấy
gluconacetobacter trong các môi trường nuôi cấy khác nhau.
- Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali
đihidrophotphat, axit clohidric,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.3.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản).
- Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ)
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu,…
2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường Bước 1: Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy G. xylinus như Bảng 2.1 MT1: Môi trường chuẩn (MTC); MT2: môi trường nước già (MTD); MT3: môi trường nước vo gạo (MTG).
10
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu Cellulose
Môi trường Thành phần
Glucose MTD 30 g MTG 30 g MTC 20 g
Pepton 10 g 10 g 5 g
Diamoni photphat khan 2,7 g
Amoni sulfat 0,5 g 0,5 g
Cao nấm men 5 g
Diamoni photphat 0,3 g 0,3 g
Acid citric 1,5 g
Nước dừa già 1000 ml
Nước vo gạo 1000 ml
Nước cất 2 lần 1000 ml
Môi trường ở sau khi pha được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút. Sau khi
hấp môi trường xong, đưa môi trường vào buồng cấy và khử trùng bằng tia UV trong
15 phút. Bước 2: Đưa các môi trường vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1130C trong 15 phút. Bước 3: Vệ sinh buồng cấy bằng cồn 700, sau đó tiến hành khử trùng buồng cấy bằng tia UV trong 30 phút.
Bước 4: Lấy"môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút, để nguội"môi
trường.
Bước 5: Thêm 20-25% dịch giống, lắc đều tay cho dịch giống phân bố đều.
Bước 6: Dùng"gạc vô trùng bịt kín miệng bình, nuôi cấy tĩnh trong thời"gian 5 -14 ngày ở nhiệt độ 260C. Bước 7: Thu"màng CVK thô, rửa sạch dưới vòi"nước.
2.4.2. Phương pháp xử lý màng Cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc.
Mục đích: Đảm bảo không còn tồn dư các chất hoá học của môi trường nuôi
cấy trong VLC,"phá huỷ thành tế bào và các độc tố của vi"khuẩn.
Phương pháp: Màng Cellulose vi khuẩn thô sau khi thu được từ một số môi trường, màng có
màu vàng, ép vật liệu loại bỏ môi trường.
Trong vật liệu Cellulose thô có chứa nhiều vi khuẩn, nên cần hấp khử trùng
màng trong NaOH nóng 3% ở 113°C trong 15 phút, làm cho thành tế bào của vi khuẩn bị vỡ và giải phóng độc tố của vi khuẩn.
11
Màng Cellulose vi khuẩn sau khi ngâm màng trong NaOH nóng, lấy màng ra
và xả dưới vòi nước chảy cho đến khi màng chuyển thành màu trắng trong. Kiểm tra pH bề mặt của vật liệu CVK bằng quỳ tím, bề mặt vật liệu cần đạt pH trung tính thì
thu được VLC tinh khiết.
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của VLC
Mục đích: Đảm bảo VLC không còn các tạp chất có thể gây độc. Tạp chất
được khảo sát là D – glucose.
Tìm sự có mặt của glucose trong màng Cellulose tinh chế
Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của D – glucose bằng thuốc thử Fehling mới pha,
kết quả nếu xuất hiện kết tủa nâu đỏ chứng tỏ VLC còn D – glucose.
Tiến hành:
Mẫu thử: Màng Cellulose vi khuẩn được tạo ra từ một số môi trường đã được
xử lý bằng hoá học
Mẫu"đối chứng: là nước cất và dung dịch"D – glucose.
Nhỏ vào ống nghiệm đựng mẫu thử 1 ml thuốc thử Fehling rồi ngâm trong cốc
nước nóng.
Quan sát kết quả.
Vật liệu Cellulose vi khuẩn dùng để hấp thụ thuốc neomycin sulfate phải"đạt
được những tính chất sau: mềm mại, độ đàn hồi tốt, mỏng, che phủ tốt, bám tốt trên
bề mặt da, cản khuẩn"tốt. VLC"phải có độ ẩm thích hợp, hút nước và dịch mô tốt,
và pH phải trong khoảng"trung tính.
2.4.4. Chế tạo VLC hấp thụ neomycin sulfate
2.4.4.1. Chuẩn bị bộ đệm Chuẩn bị"môi trường đệm Photphat buffered saline (PBS) [7] với thành phần và cách
pha được trình bày trong"Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trường đệm PBS với pH = 7,4
Hoá chất Cách pha
Thành phần Khối lượng
NaCl 0,8 g
KCl 0,2 g
1,44 g Na2HPO4.12H2O
Cân và cho hoá chất vào cốc đong. Thên nước cất đến mức 800 ml. Điều chỉnh pH tới 7,4 bằng HCl. Bổ sung nước tới 1000 ml. 0,22 g Na2HPO4
2.4.4.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate.
12
Phương pháp xây dựng đường chuẩn:"Dùng máy quét quang phổ UV-2450,
để đo mật độ quang của neomycin sulfate, ở các nồng độ khác nhau tối thiểu là 6 nồng"độ: 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,3 mg /ml.
Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis"để ghi
mật độ quang hấp thụ của thuốc Neomycin"sulfate.
Chuẩn bị 6 mẫu có chứa neomycin sulfate với các nồng độ khác nhau như trên Sử dụng dung dịch đệm PBS (pH =7,4) làm dung môi. Đo"mật độ quang phổ của các mẫu dung dịch ở bước sóng Abs"277 nm. Tiến"hành đo 3 lần lấy giá trị OD trung bình dựng đường"chuẩn
Tiến hành dựng phương trình đường chuẩn bằng Microsoft Excel 2010.
2.4.5.Phương pháp xác định lượng thuốc Neomycin sulfate hấp thụ vào màng Cellulose vi khuẩn.
Vật liệu Cellulose nạp thuốc được tạo ra từ ba môi trường: MTC, MTD, MTG.
Sử dụng VLC có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm để nạp Neomycin sulfate.
Màng Cellulose vi khuẩn ướt sau khi tinh chế được loại bỏ 60% nước, ngâm
ngập trong"100 ml dung dịch chứa thuốc Neomycin"sulfate, sử"dụng dung môi là dung dịch đệm PBS (pH = 7,4), rung động ở 180 vòng/phút và"400C trong 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ, đảm bảo VLC nạp thuốc tối đa. Lấy VLC đã nạp thuốc cho vào bao nilon,
hàn"bao nilon và bảo quản trong ngăn mát tủ"lạnh.
Chuẩn bị 6 bình tam giác, mỗi bình chứa 100 ml dung dịch Neomycin sulfate,
nồng độ 2mg/ml (dung môi là dung dịch đệm PBS).
Bình 1,2,3: Cho màng CVK có độ dày 0,3 cm
Bình 3,4,5: Cho màng CVK có độ dày 0,5 cm
Hấp thụ thuốc Neomycin của VLC ở điều kiện rung động 180 vòng/phút ở
400C.
Sau 1 giờ, 1,5h, 2 giờ, lấy 3 µl dung dịch trong mỗi bình thí nghiệm pha loãng
bằng dung dịch đệm PBS với tỷ lệ hợp lý (dùng tỷ lệ như đã xây dựng đường chuẩn),
dùng máy UV – Vis để“đo quang phổ xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng cho đến khi giá trị OD không đổi, lấy giá trị OD thay vào phương trình”đường chuẩn, tính được khối lượng thuốc hấp thụ vào màng.“Tiến hành thực hiện thí nghiệm 3 lần lấy kết quả OD trung bình để tính toán lượng thuốc neomycin sulfate đã được VLC”hấp thụ, ta“lấy giá trị OD trung bình đo được thay vào phương trình đường”chuẩn.
Lượng“thuốc hấp thụ vào các VLC được tính theo công”thức [11]:
mht = m1 – m2 (mg) (1)
Trong đó:
13
mht:“Khối lượng thuốc Neomycin sulfate đã hấp thụ vào màng”
m1:“Khối lượng thuốc Neomycin sulfate ban đầu trong dung dịch” m2:“Khối lượng thuốc Neomycin sulfate sau khi màng hấp thu thuốc”
Hiệu suất thuốc nạp vào màng được tính theo công thức:
EE(%) = mht /m0 × 100% (2)
Trong đó: EE (%):“Hiệu quả hấp thu thuốc neomycin sulfate của màng CVK” mht (mg/cm3):“Khối lượng thuốc hấp thu trong 1 đơn vị thể tích màng” m0 (mg/cm3): Khối lượng thuốc có trong một đơn vị thể tích dung dịch ban đầu 2.4.6. Xử lý thống kê
Xử“lý số liệu thông qua phần mềm kiểm định giả thuyết t – Test: Two Sample
Assuming Unequal Variances, Excel”2010.
Các“kết quả nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ”lệch
chuẩn. Những“khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn”0,05,
hoặc | t Stat | > t Critical two-tail.
14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong PBS (pH = 7,4)
Sau khi tiến hành đo mật đo mật độ quang hấp thụ của neomycin sulfate ở Abs
277 nm bằng máy đo UV – 2450 ( Shimadzu – Nhật Bản ) tại Phòng thí nghiệm Viện
NCKH & UD Trường ĐHSP Hà Nội 2, lấy kết quả trung bình của 3 lần đo, dựng đường chuẩn của Neomycin sulfate bằng phần mền Excel.
Kết quả đo OD của dung dịch thuốc neomycin sulfste ở các nồng độ khác
nhau, được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Bảng giá trị đo OD trung bình của dung dịch thuốc NS ở các nồng độ
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Nồng độ
(mg/ml)
0,0049 0,013 0,021 0,029 0,037 0,044 Giá trị
OD(trung ±0,0001 ±0,001 ±0,0015 ±0,001 ±0,002 ±0,012 bình)
Từ giá trị OD trung bình thu được ở bảng 3.1 tiến hành dựng phương trình
đường chuẩn của neomycin sulfate bằng phần mền Exel 2010, cho kết quả phương
trình đường chuẩn của neomycin sulfate hình 3.1 là:
Phương trình đường chuẩn: y = 0,1574x – 0,0027 (R2 = 0,9995) Trong đó x: nồng độ neomycin sulfate (mg/ml)
y: mật độ hấp thụ thuốc tại OD 277 nm R2 hệ số tương quan bình phương
OD277nm
0.05
0.04
y = 0.1574x - 0.0027 R² = 0.9995
0.03
OD277nm
0.02
Linear (OD277nm)
0.01
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
m n 7 7 2 D O ụ h t p ấ h ộ đ t ậ M
Nồng độ thuốc Neomycin sulfate (mg/ml)
Hình 3.1. Phương trình đường chuẩn của neomycin sulfate trong môi trường PBS (pH = 7,4).
15
3.2. Tạo VLC của Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường
Vi khuẩn G. xylinus thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng sau khi nó được bổ sung“vào các môi trường, nó sẽ lấy các chất dinh dưỡng có trong môi trường để tổng
hợp nên các”chất hữu cơ, và sản phẩm thải của nó là màng Cellulose nổi lên trên bề
mặt môi trường nuôi cấy. Trong“ngày nuôi cấy đầu tiên G. xylinus sẽ thích nghi với
môi trường nuôi cấy, tích luỹ chất hữu cơ, năng lượng để“chuẩn bị cho các giai đoạn tiếp”theo, axit”đã được hình thành nhưng với một lượng ít nên làm“thay đổi pH của môi”trường. Ngày“thứ hai sau khi nuôi màng Cellulose vi khuẩn bắt đầu được hình thành trên bề mặt môi trường nhưng với độ dày còn”mỏng. Sau 5 -14 ngày nuôi cấy
nhất định, sẽ thu được màng CVK có độ dày màng khác nhau, sau khoảng 5 ngày
nuôi cấy“màng có độ dày 0,3 cm, màng có độ dày 0,5 cm”sau 7 ngày.
Khi“môi trường nuôi cấy cạn kiệt chất dinh dưỡng”màng sẽ không dày thêm
mà“chỉ dừng lại ở một độ dày màng nhất định”khoảng 3 cm. Khi độ dày màng đạt
đến kích thước cần nghiên cứu sẽ tiến hành thu màng Cellulose vi khuẩn thô, và tiến
hành xử lý màng. Quá trình tạo VLC được thể hiện trong hình 3.2.
A B C
Hình 3.2. VLC được nuôi cấy trong một số môi trường
A: VLC nuôi cấy trong môi trường chuẩn
B: VLC nuôi cấy trong môi trường nước dừa già C: VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo
3.3. Thu màng VLC thô từ môi trường
16
Quan sát,“theo dõi quá trình tạo”VLC của G. xylinus khi độ dày màng đạt đến
độ dày nghiên cứu là 0,3 cm (trong khoảng 5 ngày nuôi cấy) và 0,5 cm (trong khoảng 7 ngày), thì thu VLC thô trong phòng sạch. Hình ảnh VLC thô được thể hiện ở hình
3.3.
Hình 3.3. VLC thô có độ dày khác nhau ( 0,3 cm, 0,5 cm)
3.4. Xử lý màng VLC thô trước khi hấp thụ thuốc
Sau khi thu VLC thô sẽ tiến hành xử lý bằng NaOH 3% ( pha 2,5 g NaOH
trong 1000 ml nước cất 2 lần). Sau đó cho màng ngâm ngập trong NaOH và hấp khử trùng ở 1130C trong 15 phút. Màng sau khi hấp được xả dưới vòi nước cho đến khi trắng.
Hình 3.4. VLC sau khi hấp trong NaOH và xả dưới vòi nước 1 ngày VLC sau khi xử lý bằng NaOH 3% và xả dưới vòi nước từ 2-3 ngày, rửa sạch màng dưới vòi nước. Kiểm tra pH của màng nếu pH màng chưa đạt đến độ pH trung
17
tính thì ngâm màng HCl 3% trong vòng 2 ngày, sau đó xả màng dưới vòi nước“để
trung hoà hết HCl, thu được VLC tinh chế có màu trắng trong, không còn tạp chất, mất mùi chua, có độ đàn hồi”tốt. VLC sau khi tinh chế được sử dụng làm vật liệu nạp
thuốc Neomycin sulfate.
3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng
VLC tinh chế sẽ được tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của vật liệu. Kết quả:“Không có kết tủa xuất hiện ở mẫu thử”có chứa vật liệu Cellulose,
chứng tỏ màng không còn glucose, kết quả được thể hiện ở hình 3.5.
Vật liệu Cellulose tinh sạch thu được sau quá trình xử lý hoá học và kiểm tra
độ tinh khiết của màng có màu trắng trong, không còn tạp chất, độ đàn hồi tốt. Hình
ảnh VLC tinh khiết được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sự hiện Hình 3.6. VLC tinh khiết hình dạng
diện của glucose viên thuốc (đường kính 1,5 cm)
3.6. Tỷ lệ hấp thu Neomycin sulfate vào màng CVK trong 3 môi trường
VLC tinh khiết thu được sau quá trình xử lý hoá học và kiêmt tra sự có mặt của glucose, trước khi dùng VLC để nạp thuốc neomycin sulfate thì tiến hành đục màng thành hình dạng viên thuốc ( đường kính 1,5 cm ) ở cả 2 kích thước 0,3 cm và 0,5 cm. Loại bỏ 60% nước của VLC trước khi cho vào bình dung dịch thuốc, sau đó cho 5 màng VLC đã loại nước vào bình tam giác chứa 100ml dung dịch đệm PBS chứa neomycin sulfate có nồng độ 2 mg/ml, rung động ở 180 vòng/phút ở nhiệt độ
40°C, trong 3 khoảng thời gian 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ. Với đặc tính của VLC là khả năng hút nước và giữ nước tốt nhờ vào cấu trúc siêu mảnh cỡ nano của nó, nên khi
18
đưa màng CVK đã loại 60% nước vào bình để nạp thuốc thì màng cellulose sẽ nạp
thuốc tốt hơn so với màng chưa loại nước. Do“có sự chênh lệch nồng độ thuốc giữa bên ngoài màng và bên trong màng, khi đó nồng độ thuốc bên ngoài cao hơn bên
trong màng dẫn đến thuốc đi ngược chiều gradient nồng”độ. Màng CVK đang được
hấp thụ thuốc ở 40°C được thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Màng CVK đang hấp thụ neomycin sulfate ở 40°C
Sau khi VLC“hấp thụ thuốc được 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ, thì bắt đầu lấy lấy dung
dịch thuốc ra đo quang phổ bằng máy đo UV – 2450 để đo lượng thuốc hấp thụ vào
màng ở các thời điểm”1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ, ở nhiệt độ 40°C, chế độ lắc 180 vòng/phút. Rút 3 µl dung dịch trong mỗi bình pha loãng bằng dung dịch đệm PBS (bỏ 1
µl dung dịch thuốc thì thêm vào 1 µl dung dịch đệm). Để“đảm bảo kết quả khách quan thì thí nghiệm phải được lặp lại 3 lần lấy giá trị OD trung bình, kết quả đo quang phổ màng CVK sau khi hấp thụ thuốc được trình bày trong”Bảng 3.2.
19
Bảng 3.2. Giá trị OD của dung dịch Neomycin sulfate khi ngâm VLC (n= 3) ở các môi trường
Màng CVK Độ dày Giá trị OD trung bình trong các thời gian
màng 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ
0,0293 ± 0,0001 0,0263 ± 0,0002 0,0261 ± 0,0001 Màng môi 0,3 cm
trường
chuẩn
0.0305 ± 0,001 0,0296 ± 0.0001 0,0295 ± 0.0002 0,5 cm
0,0342 ± 0,0002 0,0316 ± 0,0004 0,0312 ± 0,0002 Màng dừa 0,3 cm
0,0396 ± 0,0032 0,0372 ± 0,0001 0,037 ± 0,00015 0,5 cm
0,0372 ±0,0001 0,0366 ± 0,00015 0,0363 ± 0,0001 Màng gạo 0,3 cm
0,0388 ± 0,0417 ± 0,0002 0,039 ± 0,0002 0,5 cm
0,00014
Từ giá trị OD thu được thể hiện trong bảng 3.2, kết“quả đo OD cho thấy sau khi ngâm VLC nạp thuốc Neomycin sulfate, có sự giảm dần của giá trị OD trung bình
và sau 2 giờ thì ở cả hai độ dày màng giá trị OD đo được gần như không giảm ở cả
ba loại”màng. Chứng tỏ tại 2 giờ thì VLC hấp thu thuốc là cao nhất, tức lượng thuốc
hấp thu vào màng đạt cực đại.
So“sánh giá trị OD trung bình ở 2 khoảng thời gian 1,5 giờ và 2 giờ ở màng
0,3 cm của”màng môi trường chuẩn, màng gạo, màng dừa bằng“hàm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, kết quả không có sự khác biệt về khả năng hấp thụ thuốc của cả ba loại màng”ở 2 khoảng thời gian này.
Đối với màng chuẩn 0,3 cm , do | t Stat | = 2,214 < t Critical two-tail = 3,182; giá trị OD trung bình của màng dừa 0,3 cm có giá trị | t Stat | = 1,197 < t Critical
two-tail = 3,182; Ở màng gạo giá trị | t Stat | = 2,253 < t Critical two-tail = 3,182, nên“giá trị OD trung bình ở 1,5 giờ và 2 giờ là giống nhau ở cả 3 loại màng, nên
không có ý nghĩa”thống kê.
20
Tương tự, khi tiến hành so sánh giá trị OD trung bình của 1,5 giờ và 2 giờ ở
màng 0,5 cm thì thu được kết quả sau: ở màng chuẩn 0,5 cm có giá trị | t Stat | = 1,052 < t Critical two-tail = 3,182, giá trị OD của màng dừa | t Stat | = 1,767 < t Critical
two-tail = 3,182, giá trị OD của màng gạo 0,5 cm | t Stat | = 1,581 < t Critical two-
tail = 3,182. Như“vậy giá trị OD trung bình ở 2 khoảng thời gian khác nhau là giống
nhau nên không có ý nghĩa”thống kê.
Kết luận giá trị OD (y) trung bình ở ba loại màng không có sự khác nhau khi cho màng CVK hấp thụ thuốc ở 1,5 giờ và 2 giờ ở cả 2 độ dày 0,3 cm, và 0,5 cm. Chứng tỏ thời gian hấp thu thuốc cực đại ở cả 3 loại màng là 2 giờ, rung động 180
vòng/phút, nhiệt độ 40°C.
Thay giá trị OD trung bình trong bảng 3.2 vào phương trình đường chuẩn ta tính được khối lượng NS chưa được màng hấp thu (m2), thay m2 vào công thức (1) ta tìm được khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng (mht), lấy khối lượng NS đã được hấp thu vào VLC thay vào công thức (2) ta được tỷ lệ thuốc neomycin sulfate
nạp vào VLC.
Khối lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK, tỷ lệ hấp thụ thuốc NS vào
màng CVK tại thời gian hấp thu cực đại (2 giờ), rung động 180 vòng/phút, nhiệt độ
40°C được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK tại thời điểm 2 giờ (n=3)
Màng Độ y (OD 277 EE% m2 (mg) mht (mg)
m1 (mg) nm) dày
màng
0,0261 0,183 1,817 90,85 0,3 cm 2
±0,0001 ±0,0007 ±0,0011 ±0,0351 Chuẩn
0.0305 1,796 89,78 0,2044 0,5 cm 2
±0.0001 ±0,0013 ±0,0485 ±0,001
Dừa 0,3 cm 2
0,0312 ±0,0002 1,785 ±0,00142 89,24 ±0,04852 0,2152 ±0,0012
0,5 cm 2
0,037 ±0,00015 1,747 ±0,00097 87,35 ±0,0465 0,2526 ±0,001
Gạo 0,3 cm 2
0,0363 ±0,0001 1,752 ±0,001 87,62 ±0,03 0,2467 ±0,0006
0,5 cm 2
0,0388 ±0,00014 1,736 ±0,00092 86,81 ±0,0458 0,2638 ±0,001
21
Từ“bảng 3.3 ta thấy, tại thời gian nạp thuốc cực đại (2 giờ) thì trong cùng một
loại vật liệu Cellulose có độ dày 0,3 cm hấp thu thuốc cao hơn màng 0,5 cm”ở cả 3 loại vật liệu.
Đối với màng ở môi trường chuẩn sau 2 giờ lượng thuốc nạp vào màng 0,3 cm
cao hơn màng 0,5 cm 0,021 mg.
Đối với màng dừa khối lượng thuốc NS đã được hấp thu vào màng 0,5 cm thấp
hơn màng 0,3 cm 0,038 mg.
Đối với màng gạo sau 2 giờ ở màng 0,3 cm lượng thuốc NS nạp vào màng
cao hơn ở màng 0,5 cm là 0,016 mg.
Như vậy, VLC có độ dày 0,3 cm nạp thuốc NS cao hơn màng 0,5 cm.
Dùng hàm“t –Test: Two Sample Assuming Unequal Variances để kiểm định
giả thuyết, giữa 2 màng 0,3 cm và 0,5 cm của màng chuẩn ta thu”được, | t Stat | =
56,64 > t Critical two-tail = 4,03, có sự sai khác về lượng thuốc được nạp vào màng
CVK ở hai độ dày màng khác nhau. Như vậy VLC chuẩn 0,3 cm hấp thu thuốc cao
hơn VLC dày 0,5 cm.
Tương tự, đối với màng dừa, gạo 0,3cm và 0,5cm cũng tiến hành kiểm định
giả thuyết như trên, ta được: màng dừa có | t Stat | = 47,29 > t Critical two-tail =
2,776, nên có sự khác nhau về khối lượng thuốc hấp thu vào hai độ dày màng. Kết
quả kiểm định ở màng gạo thì | t Stat | = 25,61 > t Critical two-tail = 2,776, có sự sai
khác về lượng thuốc được nạp vào màng gạo 0,3 cm và 0,5 cm.
Kết luận: Cùng một loại VLC“thì màng dày 0,3 cm hấp thu thuốc NS cao hơn
màng”0,5 cm, chứng“tỏ độ dày màng có ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ” thuốc, có
thể giải thích là màng có độ dày mỏng hơn thì đường đi của thuốc ngắn hơn so với
đường đi của thuốc vào màng dày hơn, nên xét trong cùng một khoảng thời gian hấp
thụ thì màng 0,3 cm hấp thụ thuốc tốt hơn màng 0,5 cm.
Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS của các loại màng có độ dày khác nhau, được thể hiện
trong hình 3.8.
22
92
90.85
)
91
89.78
90
89.24
89
87.62
88
87.35
0.3cm
86.81
87
0.5cm
86
85
84
%
( c ố u h t ụ h t p ấ h ệ l ỷ T
MC
MG
MD Loại màng
Hình 3.8. Tỷ lệ hấp thụ thuốc NS của các loại VLC
Từ bảng 3.3, kết hợp với hình 3.8,“trong cùng một loại màng thì tỷ lệ hấp thu
thuốc ở màng 0,3 cm cao hơn màng 0,5 cm, và trong cùng một độ dày màng thì tỷ lệ
nạp thuốc vào các loại màng khác nhau”là khác nhau.
VLC“lên men từ môi trường chuẩn có tỷ lệ hấp thu thuốc cao hơn so với màng
dừa và màng gạo, ở cả hai hai kích thước”0,3 cm và 0,5 cm. Tỷ lệ nạp thuốc NS ở
màng chuẩn 0,3 cm là 90,85% cao hơn màng dừa là 89,24%, màng gạo là 87,62%;
đối với màng chuẩn 0,5 là 89,78%, màng dừa là 87,35%, màng gạo là 86,81%. Sự sai
khác này có ý nghĩa thống kê với | t Stat | > t Critical two-tail. Vì vậy,“tỷ lệ thuốc
hấp thụ vào màng (EE%) thì tỉ lệ thuận với khối lượng thuốc được hấp thụ vào màng (mht), nên mht càng lớn thì EE% càng lớn và ngược”lại.
Vậy,“màng chuẩn hấp thu thuốc là cao nhất, sau đó đến màng dừa, cuối cùng là màng gạo hấp thu thuốc thấp”hơn. Kết“quả này tương tự trong nghiên cứu của
Nguyễn Xuân Thành [11], nghiên cứu đánh giá sự hấp thụ Famotidine của Cellulose
được tạo ra từ Acetobacter Xylinum trong một số môi trường nuôi”cấy.
23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận Những kết quả đạt được sau khi hoàn thành khoá luận:
Tạo“được màng Cellulose vi khuẩn thô lên men từ 3 môi”trường.
Thu“được VLC tinh khiết có độ dày 0,3 cm và 0,5 cm dùng để nạp”thuốc
neomycin sulfate.
Tiến“hành hấp thu thuốc neomycin sulfate vào 3 loại”màng, cùng một loại màng thì màng dày 0,3 cm hấp thu thuốc cao hơn so với màng dày 0,5 cm. Lượng thuốc ở VLC – MTC hấp thu là 1,817 mg ở màng dày 0,3cm cao hơn ở màng dày 0,5
cm là 1,796 mg. Ở VlC – MTD thì lượng thuốc được hấp thu vào màng là 1,785 mg
ở độ dày 0,3 cm cao hơn ở màng dày 0,5 cm là 1,747 mg. VLC lên men từ nước vo
gạo hấp thu thuốc là thấp nhất, ở màng 0,3 cm là 1,752 mg và 1,736 mg ở VLC –
MTG dày 0,5 cm. Như vậy màng càng mỏng thì lượng thuốc hấp thụ vào màng càng
nhiều.
Cùng một độ dày 0,3 cm hoặc 0,5 cm thì khối lượng thuốc hấp thu vào VLC
– MTC cao nhất đạt 1,817mg ở 0,3 cm hoặc 1,796 mg ở 0,5 cm và thấp nhất là 1,752
mg ở 0,3 cm hoặc 1,736 mg ở 0,5 cm ở VLC – MTG. Như vậy khả năng hấp thu
thuốc NS cao nhất là VLC lên men từ MTC, sau đó là VLC – MTD, còn VLC – MTG
hấp thụ thuốc NS là thấp nhất.
2. Kiến nghị
Lên men tạo VLC từ vi khuẩn G. xylinus, trên các loại môi trường giàu chất
dinh dưỡng khác như: dịch nước hoa quả, nước mía, rỉ đường ở các nhà máy sản xuất
đường,… để làm vật liệu hấp thụ thuốc NS.
Tiến hành nạp các loại thuốc khác nhau vào VLC, nhằm tăng hiệu quả dùng
thuốc, giảm các tác dụng phụ của thuốc.
24
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt [1]. Bộ Y tế (2009), “Dược Điển Việt Nam IV”, NXB Hà Nội 2009
[2]. Bộ Y tế (2009), “Danh mục thuốc tân dược thiết yếu lần thứ VI”, pp.18
[3]. Phan Thị Thu Hồng và cộng sự (2015),“Sử dụng cellulose tổng hợp vi khuẩn
Acetobacter xylinum để chế tạo vật liệu nhựa composite sinh học trên nền nhựa polyvinyl alcohol”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18 (4): 114-124. [4]. Nguyễn Thuý Hương (2006), “ Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot ”, Luận án
tiến sĩ sinh học ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh, Trường ĐHKHTN.
[5]. Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Tường An (2008), “ Thu nhận Bacteriocin bằng
phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang Cellulose
vi kuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu’’, Tạp chí Scien
& Technology Development, 11 (9).
[6]. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. “Nghiên cứu các đặc tính màng
cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”. Tạp chí Dược
học số 361/2006, trang 18-20.
[7]. Dương Minh Lam, Nguyễn Thị Thuỳ Vân, Đinh Thị Kim Nhung (2013), “Phân
lập, tuyển chọn và định loại chủng vi khuẩn BHN2 sinh màng Cellulose vi khuẩn”,
Tạp chí sinh học 35 (1): 74 – 79.
[8]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên
cứu vi khuẩn A. xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”,
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (4), 453-462.
[9]. Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng
cho Acetobacter xylinum bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36(1), 10 – 12.
[10]. Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ
Acetobactor xylinum”, đề tài KH&CN cấp Bộ Y tế. [11]. Nguyễn Xuân Thành, “Đánh giá sự hấp thu Famotidine của Cellulose được tạo ra từ Acetorbacter Xylinum trong một số môi trường nuôi cấy”. Tạp chí Khoa học & Công nghệ, 180(04), 199 – 204.
Tài liệu tiếng Anh [12]. Anjali. et. al (2016), “ A study of chitosan nanofibers containing neomycin sulfate for wound healing activity”, Derpharmacia Lettre, 8(11), 128 – 139.
25
[13]. Amita H. Patel and Riddhi M. Dave, (2015) “Formulation and evaluation of
sustained release in situ of ophthalmic gel of neomycin sulfate”, Bulletin of Pharmaceutical Research, 5(1), 1 -5.
[14]. A suprriya, J Sundaraseelan, BR Srini Murthy and M Bindu Priya, (2018),
“Formulation and Invitro Characterization of Neomycin Loaded Chitosan
Nanoparticles”, Acta scientific pharmaceutical sciences 2(2), 34 - 40. [15]. Amin M.C.I.M. et al. (2012), "Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties", Journal of Sain Malaysiana, 41, 561-568.
[16]. Ataklti Abraha, AV Gholap, Abebe Belay, (2016), “Study Self-association,
Optical Transition Properties and Thermodynamic Properties of Neomycin Sulfate
Using UV-Visible Spectroscopy”, Intermational Journal of Biophysics, 6(2), 16-20.
[17]. Muhammad Mustafa Abern. et al. ( 2014), “ A review of bacterial cellulose –
based drug delive systems: their biochemistry, current approaches and future
prospects ”, Jourmal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp. 1047 – 1061.
[18]. Hanif Ullah, He ́lder A. Santos, Taous Khan, (2016), “Applications of bacterial
cellulose in food, cosmetics and drug delivery”
[19]. Hanif Ullah. et al. (2017), “ Fabrication, characterization and evaluation of
bacterial Cellulose – based capsule for oral drug delivery ”, Cellulose, 24: 1445 –
1454.
[20]. Trovatti E. et al. (2011), “ Bacterial cellulose membranes applied in topical and
transdermaldelivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: in vitro diffusion
studies” , Int J Pharm, 435, 83- 87.
[21]. United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service,
National Nutrient Database for Standard Reference Release 28 “ Basic Report: 43406, Yeast extract spread ”
26
PHỤ LỤC
Bảng 1. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS của VLC – MTC ở hai
khoảng thời gian 1,5 giờ và 2 giờ ở độ dày 0,3 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Chuẩn 0,3 cm 1,5 giờ 2 giờ
0.0261 1E-08 3 0.026333 2.33E-08 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 2.213594 0.05686 2.353363 0.11372 3.182446
Bảng 2. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS trong hai khoảng thời
gian 1,5 giờ, 2 giờ của VLC lên men từ MTC ở độ dày 0,5 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
chuẩn 0,5 1,5 giờ 2 giờ
0.029466667 2.33333E-08 3 0.029567 3.96396E-09 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 -1.051831232 0.185060312 2.353363435 0.370120625 3.182446305
Giả“thuyết: Ho là 2 số trung bình mẫu giống nhau với mức ý”nghĩa = 0,05. So“sánh giá trị | t Stat | < t Critical two-tail nên chấp nhận”Ho, vậy“giá trị OD trung bình tại 1,5 giờ và 2 giờ không khác nhau ở cả 2 độ dày màng của VLC lên men từ môi”trường chuẩn
Bảng 3. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS trong hai khoảng thời
gian 1,5 giờ, 2 giờ của VLC lên men từ MTD ở độ dày 0,3 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Dừa 0,3 cm 1,5 giờ 2 giờ
0.031167 2.33E-08 3 0.0316 0.00000013 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference Df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 1.91674543 0.075560082 2.353363435 0.151120163 3.182446305
Bảng 4. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS trong hai khoảng thời
gian 1,5 giờ, 2 giờ của VLC lên men từ MTD ở độ dày 0,5 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Dừa 0,5 cm 1.5 giờ 2 giờ
0.0371 2E-08 3 0.0372 3E-09 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference Df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 1.7678 0.0876 2.3534 0.1753 3.1824
Giả“thuyết: Ho là 2 số trung bình mẫu giống nhau với mức ý”nghĩa = 0,05. So“sánh giá trị | t Stat | < t Critical two-tail nên chấp nhận”Ho, vậy“giá trị OD trung bình tại 1,5 giờ và 2 giờ là giống nhau ở cả 2 độ dày màng của VLC lên men từ môi”trường nước dừa già
Bảng 5. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS trong hai khoảng thời
gian 1,5 giờ, 2 giờ của VLC lên men từ MTG ở độ dày 0,3 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Gạo 0,3 cm 1.5 giờ 2 giờ
0.0363 1E-08 3 0.0366 2E-08 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 2.5298 0.0427 2.3534 0.0854 3.1824
Bảng 6. So sánh giá trị OD trung bình (y) của thuốc NS trong hai khoảng thời
gian 1,5 giờ, 2 giờ của VLC lên men từ MTG ở độ dày 0,5 cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
gạo 0,5 cm 1,5 giờ 2 giờ
0.0388 2E-08 3 0.039 1E-08 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 1.5811 0.106 2.3534 0.212 3.1824
Giả“thuyết: Ho là 2 số trung bình mẫu giống nhau với mức ý”nghĩa = 0,05. So“sánh giá trị | t Stat | < t Critical two-tail nên chấp nhận”Ho, vậy“giá trị OD trung bình tại 1,5 giờ và 2 giờ là giống nhau ở cả 2 độ dày màng của VLC lên men từ môi”trường nước vo gạo.
Bảng 7. So sánh lượng thuốc hấp thụ vào VLC - MTC ở độ dày 0,3 cm và 0,5
cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Chuẩn 0,3 cm với ch0,5 cm 0,3 cm 0,5 cm
1.7958 4E-08 3 1.817 4E-07 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference Df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 2 56.642 0.0002 2.92 0.0003 4.3027
Bảng 8. So sánh lượng thuốc hấp thụ vào VLC - MTD ở độ dày 0,3 cm và 0,5
cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Dừa 0.3 cm với 0.5 cm 0,5 cm
1.7473 9E-07 3 0,3 cm 1.7848333 9.433E-07 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference Df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 4 47.287277 5.982E-07 2.1318468 1.196E-06 2.7764451
Giả“thuyết Ho là hai số trung bình mẫu giống nhau với mức ý”nghĩa = 0,05.
So“sánh lượng thuốc hấp thu vào màng 0,3 cm và 0,5 cm ở môi trường chuẩn
thì | t stat | > t Critical two-tail nên bác”bỏ Ho
Kết luận: Ở cả hai loại VLC – MTC và VLC – MTD, số“trung bình hai mẫu
khác nhau có ý nghĩa thống kê hay lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC của màng 0,3
cm khác với lượng thuốc hấp thụ”vào VLC ở độ dày 0,5 cm.
Bảng 9. So sánh lượng thuốc hấp thụ vào VLC - MTG ở độ dày 0,3 cm và 0,5
cm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances
Gạo 0.3 cm với 0.5 cm 0,3 cm 0,5 cm
1.7362 8E-07 3 1.7524 4E-07 3
Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail 0 3 25.614 7E-05 2.3534 0.0001 3.1824
Giả“thuyết Ho là hai số trung bình mẫu giống nhau với mức ý”nghĩa = 0,05.
So“sánh lượng thuốc hấp thu vào màng 0,3 cm và 0,5 cm ở môi trường chuẩn
thì | t stat | > t Critical two-tail nên bác”bỏ Ho
Kết luận: Ở VLC - MTG, số“trung bình hai mẫu khác nhau có ý nghĩa thống
kê hay lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC của màng 0,3 cm khác với lượng thuốc hấp
thụ”vào VLC ở độ dày 0,5 cm.
