Khoá luận tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine o và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối Detector tử ngoại khả kiến

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài này nhằm mục đích nghiên cứu xây dựng một phương pháp xác định đồng thời hai chất màu Auramine O và Rhodamine B trong thực phẩm và tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của khoá luận này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khoá luận tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine o và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối Detector tử ngoại khả kiến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THANH THƠI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC TP. HỒ CHÍ MINH - THÁNG 05/2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THANH THƠI – 40.201.091 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN CỬ NHÂN NGÀNH SƯ PHẠM HÓA HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS. HUỲNH THỊ NHÀN ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP TP. HCM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc TP. HCM, ngày 05 tháng 05 năm 2018 NHẬN XÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Cán bộ phản biện: Nguyễn Thanh Thơi 40.201.091 ThS. Phan Thị Hoàng Yến Đánh giá Khóa luận 1. Về cuốn báo cáo: Số trang _______ Số chương _______ Số bảng số liệu _______ Số hình vẽ _______ Số tài liệu tham khảo _______ Sản phẩm _______ 2. Nhận xét của chủ tịch hội đồng: Điểm khóa luận: Nguyễn Thanh Thơi: ………../10 Chủ tịch Hội đồng ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐHSP TP.HCM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Cán bộ hướng dẫn: ThS. HUỲNH THỊ NHÀN ThS. NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2017 đến tháng 5/2018. Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THƠI – 40201091 Nội dung đề tài:  Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến. Sử dụng quy trình đề xuất phân tích một số mẫu thực tế.  Phạm vi: Phân tích trên nền một số mẫu thực phẩm (cải chua, măng, thịt gà).  Phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector tử ngoại khả kiến.  Kết quả mong đợi của đề tài: Nghiên cứu đề xuất điều kiện HPLC tối ưu để phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B, đề xuất được quy trình xử lý một số mẫu thực phẩm và phân tích trên một số nền mẫu thực tế. TP. HCM, ngày 05/05/2018 Sinh viên iii
LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô Huỳnh Thị Nhàn đã hướng dẫn em tận tình, hỗ trợ và giúp đỡ em từ những ngày đầu thực hiện đến khi hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”. Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen), cô Lê Thị Hồng Vân (giảng viên Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Trường Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh), thầy Huỳnh Lời, anh Lê Văn Huấn đã hỗ trợ và hướng dẫn em sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA và cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bửu Đăng, cô Văn Thị Cẩm Duyên, cô Phạm Thị Thảo Uyên, thầy Võ Công Minh, thầy Nguyễn Ngọc Hưng đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành thực nghiệm và các thầy cô Khoa Hóa – trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền cho em những kiến thức quý báu trong những năm tháng em học ở trường. Cuối cùng, em gửi lời cảm ơn đến gia đình, anh chị, bạn bè và tất cả những người luôn ở bên cạnh em, động viên, ủng hộ, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này. Đặc biệt, em muốn cảm ơn bạn Phan Thị Ngọc Trinh đã cùng em thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 05 năm 2018 Nguyễn Thanh Thơi iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU AOAC (Assosiation of Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức. PDA (Photodiode array): Đầu dò diode quang. LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry): Sắc ký lỏng khối phổ. HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao. ICH (International Conference on Harmonization): Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa. ISO (International Organization for Standardization): Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa. LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện. LOQ (Limit of Quantitation): Giới hạn định lượng. S (Signal to noise ratio): Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu. N TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam. STT: Số thứ tự. AO: Auramine O. RB: Rhodamine B. v
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Phân loại sắc ký theo pha tĩnh ............................................................................. 9 Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn ........................................................................................ 18 Bảng 2.2. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC .................................. 18 Bảng 2.3. Danh mục hóa chất tinh khiết ............................................................................ 19 Bảng 2.4. Thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn ICH, USP, FDA ............. 24 Bảng 2.5. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) .............. 28 Bảng 2.6. Lấy mẫu và thông tin mẫu ................................................................................. 28 Bảng 3.1. Kết quả bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong MeOH và trong ACN...................................................................................................................... 32 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi pha động ................................................................ 33 Bảng 3.3. Khảo sát các giá trị pH sử dụng acid acetic ....................................................... 33 Bảng 3.4. Khảo sát pH = 3 sử dụng acid formic ................................................................ 34 Bảng 3.5. Khảo sát pH = 2,3 và 2,6 sử dụng H3PO4 .......................................................... 35 Bảng 3.6. Chương trình gradient khảo sát tốc độ dòng ..................................................... 37 Bảng 3.7. Khảo sát tỉ lệ dung môi ban đầu ........................................................................ 39 Bảng 3.8. Chương trình gradient tối ưu ............................................................................. 39 Bảng 3.9. Dữ liệu nồng độ và diện tích AO, RB thu được khi tiến hành chạy sắc ký ...... 40 Bảng 3.10. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn .............................. 42 Bảng 3.11. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của AO ....................................... 43 Bảng 3.12. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng của RB ....................................... 43 Bảng 3.13. Diện tích của các chất phân tích và giá trị B i' tương ứng ở mỗi nồng độ ....... 44 Bảng 3.14. Bảng các giá trị Ftính của các chất phân tích ..................................................... 44 Bảng 3.15. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ....................................................................... 46 Bảng 3.16. Thể tích chiết và diện tích peak sắc ký ............................................................ 47 Bảng 3.17. Kết quả phân tích mẫu măng ........................................................................... 49 Bảng 3.18. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu măng ............................................................. 49 Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu cải chua ....................................................................... 52 Bảng 3.20. Hệ số thu hồi AO, RB của mẫu cải chua ......................................................... 52 Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu thịt gà .......................................................................... 53 vi
Bảng 3.22. Hệ số thu hồi AO và RB của mẫu thịt gà ........................................................ 53 vii
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramine O ..................................................................... 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Rhodamine B................................................................... 4 Hình 1.3. Minh họa a) quá trình sắc ký b) Sắc ký đồ .......................................................... 8 Hình 1.4. Hệ thống sắc ký khí ............................................................................................. 9 Hình 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng ........................................................................................... 9 Hình 1.6. Hình ảnh minh họa sắc ký đồ............................................................................. 10 Hình 1.7. Hình ảnh minh họa peak sắc ký ......................................................................... 10 Hình 1.8. Hình ảnh minh họa peak sắc ký theo phân bố Gauss ........................................ 12 Hình 1.9. Hình ảnh minh họa cột sắc ký và các đĩa lý thuyết ........................................... 13 Hình 1.10. Hình ảnh minh họa sự tách hai peak sắc ký ..................................................... 14 Hình 1.11. Hình ảnh minh họa sơ đồ hệ thống HPLC ....................................................... 15 Hình 2.1. Chương trình gradient pha động – Khảo sát chọn loại dung môi ...................... 21 Hình 2.2. Gradient pha động – Khảo sát pH 2,3 và 2,6 ..................................................... 22 Hình 2.3. Hình ảnh minh họa xác định LOD bằng cách tính S N ..................................... 26 Hình 2.4. Khảo sát thể tích dung môi chiết ....................................................................... 29 Hình 3.1. Sắc đồ khảo sát pH = 3 sử dụng acid acetic ...................................................... 34 Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng theo pH ............................................. 34 Hình 3.3. Sắc đồ khảo sát pH = 3,0 sử dụng acid formic .................................................. 35 Hình 3.4. Sắc đồ khảo sát pH = 2,6 sử dụng acid phosphoric ........................................... 35 Hình 3.5. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi MeOH – HCOOH (pH = 3)................... 36 Hình 3.6. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – HCOOH (pH = 3) ..................... 36 Hình 3.7. Sắc đồ chạy đẳng dòng với dung môi ACN – đệm acetate ............................... 37 Hình 3.8. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút......................................... 37 Hình 3.9. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút......................................... 38 Hình 3.10. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút..................................... 38 Hình 3.11. Sắc đồ AO và RB ứng với tốc độ dòng 1 mL/phút.......................................... 38 Hình 3.12. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Auramine O.................... 41 Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ Rhodamine B ................. 41 viii
Hình 3.14. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ở nồng độ 0,02 ppm ............................. 45 Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ở nồng độ 0,05 ppm ............................. 46 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích peak vào các lần chiết AO (a) và RB (b) ............. 47 Hình 3.17. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .............................................................................. 48 Hình 3.18. Các sắc ký đồ phân tích mẫu măng ................................................................. 50 Hình 3.19. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của AO .................................................... 51 Hình 3.20. Bước sóng ứng với hấp thụ cực đại của RB .................................................... 51 ix
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................................ v DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................... vi MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3 1.1. Auramine O ...........................................................................................................3 1.1.1. Cấu tạo ................................................................................................................. 3 1.1.3. Ứng dụng ............................................................................................................. 3 1.1.4. Độc tính................................................................................................................ 3 1.2. Rhodamine B .........................................................................................................4 1.2.1. Cấu tạo ................................................................................................................. 4 1.2.2. Tính chất .............................................................................................................. 4 1.2.3. Ứng dụng ............................................................................................................. 5 1.2.4. Độc tính................................................................................................................ 5 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký ................................................................ 7 1.4.1. Khái niệm sắc ký ................................................................................................. 7 1.4.2. Phân loại .............................................................................................................. 8 1.4.3. Lý thuyết về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................. 9 1.5. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)......................................................14 1.5.1. Bình chứa pha động ........................................................................................... 15 1.5.2. Bộ phận khử khí ................................................................................................. 15 1.5.3. Bơm cao áp ........................................................................................................ 16 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 18 2.1. Hóa chất và dụng cụ ............................................................................................ 18 2.1.1. Hóa chất ............................................................................................................. 18 2.1.1.1. Chất chuẩn ................................................................................................... 18 2.1.1.2. Dung môi ..................................................................................................... 18 2.1.1.3. Các hóa chất khác ........................................................................................ 19 2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ phục vụ nghiên cứu .................................................. 19 x
2.1.2.1. Trang thiết bị ............................................................................................... 19 2.1.2.2. Dụng cụ ....................................................................................................... 20 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 20 2.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC ............................................ 20 2.2.1.1. Khoảng bước sóng của detector PDA ......................................................... 20 2.2.1.2. Thăm dò thứ tự tách các chất phân tích trên cột sắc ký pha đảo C18 ......... 20 2.2.2. Tối ưu hóa pha động .......................................................................................... 21 2.2.2.1. Khảo sát dung môi pha động ....................................................................... 21 2.2.2.2. Khảo sát pH ................................................................................................. 22 2.2.2.3. Khảo sát chương trình hóa dung môi pha động .......................................... 23 2.2.2.4. Tốc độ pha động .......................................................................................... 23 2.2.3. Thẩm định phương pháp .................................................................................... 23 2.2.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ................................................................................ 24 2.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ............................................................ 25 2.2.3.3. Giới hạn phát hiện ....................................................................................... 26 2.2.3.4. Giới hạn định lượng .................................................................................... 27 2.2.3.5. Độ đúng ....................................................................................................... 27 2.2.4. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm ......................................................................... 28 2.2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu........................................................................... 28 2.2.4.2. Quy trình xử lý mẫu thực phẩm .................................................................. 29 2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả............................................................. 29 2.2.5.1. Xử lý kết quả dựa trên đường chuẩn ........................................................... 29 2.2.5.2. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm ...................................................... 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 32 3.1. Điều kiện phân tích HPLC ..................................................................................32 3.1.1. Bước sóng và độ hấp thụ cực đại của các chất phân tích trong các dung môi .. 32 3.1.2. Tối ưu hóa pha động .......................................................................................... 32 3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động ....................................................................... 32 3.1.2.2. Khảo sát pH pha động ................................................................................. 33 3.1.2.3. Khảo sát chương trình dung môi pha động với chế độ đẳng dòng ............. 36 xi
3.1.2.3. Khảo sát tốc độ dòng ................................................................................... 37 3.2. Thẩm định phương pháp .....................................................................................40 3.2.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc....................................................................................... 40 3.2.2.1. Xây dựng đường chuẩn của AO và RB ....................................................... 40 3.2.2.2. Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn ......................... 42 3.2.2.3. Hệ số dung lượng và hệ số không đối xứng ................................................ 42 3.2.2.4. Kiểm tra sai số hệ thống của phương pháp ................................................. 43 3.2.3. Giới hạn phát hiện.............................................................................................. 44 3.2.4. Giới hạn định lượng ........................................................................................... 45 3.2.5. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ......................................................................... 46 3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thực tế ......................................................... 47 3.3.1. Quy trình chiết mẫu ........................................................................................... 47 3.3.2. Mẫu măng .......................................................................................................... 48 3.3.2.1. Phân tích mẫu măng và xác định hệ số thu hồi ........................................... 48 3.3.2.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu măng ............................... 50 3.3.3. Mẫu cải chua ...................................................................................................... 51 3.3.3.1. Phân tích cải chua và xác định hệ số thu hồi............................................... 51 3.3.3.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu cải chua ........................... 52 3.3.4. Mẫu thịt gà ......................................................................................................... 53 3.3.4.1. Phân tích mẫu gà và xác định hệ số thu hồi ................................................ 53 3.3.4.2. Tính chọn lọc AO và RB đối với phân tích mẫu thịt gà .............................. 53 3.3.5. Kết quả khảo sát mẫu thực tế ............................................................................. 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 55 4.1. Kết luận ...............................................................................................................55 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 57 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 60 xii
MỞ ĐẦU Ngày nay, vấn đề an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề thời sự của xã hội và mang tính chất toàn cầu. Thực phẩm trên thị trường rất đa dạng và có nhiều nguồn gốc khác nhau (thực phẩm trong nước, thực phẩm được nhập khẩu từ nhiều nước khác trên thế giới). Trong thực phẩm, ngoài các thành phần tự nhiên có sẵn thì người cung ứng thường bổ sung thêm các chất gọi là phụ gia thực phẩm để bảo quản hoặc tạo màu sắc sản phẩm. Tuy nhiên, một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế hoặc do hiểu biết còn hạn chế đã thêm những chất không được phép vào thực phẩm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Trong những năm gần đây, vấn nạn thực phẩm nhiễm Auramine O và Rhodamine B được phát hiện ngày càng nhiều, không chỉ xảy ra ở Việt Nam mà còn một số quốc gia khác trên thế giới, chẳng hạn như Trung Quốc. Auramine O và Rhodamine B là các chất được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp nhuộm. Phân tử của các chất này chứa nhiều hệ liên hợp, trong đó có vòng benzene. Khi ăn phải các thực phẩm nhiễm Auramine O hoặc Rhodamine B dù với hàm lượng lớn hay nhỏ đều gây ra những biến đổi không tốt đối với cơ thể và có thể để lại những hậu quả lâu dài. Vì thế, yêu cầu phân tích định tính và định lượng hai chất này trong thực phẩm đang rất được quan tâm. Trong nước, số lượng tác giả nghiên cứu phân tích đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong thực phầm hầu như chưa có. Các đề tài phân tích riêng rẽ Rhodamine B và đặc biệt là Auramine O còn rất hạn chế mặc dù các chất màu này đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu. Qua những tài liệu, những bài báo đã công bố trên các tạp chí uy tín, chúng tôi thấy rằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tốt để định tính và định lượng hai thành phần này trong các mẫu thực phẩm. Vì vậy, dựa trên thực tế đó cùng với những trang thiết bị hiện đại và cơ sở vật chất vốn có của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân Tích – trường Đại học Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh và Trung tâm khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến”. 1
Đề tài này nhằm mục đích nghiên cứu xây dựng một phương pháp xác định đồng thời hai chất màu này trong thực phẩm và tiến hành phân tích trên một số mẫu thực tế. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Auramine O Auramine O (Vàng ô) là tên gọi thương mại của chất thuộc phân nhóm ketoimine[2]. 1.1.1. Cấu tạo Tên IUPAC: bis[4-(dimethylamin)phenyl]methanimium chloride Tên khác: Basic yellow 2, pyocatanium auremine, pyoktanin yellow, canary yellow, pyoktanin, C.I Công thức phân tử: C17H22N3Cl Khối lượng mol: 303,84 gam/mol Công thức cấu tạo: NH.HCl N N Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramine O Ở điều kiện thường, Auramine O là tinh thể hình kim vàng[2]. Auramine O tan tốt trong nước, ethanol[2] và một số dung môi hữu cơ khác. Điểm nóng chảy: 267oC (513oF và 540K) pKa: 9,8 và 10,7 Bước sóng hấp thụ (  max ) cực đại: 370 nm và 435 nm[19][20][21] Bước sóng phát xạ: 550nm 1.1.3. Ứng dụng Auramine O là chất nhuộm hữu cơ, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp nhuộm vải, gỗ, giấy, …. [2]. 1.1.4. Độc tính Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế của Tổ chức y tế thế giới (WHO/IARC), chất vàng ô là chất đứng hàng thứ 5 trong 116 chất có khả năng gây ung thư hàng đầu trên thế giới. Khi thí nghiệm trên động vật sống, Auramine O được báo cáo là gây tổn thương DNA trong tế bào gan, thận và tủy xương. Sau khi thực hiện thí nghiệm DNA nhiễm Auramine O của dòng tế bào người trong ống nghiệm thì các nhà khoa học phát hiện rằng DNA bị hư hại nghiêm trọng. 3
Auramine O dễ tan trong nước, ethanol. Nó là một loại thuốc nhuộm có tính base. Một số cá nhân, tổ chức vì lợi nhuận kinh tế đã thêm Auramine O vào đậu nành, thức ăn cho cá để làm thay đổi màu sắc sản phẩm[23], làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn gia súc và làm chất tạo màu trong công nghiệp thực phẩm[2]. Các dữ liệu về độc tính cho thấy rằng Auramine O kích thích nhẹ đến niêm mạc da, có thể gây ra viêm kết mạc, và gây kích ứng đường hô hấp trên. Khi con người hít phải hoặc tiếp xúc với Auramine O thì có thể bị ngộ độc, gây ung thư, với hàm lượng lớn có thể phá hủy DNA, tế bào gan, thận và tủy[2]. 1.2. Rhodamine B 1.2.1. Cấu tạo COOH H3C N O N CH3 Cl- H3C CH3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Rhodamine B Tên IUPAC: [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]diethylammonium cloride Tên khác: Rhodamine 610, CI pigment Violet 1, Basic Violet 10 Công thức phân tử: C28H31N2O3Cl Khối lượng phân tử: 479,01 (gam/mol) 1.2.2. Tính chất Ở điều kiện thường, Rhodamine B là chất dạng bột màu đỏ. Rhodamine là phân tử chứa nhóm azo (chất có liên kết –N=N– trong cấu tạo phân tử) nên tan được trong dầu[3], trong nước (50 mg/mL tạo dung dịch màu tím đỏ) và dung môi hữu cơ như methanol (70 mg/mL), ethanol, tan nhẹ trong acetone[3]. Nhiệt độ nóng chảy của Rhodamine B là 210°C – 211°C[3]. Tỉ trọng tương đối: 0,79 g/cm3 Bước sóng hấp thụ cực đại (  max ): 550 nm[3]; 520 nm[23]; bước sóng hấp thụ cực đại trong ethanol 526 nm[3] 4
pK a,[R + ][H+ ][RH+ ]  3, 2 (Cl 0,1M, 25o C) Bước sóng phát xạ: 580 nm. 1.2.3. Ứng dụng Rhodamine B được sử dụng để tạo màu và nhộm màu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng thí nghiệm[3][13], nhuộm màu trong xét nghiệm tế bào (do khả năng bền màu và phát quang màu tím đỏ). Rhodamine B phát huỳnh quang nên được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học như kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang … Tuy nhiên, nếu dùng Rhodamine B để nhuộm thực phẩm sẽ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. 1.2.4. Độc tính Theo Ủy ban an toàn thực phẩm của Châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban Châu Âu đã quy định rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ phẩm nên không có giới hạn cho phép đối với nhóm chất nhuộm này[6]. Rhodamine B cũng đã được cảnh báo là chất có thể gây độc cấp tính và mãn tính. Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới cho thấy rằng Rhodamine B có thể gây ung thư, đột biến nếu da tiếp xúc trực tiếp với chất này. Nếu Rhodamine B dính vào người, nó có thể gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da mắt ... Nếu hít phải hơi chất này thì sẽ gây ra triệu chứng ho, ngứa cổ, khó thở đau ngực. Nếu ăn phải thức ăn chứa Rhodamine B, nó gây nôn mửa, gây hại cho gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư[4][6]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5 mg/kg qua đường ăn uống hoặc tiêm vào tĩnh mạch. Rhodamine B đi vào cơ thể, nó có thể bị chuyển hóa thành amine thơm tương ứng, chất này có phần độc hại hơn Rhodamine B và đây cũng chính là nguyên nhân gây ung thư. Khi Rhodamine B chuyển hóa thành các dẫn xuất và tồn tại trong cơ thể thì nó và các dẫn xuất của nó sẽ tác động mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan[6]. Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc DNA và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi cấy tế bào. Do tính độc hại của Rhodamine B rất lớn nên hầu hết các quốc gia trên thế giới đều cấm sử dụng chất này trong thực phẩm. 5
1.3. Lịch sử nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước Công trình số 27 trong danh mục tài liệu tham khảo[27] nhóm tác giả đã nghiên cứu phương pháp xác định Rhodamine B có trong ớt khô, nước ép trái cây và rượu vang đỏ. Các chất phân tích có trong ớt khô, nước ép trái cây, rượu vang đỏ đã được chiết với acetonitrile. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò huỳnh quang (HPLC – Flu) được sử dụng để xác định các chất phân tích. Thành phần pha động gồm đệm phosphate có nồng độ 3 g/mol và methanol (3:7, tỉ lệ thể tích), pH được điều chỉnh để đạt giá trị 7,0 bằng acid orthophosphoric. Kết quả đường chuẩn tuyến tính với khoảng nồng độ chất chuẩn từ 1-100 ppb. LOD của Rhodamine B là 0,1 ppb trong ớt khô; 0,2 ppb trong cả hai loại thức uống là nước ép trái cây và rượu vang đỏ. LOQ của Rhodamine B đối với ớt khô là 0,6 ppb, nước ép trái cây 0,5 ppb và rượu vang đỏ 0,5 ppb. Hệ số thu hồi trung bình của Rhodamine B là 98,2% – 110,3% trong ớt khô, 94,6% – 102,2% trong nước ép trái cây, và 90,4% –104,6% trong rượu vang đỏ. Độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp này là 2,3% – 9,0%. Công trình số 23[23] trong danh mục tài liệu tham khảo, các tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV-Vis để xác định 7 loại phẩm màu không được có trong thực phẩm bao gồm Auramine O, Basic Orange, Acid Orange II, Acid Orange, Rhodamine B, Para Red và Sudan I. Các mẫu thực phẩm như đậu nành, thịt được chiết bằng acetonitrile, methanol và kiềm. Các mẫu gia vị được chiết bằng acid acetic và acetonitrile 70%, cột sắc ký (250mm x 4,6mm x 5µm), pha động methanol – 50 mmol/L amonium acetate (dùng H3PO4 điều chỉnh pH đến 4,5). LOD trong khoảng 0,01 – 0,1 mg/L; LOQ trong khoảng 0,175 – 1,25 mg/kg. Hệ số thu hồi trung bình lớn hơn 80%; độ lệch chuẩn tương đối (RSD, n = 3) trong phạm vi 2,04% – 5,66%. Công trình “Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao”[6] của nhóm các tác giả Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân (Viện dinh dưỡng quốc gia). Các tác giả đã phân tích các mẫu bột ớt, bột cà ri, bột sa tế sử dụng phương pháp HPLC. Trong đề tài này, Rhodamine B trong mẫu được hòa tan trong hỗn hợp acetonitrile/acetone, dịch chiết được lọc, ly tâm, lấy dung dịch xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV – Vis ở bước sóng 550 nm, cột pha đảo RP C18 (150mm x 4,6mm x 5µm). LOD thu được 0,2 ppm, LOQ là 0,6 ppm. Bài báo cũng chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu bao gồm: 6
+ Sử dụng thiết bị siêu âm để chiết Rhodamine B từ nền mẫu cho thấy Rhodamine B không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ không quá 70oC. + Thời gian chiết tách và chạy sắc ký tốt nhất được thực hiện trong ngày, sang các ngày tiếp theo nồng độ Rhodamine B có giảm nhưng không đáng kể, ngày thứ 4 thì nồng độ Rhodamine B giảm đi một nửa. Tác giả Lê Thị Hường Hoa đã “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm”[3] – trong luận án tiến sĩ dược học của mình. Rhodamine B là một trong số các chất mà tác giả đã phân tích. Đối tượng phân tích của tác giả này là mỹ phẩm. Điều kiện sắc ký là cột sắc ký Hypersil ODS (C18), (5µm x 200mm x 4,6 mm) hoặc tương đương, nhiệt độ cột là 30oC, tốc độ dòng là 1 ml/phút. Bước sóng phát hiện Rhodamine B là 535 nm, vùng quét phổ 275 – 760 nm, thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Thời gian sắc ký 35 phút. Pha động được sử dụng là dung dịch tetrabutylammonium (TBA) 0,005 M – nước (75 : 25, theo thể tích). LOD của Rhodamine B là 0,8 ppm. Tác giả không đề cập đến LOQ. 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký[4][5] 1.4.1. Khái niệm sắc ký Sắc ký là một kỹ thuật tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự tương tác của các hợp chất với hai pha là pha động và pha tĩnh. Các thành phần của hệ sắc ký bao gồm pha động, pha tĩnh và chất phân tích. Pha động là một hệ dung môi chảy qua vật liệu nhồi, pha tĩnh là một lớp phủ trên vật liệu nhồi và tương tác với các chất phân tích, vật liệu nhồi là một bề mặt rắn mà trên đó pha tĩnh liên kết với nhau. Các chất phân tích tương tác mạnh mẽ nhất với pha tĩnh sẽ mất nhiều thời gian để đi qua hệ thống hơn so với những chất tương tác với pha tĩnh yếu hơn. Những tương tác này xảy ra trong một hệ thống sắc ký thường là các tương tác mang bản chất hóa học, nhưng trong một số trường hợp, tương tác vật lý cũng có thể được sử dụng trong sắc ký. 7