Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)" là khảo sát hàm lượng flavonoid, polyphenol và thành phần của tinh dầu có trong cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii; đánh giá sơ bộ hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)

` ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------------------ ĐẶNG ANH THƯ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA LOÀI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM (Distichochlamys orlowii) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2022
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------------------ ĐẶNG ANH THƯ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA LOÀI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM (Distichochlamys orlowii) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2017.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ HỒNG LUYẾN ThS. NGUYỄN XUÂN TÙNG HÀ NỘI – 2022
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Khoa học cơ sở Dược và toàn thể các thầy cô đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến – Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng – Trường Đại học Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Em xin trân trọng cảm ơn Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường. Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giúp em hoàn thiện khóa luận hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Đặng Anh Thư
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Ý nghĩa 2,20 -azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic 1 ABTS• + acid) 2 ADN Acid deoxyribonucleic 3 ARN Acid ribonucleic 5 BHA Butylated hydroxyanisole 4 BHT Butylated hydroxytoluene 6 DCM/ CH2Cl2 Dichloromethan 7 DC Cao chiết dichloromethan 8 ET Cao chiết ethanol 9 EA Cao chiết ethyl acetat 10 ME Cao chiết methanol 11 DPPH 2,3-diphenyl-1-picrylhydrazyl 12 EtOAc Ethyl acetate 13 EtOH Ethanol 14 GC-MC Sắc ký khí- khối phổ Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory 15 IC50 Concentration) 16 MeOH Methanol
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh .................................................... 10 Bảng 1.2. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp ......................................................................................................................... 13 Bảng 3.1. Khối lượng cao chiết thu được (mg) và hiệu suất chiết (%) .......... 24 Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần trong cao chiết của cây D. Orlowii (%) .......................................................................................... 26 Bảng 3.3. Hoạt tính trung hòa DPPH (IC50, µg/mL) của cao chiết ................ 29 Bảng 3.4. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ (IC50) của các cao chiết...... 31 Bảng 3.5. Các thành phần tinh dầu trong dịch chiết n-hexan từ rễ và củ của D.orlowii ......................................................................................................... 33
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh loài Gừng đen lá tím (D. orlowii ....................................... 5 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A ...................................................... 11 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E ....................................................... 12 Hình 3.1. Đường chuẩn của acid gallic ........................................................... 25 Hình 3.2. Đường chuẩn của quercetin............................................................. 25 Hình 3.3 . Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần của rễ củ của cây D. Orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). .............. 27 Hình 3.4. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của rễ và củ cây D. orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). ................................................... 30 Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trung hòa ABTS+ tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D)............................................................................................... 32 Hình 3.6. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ củ của D. orlowii. 35
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN............................................................................ 3 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys ............... 3 1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................. 3 1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii ............................................... 4 1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái ............................................................ 4 1.2.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................. 4 1.2.3. Thành phần hóa học .......................................................................... 5 1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý ........................................................ 6 1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa .......................................................... 6 1.3.1. Gốc tự do........................................................................................... 6 1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ................. 14 1.4.1. Xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH ................................... 14 1.4.2. Thử nghiệm ABTS (TEAC) ........................................................... 14 CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 16 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu ............................................. 16 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 16 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất ..................................................................... 16 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 16 2.3.1. Phương pháp chiết .......................................................................... 16 2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các dịch chiết từ củ và rễ của cây.... 18 2.3.3. Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS .................................. 23 2.3.4. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 18 2.3.4. Xử lý số liệu .................................................................................... 23 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ ............................................................................... 24 3.1. Kết quả chiết xuất và định lượng một số các hợp chất tự nhiên trong rễ và củ của cây D.orlowii ...................................................................................... 24 3.1.1. Kết quả chiết xuất ........................................................................... 24
3.1.2. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 24 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết rễ và củ cây D. orlowii ................................................................................................................... 28 3.2.1. Theo mô hình trung hòa gốc tự do DPPH ...................................... 28 3.2.1. Theo mô hình trung hòa gốc tự do ABTS+ ..................................... 30 3.3. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ dịch chiết rễ và củ cây D. orlowii ............................................................................................................................... 33 CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN ............................................................................ 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỞ ĐẦU Trong xã hội tiến bộ và phát triển như ngày nay thì cuộc sống của con người đã được nâng cao. Do đó, các vấn đề về bảo vệ sức khỏe và sắc đẹp ngày càng được quan tâm, đặc biệt là những nghiên cứu, thảo luận liên quan đến sự lão hóa. Nguyên nhân chính gây ra quá trình lão hóa là do các gốc tự do phân hủy tế bào cơ thể gây ra các bệnh liên quan đến tim mạch, gan, thần kinh, nội tiết, thận,... gây tổn hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người [35]. Gốc tự do làm tổn thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các acid béo dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào [11]. Tuy nhiên, các gốc tự do này có thể bị phân hủy bởi các chất oxy hóa nội sinh trong cơ thể con người và các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên là các thực phẩm như rau củ, trái cây tươi và một số loại dược liệu [8]. Ngoài ra, có nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp đã được nghiên cứu và đang được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, các chất chống oxy hóa tổng hợp gần đây không còn được ưa chuộng vì các tác dụng có hại được quan sát như độc tính đối với con người, khả năng gây ung thư và gây ô nhiễm môi trường [6]. Do đó, trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các hợp chất kháng oxy hóa trong tự nhiên đang được đẩy mạnh và nhận được nhiều sự quan tâm. Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) là một loài thực vật thuộc chi Gừng đen (Distichochlamys), họ Gừng (Zingiberaceae) là một loài gừng đặc hữu tại Việt Nam mới được phát hiện [1]. Họ Gừng là một họ cây phổ biến ở Việt Nam với nhiều công dụng khác nhau. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra các tính chất dược lý vượt trội của một số hợp chất tồn tại trong các cây họ Gừng. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và các tác dụng sinh học của loài D. orlowii. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu thêm về các thành phần hóa học và các hoạt tính của loài D. orlowii là rất cần thiết. Chính vì vậy, với mục đích nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật, định lượng một số hợp chất và xác định khả năng chống oxy hóa từ củ và rễ của cây D.orlowii nhằm củng cố và cung cấp thêm các thông tin khoa học có giá trị và tin cậy về hoạt tính sinh học; từ đó giúp cho việc khai thác sử dụng 1
cây làm nguồn dược liệu trong thực tế có hiệu quả hơn, chúng em đã lựa chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)” với những mục tiêu sau: 1. Khảo sát hàm lượng flavonoid, polyphenol và thành phần của tinh dầu có trong cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii. 2. Đánh giá sơ bộ hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii. 2
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa [21], chi Distichochlamys có vị trí phân loại như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheophyta) Ngành: Thực vật có hoa/ Ngành Ngọc lan/ Hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Liliopsida Bộ: Zingiberales Họ: Zingiberaceae Chi: Distichochlamys 1.1.2. Đặc điểm phân bố Giống gừng nhỏ Distichochlamys MF Newman là một chi đặc hữu của Việt Nam thuộc họ Zingiberaceae, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1995 bởi Newman [26]. Chi Distichochlamys ở Việt Nam đã xác định được bốn loài phân bố ở một số nơi. D. citrea MF Newman còn được gọi là Gừng đen, là loài Distichochlamys đầu tiên được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam (Newman 1995; Nguyen and Leong-Škorničková 2012). Sự xuất hiện của D. citrea cũng đã được báo cáo ở các vùng khác của Việt Nam, bao gồm Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam và Nghệ An [38]. D. orlowii K. Larsen & MF Newman phân bố ở một khu vực hạn hẹp thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam [21]. D. rubrostriata WJKress & Rehse phân bố ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam và Vườn Quốc gia Cúc Phương [30]. 3
D. benenica phân bố ở Vườn quốc gia Bến En, Huyện Như Thanh, Tỉnh Thanh Hóa, Việt Nam [27]. 1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii 1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái Distichochlamys orlowii là một loài thực vật có hoa thuộc chi Distichochlamys, họ Gừng. Loài này được K. Larsen & M.F. Newman mô tả khoa học đầu tiên năm 2001, tên Việt Nam là gừng orlow hay gừng đen lá tím [1]. Nó phân bố ở một khu vực hạn hẹp thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam [21]. D. orlowii là cây chịu bóng, sống dưới tán rừng thường xanh ở độ cao trung bình khoảng 350 – 400 m so với mực nước biển. Các loài cây họ Gừng chủ yếu ưa độ ẩm cao và phát triển tốt hơn ở điều kiện chiếu sáng thấp nên chúng thường được phát hiện ở các khu vực ven suối, rừng nguyên sinh, rừng thứ sinh và các trảng cây bụi [1]. 1.2.2. Đặc điểm thực vật D. orlowii là loài thực vật có hoa, thân rễ thuộc chi Gừng đen (Distichochlamys) trong họ Gừng (Zingiberaceae). Thân rễ leo, dài 8 – 10 mm, màu đỏ; khi khô chuyển sang màu nâu [20]. Lá mọc thẳng từ thân rễ; bẹ lá dài 4 – 7 cm, mép mỏng, hơi đỏ. Lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới đỏ tím sẫm. Cuống lá dài 15 – 20 cm, khía 4 mm, màu xanh lục, có rãnh ở mặt lưng. Phiến lá rộng, hình elip, nhẵn ở cả hai mặt. Gân chính ở giữa, mỗi bên của gân chính có 12 – 18 gân nhỏ nổi rõ ở trên song song nhau. Gân lá bậc hai và bậc ba mỏng hơn, kích thước 15 – 27 x 8,5 – 13 cm [19]. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 4 hằng năm. Cụm hoa đơn tính mọc từ các bẹ lá phía dưới. Cuống hoa dài 1 cm. Lá bắc lớn áp vào chùm hoa, màu xanh lục với mép đỏ, dài 30 – 40 x 8 – 10 mm, mỗi lá bắc phụ có một lá mầm với 2 – 3 hoa màu vàng. Lá bắc có màng, hình ống, kích thước 25 – 30 x 8 – 10 mm. Noãn dài 3 – 4 mm. Đài hoa hình ống dài 10 mm, đỉnh có 3 răng cưa. Ống tràng hoa dài 30 mm, rộng 3 mm, ở đỉnh tràng hoa có thùy 10 mm [19, 30]. Bao phấn hoa màu vàng, dạng sợi dài 4 mm, không phủ lông tuyến. Các nhị bên rộng dưới 6 mm, màu vàng thuần; 4
cánh hoa màu vàng với các vân tím và các dải ở giữa màu vàng sẫm [19, 30, 38]. Quả và hạt không xác định [19]. Hình 1.1. Hình ảnh loài Gừng đen lá tím (D. orlowii) 1.2.3. Thành phần hóa học Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây D. orlowii còn rất hạn chế và chưa được nghiên cứu nhiều. Năm 2017, bằng kỹ thuật sắc ký khí ngọn lửa ion hóa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS), Lê Thị Hương và cộng sự đã xác định được các thành phần hóa học của tinh dầu chưng 5
cất từ thân rễ của cây D. orlowii thu thập từ Vườn quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Nghiên cứu này đã định lượng được một lượng đáng kể các hydrocarbon monoterpene (23,9%), monoterpen oxy hóa (29,4%), hydrocarbon sesquiterpene (33,7%), sesquiterpenes oxy hóa (11,2%) và xuất hiện một lượng diterpenes rất nhỏ (0,3%). Người ta quan sát thấy rằng geranyl axetat (16,5%), β-elemene (9,2%), β-pinene (9,0%) và β-caryophyllene (7,9%) là các thành phần chủ yếu của D. orlowii. Bên cạnh đó có các hợp chất định tính khác bao gồm α-humulene (4,9%), (Z) -citral (4,6%), bicyclogermacrene (3,6%), γ- gurjunene (3,4%), linalool (3,1%) và limonene (3,1% ),… [9] 1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý Zingiberaceae là một họ cây chứa nhiều tinh dầu nên hầu hết các loài cũng như các bộ phận trong cùng một loài đều có sự tích lũy tinh dầu; do đó có giá trị sử dụng là cây cho tinh dầu [1]. Hiện nay, các hiểu biết về loài Distichochlamys orlowii còn rất là sơ khai. Các thành phần hóa học trong thân rễ của cây có nhiều tiềm năng về tác dụng dược lý. Geranyl acetate có tác dụng chống viêm, chống nấm mạnh mẽ [13]. Các thử nghiệm in vitro cho thấy β-elemene hoạt động như một chất ức chế Rhokinase [40] và có tác dụng chống tăng sinh đối với một số loại tế bào ung thư [43]; từ đó cho thấy tiềm năng cao sử dụng trong hóa trị liệu. β- Caryophyllene đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm liên quan đến hoạt động của thụ thể cannabinoid loại 2 [3]. Citral cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm [28]. Citral đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa, ngừa ung thư, kháng khuẩn và tẩy giun sán [16]. β-linalool được nghiên cứu là có khả năng hỗ trợ hoạt động chống oxy hóa, giảm độc tế bào… [18] 1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa 1.3.1. Gốc tự do 1.3.1.1. Khái niệm Khái niệm về gốc tự do (Free Radical) được đề xướng lần đầu tiên vào năm 1954 trong luận thuyết về sự lão hóa (Free Radical Theory of Aging) [14]. Một gốc tự do là một nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử (electron) hóa 6
trị lẻ. Như vậy, gốc tự do là các mảnh phân tử ( •OH...), phân tử ( •NO, •NO2, CO2-•...), nguyên tử tự do ( •Cl, •Br..) hay ion ( O2•-...) trung tính hay mang điện tích, có lớp điện tử ngoài cùng chứa một điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc). Chúng có thể mang điện tích dương, âm hoặc không mang điện và cả ba loại này đều giữ vai trò quan trọng trong hệ thống sinh học. Do có điện tử không ghép cặp ở lớp ngoài cùng nên gốc tự do rất không ổn định về cả năng lượng cũng như điện học. Chúng luôn có xu hướng lấy điện tử từ các nguyên tử hay phân tử khác để trở về trạng thái ổn định, nhưng lại biến các nguyên tử, phân tử này thành gốc tự do. Phản ứng dây chuyền tiếp diễn làm cấu trúc và chức năng của các thành phần tế bào bị phá hủy dẫn tới sự lão hóa, nếu nặng tế bào sẽ bị chết [11]. 1.3.1.2. Nguồn sinh gốc tự do Các gốc tự do luôn luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau, từ chính cơ thể sinh vật sinh ra hay từ các yếu tố như môi trường, khói bụi ô nhiễm, thức ăn độc hại, thuốc lá ... Vì vậy, gốc tự do được chia thành hai loại chính là gốc tự do nội sinh và ngoại sinh [15]. Gốc tự do nội sinh Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được hình thành do những quá trình chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể. Chẳng hạn như trong chuỗi chuyển điện tử của hô hấp tế bào, một số điện tử có thể bị rò rỉ. Sau đó, chúng tương tác với oxy và hình thành nên gốc superoxide. Khoảng 2 – 5% oxy sử dụng cho trao đổi chất hiếu khí trong ty thể chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species – ROS). Bên cạnh đó, quá trình thực bào của các tế bào bạch cầu khi có các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể cũng sinh ra các gốc tự do thông qua việc hoạt hóa enzyme NADPH oxidases ở màng bạch cầu. Enzyme này xúc tác cho phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do superoxide O2•-, từ đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể [41]. Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể còn có thể tham gia vào các phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân giải lipid hydroperoxide tạo gốc tự do peroxide. Sau đó, gốc tự do này tham gia vào phản ứng dây chuyền 7
peroxide hóa lipid gây hại cho cơ thể. Ngoài ra, việc vận động gắng sức cũng phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim [41]. Gốc tự do ngoại sinh Gốc tự do ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ. Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật với một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ. Vì nước chiếm tới 55 – 60% cơ thể nên khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa. Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động. Sau đó, một chuỗi phản ứng 3 bước xảy ra. Nước được chuyển thành gốc hydroxy (-OH), hydrogen peroxide (H₂O₂), gốc superoxide (O₂•-), oxygen phân tử (O2). Gốc hydroxy rất hoạt động, có thể di chuyển electron ở bất kỳ phân tử nào nằm trên đường đi của nó, chuyển phân tử này thành tự do và vì vậy hoạt hóa một chuỗi phản ứng tiếp tục. Hydrogen peroxide nguy hiểm với DNA hơn là gốc hydroxy vì khả năng hoạt động của H2 hơn - OH nên H2O2 có đủ thời gian di chuyển vào nhân, rồi sau đó tiến hành phá hủy các đại phân tử DNA [36]. 1.3.1.3. Ảnh hưởng của gốc tự do đến cơ thể Lợi ích của gốc tự do Gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất melanine cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, làm cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, sự co bóp của cơ xương dễ dàng hơn. Gốc tự do được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể. Ở nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hòa phân ly tế bào; kích hoạt các yếu tố phiên mã cho gene tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm và điều hòa biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme kháng oxy hóa [42]. 8
Tác hại của gốc tự do Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng. Nhưng khi tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần so với người trẻ. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan [35]. Gốc tự do thường xảy ra trong quá trình chuyển hóa. Đôi khi chính hệ miễn dịch của cơ thể cũng tạo ra gốc tự do để tiêu diệt virus và vi khuẩn. Tuy nhiên, gốc tự do gây lo ngại nhất là những gốc tự do được hình thành do sự ô nhiễm môi trường, phóng xạ, khói thuốc, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ,... [15] Gốc tự do là nguyên nhân phá vỡ màng tế bào khiến dinh dưỡng thất thoát. Tế bào không tăng trưởng, phát triển rồi dẫn đến chết. Mặt khác, những gốc tự do tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da tạo những vết đồi mồi trên mặt, bàn tay. Những gốc tự do cũng ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào, gây đột gene ở nhiễm sắc thể, DNA, RNA; làm chất collagen, elastin mất sự đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [37]. Gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme, khiến cơ thể không tăng trưởng được. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào [10]. 1.3.2. Chống oxy hóa 1.3.2.1. Khái niệm về chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa (hay chất kháng oxy hóa) là chất trực tiếp hoặc gián tiếp ngăn cản, trung hòa, loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do với cơ thể. Những chất kháng oxy hoá ngoài tác dụng trung hoà các gốc tự do bằng cách 9
nhường một điện tử của mình cho chúng, qua đó có thể cắt đứt phản ứng dây chuyền, ngăn chặn tổn thương DNA do các độc chất gây ra; chúng còn có thể khống chế sự phát triển của các tế bào ung thư [7]. 1.3.2.2. Phân loại chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa nội sinh Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có 2 loại là các chất có bản chất là enzyme và các chất không phải enzyme. Chúng đều có tác dụng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa nội sinh không phải là enzyme được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu đến từ thực phẩm bổ sung [8]. Các nhóm chất như flavonoid, carotenoid... đến từ thực vật có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Các chất chống oxy hóa nội sinh có thể tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng với nhau để chống lại các gốc tự do. Nhờ vậy mà quá trình oxy hóa trong cơ thể chỉ xảy ra ở mức độ nhất định, duy trì được cân bằng trao đổi chất. Hiện nay, các nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới trong thảo dược có thể hỗ trợ điều trị các bệnh có liên quan đến sự oxy hóa trong cơ thể đang nhận được nhiều sự quan tâm. Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh Bản chất là enzyme Không phải enzyme Catalase Vitamin A, vitamin C, vitamin E Superoxide dismutase Glutathione Coenzyme Q10 peroxidase Hợp chất chứa nitơ (non-protein): acid Glutathione reductase uric Glucose – 6 phosphate dehydrogenase Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật Một số thực phẩm, đặc biệt là các thực vật, rất giàu chất chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Trong đó, đáng chú ý nhất là các dẫn xuất của phenol và các vitamin. - Vitamin A: 10
Vitamin A chỉ có trong thức ăn từ nguồn động vật, đặc biệt có nhiều trong gan cá, gan, thận các động vật có sừng, trong bơ, sữa, lòng đỏ trứng,... Còn carotene (tiền chất của vitamin A) có trong các phần xanh của cây, trong rau quả có màu vàng đỏ như carot, cà chua, ớt, quả mơ, quả gấc, bí đỏ,.... Các caroten nhờ có hệ kết nối luân phiên trên mạch cacbon dài, một phân tử caroten có thể hấp thu năng lượng của hàng ngàn phân tử O2 rồi giải phóng năng lượng dưới dạng nhiệt vô hại [39]. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A Acid ascorbic (Vitamin C) có trong tất cả tế bào sống động vật cũng như thực vật. Vitamin C cần cho sự tạo thành collagen, tham gia trong một số phản ứng oxy hoá khử. Vitamin C tham gia trong quá trình chuyển hoá phenilalamine, tyrosine, acid folic, norepinephrine, histamine, sắt và một số hệ thống enzyme chuyển hoá thuốc [20]. Vitamin C còn có tính chất kháng oxy hóa ở môi trường nước như loại hydrogen peroxide, loại bỏ các gốc tự do superoxide (O2•- ), gốc hydroxy (•-OH) và chặn đứng các phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc tự do. Vitamin C có khả năng vô hoạt gốc tự do vì có thể chuyển hai hydro cho các gốc tự do và chuyển thành dehydroascorbic [20, 25]. - Vitamin E: Vitamin E là chất kháng oxy hoá hoà tan trong lipid và phân bố rộng khắp tế bào, được coi như chất bảo vệ của màng sinh học vì nó ngăn cản quá trình oxy hoá các acid béo chưa bão hoà của màng. Vitamin E có nhiều trong mầm ngũ cốc (lúa mạch), mầm đậu tương, giá đỗ, các loại dầu thực vật, xà lách, rau xanh, cà chua, gan động vật, lòng đỏ trứng [5]... 11
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E Cơ chế kháng oxy hóa: Vitamin E bị oxy hóa, trở thành gốc tocopherol không bền vững và bị bẻ gãy dị vòng tạo nên tocopherol quinone. Đây không phải là chất kháng oxy hoá trong cơ thể sống và không biến đổi trở lại thành vitamin E [5, 22]. Vitamin E có thể liên kết với phần hydrocarbon của acid béo chưa bão hoà nhiều nối đôi và vì vậy tiếp cận gần vị trí của quá trình peroxide hoá, những phản ứng chuỗi gốc tự do. - Flavonoid: Flavonoid là một nhóm các hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol, flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone và flavones. Các nhóm hydroxyl phenolic của flavonoid có cấu trúc vòng, có đặc tính chống oxy hóa, hoạt động như các chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide và tạo phức chelat. Chúng cũng kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, giảm các gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử, giảm nitro hóa, tăng mức acid uric và các phân tử trọng lượng phân tử thấp. Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao là catechin, catechin-gallate, quercetin, kaempferol, genistein trong đậu nành [8, 15]. Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng có tác dụng chống oxy hóa như acid phenolic, lingin, carotenoid... Các chất chống oxy hóa tổng hợp Các chất chống oxy hóa tổng hợp đã được chiết xuất trong phòng thí nghiệm để sử dụng trong hệ thống đo lường tiêu chuẩn chống oxy hóa, so sánh với các chất chống oxy hóa tự nhiên và sử dụng trong ngành thực phẩm. Bảng 1.2 biểu thị các chất chống oxy hóa tổng hợp quan trọng nhất và có sẵn rộng rãi cũng như công dụng của chúng; cho thấy trọng tâm chính của chất chống oxy hóa tổng hợp là ngăn ngừa quá trình oxy hóa thực phẩm, đặc biệt là acid 12