Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Emodin và 2,3,5,4’-Tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside trong Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

47
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM và THSG trong HTOĐ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng; ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng EM và THSG trong một số mẫu HTOĐ trên thị trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Emodin và 2,3,5,4’-Tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside trong Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC -------o0o------- MÀO TƯỜNG VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ 2,3,5,4’-TETRAHYDROXYSTILBEN-2-O-β-D-GLUCOSIDE TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP BỘ PHẬN PHÁT HIỆN ĐA SÓNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC MÀO TƯỜNG VY XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ 2,3,5,4’-TETRAHYDROXYSTILBEN-2-O-β-D-GLUCOSIDE TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP BỘ PHẬN PHÁT HIỆN ĐA SÓNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: ThS. BÙI THỊ THƯƠNG TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI – 2021
LỜI CẢM ƠN Nhân dịp khóa luận được hoàn thành tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: ThS. Bùi Thị Thương – Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. TS. Nguyễn Thị Thanh Bình – Chủ nhiệm Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dạy tôi nhiều kiến thức bổ ích và đưa ra những lời nhận xét, góp ý giúp tôi hoàn thiện khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, các Phòng ban Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Trường vì những kiến thức đã dạy tôi trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Trường. Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.20.03). Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như trong học tập để tôi có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Mào Tường Vy
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Bộ phận phát hiện đa sóng (Diode Array Detector) DĐHK Dược điển Hồng Kông DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam EM Emodin EtOH Ethanol HDL Lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HTOĐ Hà thủ ô đỏ ICH Hội nghị quốc tế về hài hòa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MeOH Methanol MPP+ 1-methyl-4-phenylpyridinium PE Polyetylen RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TC Cholesterol toàn phần (Total cholesterol) TG Triglycerid THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside UV-VIS Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet-Visible)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Các nghiên cứu định lượng EM và THSG bằng phương pháp HPLC . 9 Bảng 2. 1. Thông tin về các mẫu Hà thủ ô đỏ sử dụng trong nghiên cứu ........... 12 Bảng 3. 1. Chương trình gradient 1 đối với pha động ACN : H2O...................... 20 Bảng 3. 2. Thông số của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 254 nm ................................................................................ 21 Bảng 3. 3. Thông số của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 320 nm ................................................................................ 22 Bảng 3. 4. Chương trình gradient 2 đối với pha động ACN : H2O...................... 23 Bảng 3. 5. Thông số của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm ................................................................................ 23 Bảng 3. 6. Thông số của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 322 nm ................................................................................ 24 Bảng 3. 7. Thông số các pic của dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml và THSG 50 µg/ml tại điều kiện sắc ký tối ưu ..................................................................... 26 Bảng 3. 8. Thông số các pic của mẫu thử tại điều kiện sắc ký tối ưu .................. 27 Bảng 3. 9. Thông số các pic của mẫu thử thêm chuẩn tại điều kiện sắc ký tối ưu .............................................................................................................................. 28 Bảng 3. 10. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của EM ............................................................................................ 29 Bảng 3. 11. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của THSG ........................................................................................ 30 Bảng 3. 12. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi đối với EM..................................... 34 Bảng 3. 13. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi đối với THSG ................................ 34 Bảng 3. 14. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với EM ............... 35 Bảng 3. 15. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với THSG .......... 35 Bảng 3. 16. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với EM ........................................................................................................................ 36 Bảng 3. 17. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với THSG ................................................................................................................... 37 Bảng 3. 18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết.............................. 38 Bảng 3. 19. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ................................ 39 Bảng 3. 20. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết ................................... 40 Bảng 3. 21. Kết quả định lượng EM và THSG trong 5 mẫu Hà thủ ô đỏ............ 41
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1. Cây Hà thủ ô đỏ ra hoa (A) Các dạng củ và lát cắt của Hà thủ ô đỏ (B) ................................................................................................................................ 3 Hình 1. 2. Công thức cấu tạo của EM và THSG.................................................... 4 Hình 3. 1. Sắc ký đồ của dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 254 nm .................................................................................................. 20 Hình 3. 2. Phổ hấp thụ UV-VIS của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml .................................................................................................................... 21 Hình 3. 3. Sắc ký đồ của dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 320 nm .................................................................................................. 21 Hình 3. 4. Phổ hấp thụ UV-VIS của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml .................................................................................................................... 22 Hình 3. 5. Sắc ký đồ của dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm .................................................................................................. 23 Hình 3. 6. Sắc ký đồ của dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 322 nm .................................................................................................. 24 Hình 3. 7. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml và THSG 50 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm (A) và 322 nm (B).................................. 25 Hình 3. 8. Sắc ký đồ của mẫu trắng tại các bước sóng phát hiện 290 nm (C) và 322 nm (D) .................................................................................................................. 26 Hình 3. 9. Sắc ký đồ của mẫu thử tại các bước sóng phát hiện 290 nm (E) và 322 nm (F) ................................................................................................................... 27 Hình 3. 10. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tại các bước sóng phát hiện 290 nm (G) và 322 nm (H) ................................................................................................ 28 Hình 3. 11. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của EM ........................................................................................................... 30 Hình 3. 12. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của THSG ....................................................................................................... 31 Hình 3. 13. Sắc ký đồ của EM tại LOD (S/N=2,6) .............................................. 32 Hình 3. 14. Sắc ký đồ của EM tại LOQ (S/N=10,2) ............................................ 32 Hình 3. 15. Sắc ký đồ của THSG tại LOD (S/N=2,8) ......................................... 33 Hình 3. 16. Sắc ký đồ của THSG tại LOQ (S/N=9,7) ......................................... 33
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN............................................................................... 2 1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố và bộ phận dùng ................................................. 2 1.2. Thành phần hóa học ........................................................................................ 3 1.3. Công dụng và tác dụng sinh học ..................................................................... 5 1.4. Độc tính ........................................................................................................... 7 1.5. Các phương pháp định lượng EM và THSG trong Hà thủ ô đỏ ..................... 8 1.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng ... 10 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 12 2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 12 2.2. Hóa chất......................................................................................................... 12 2.3. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................... 13 2.4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 13 2.4.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn................................................................ 13 2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ....................................................................... 14 2.4.3. Thẩm định quy trình định lượng ............................................................ 15 2.4.3.1. Thẩm định tính đặc hiệu ................................................................. 15 2.4.3.2. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị ........................ 16 2.4.3.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ...................... 16 2.4.3.4. Thẩm định độ đúng ......................................................................... 16 2.4.3.5. Thẩm định độ chính xác .................................................................. 16 2.4.3.6. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu ................................................... 17 2.4.4. Định lượng EM và THSG trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ ..................... 19 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 19 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .......................... 20
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký .............................................................................. 20 3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện................................................................ 20 3.1.2. Xác định chương trình rửa giải .............................................................. 22 3.2. Thẩm định quy trình định lượng ................................................................... 25 3.2.1. Thẩm định tính đặc hiệu......................................................................... 25 3.2.2. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị ............................... 29 3.2.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.............................. 31 3.2.4. Thẩm định độ đúng ................................................................................ 33 3.2.5. Thẩm định độ chính xác ......................................................................... 34 3.2.6. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu .......................................................... 37 3.3. Định lượng EM và THSG trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ ............................ 41 3.4. Bàn luận......................................................................................................... 43 CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 47 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 47 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................
MỞ ĐẦU Hà thủ ô đỏ (HTOĐ) có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, được phân bố rộng rãi trên thế giới, tập trung nhiều ở các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản. Ở Việt Nam, HTOĐ đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trong y học cổ truyền với tác dụng bổ huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng, làm đen râu tóc, kéo dài tuổi thọ,... [2] Xét về thành phần hóa học, emodin (EM) và 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben- 2-O-β-D-glucoside (THSG) được xác định là chất đánh dấu hóa học của HTOĐ trong Dược điển Trung Quốc (DĐTQ) (2015) [10], Dược điển Hồng Kông (DĐHK) (2008) [9],… cũng như trong nhiều công bố quốc tế [12,15,27]. Hai hoạt chất này đều có nhiều tác dụng dược lý đã được chứng minh như tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống viêm, chống tăng lipid máu, điều hòa miễn dịch [12,19]. Tại Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng HTOĐ chỉ dừng ở mức đạt theo các chuyên luận Dược điển Việt Nam (DĐVN) V với quy định hàm lượng chất chiết được trong ethanol (EtOH) 30% và hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo EM và physcion (PS)) [2]. Do đó, nhiều hoạt chất chính có trong HTOĐ chưa được đánh giá dẫn đến chất lượng chưa đảm bảo. Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần hóa học chính có trong HTOĐ là hết sức cần thiết, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu này ở Việt Nam chặt chẽ hơn. Trên cơ sở đó, đề tài này được tiến hành với hai mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM và THSG trong HTOĐ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng. 2. Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng EM và THSG trong một số mẫu HTOĐ trên thị trường. 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố và bộ phận dùng HTOĐ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, hay Polygonum multiflorum (Thunb.), thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales). Ngoài ra, dược liệu còn có tên gọi khác như: Dạ giao đằng, Dạ hợp, Địa tinh,… [1,3] Cây HTOĐ là một loại dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm. Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau. Mặt ngoài thân có màu xanh tía có những vân hoặc bì khổng lồ, mặt thân nhẵn, không có lông. Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống củ khoai lang. Lá mọc so le, có cuống dài. Phiến lá hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 3-4 cm, đầu nhọn, phía cuống lá hình tim hoặc hình mũi tên, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhẵn và không có lông [1,3]. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, hoa nhỏ nhiều, đường kính 2 mm, có cuống ngắn 1-3 mm. Cánh hoa màu trắng. Nhị 8 với 3 nhị hơi dài hơn. Bầu hình 3 cạnh, vòi ngắn gồm 3 cái rời nhau, nuốm hình mào gà, rủ xuống. Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng. Mùa hoa tháng 9-11; mùa quả tháng 12-2 hàng năm [1,3]. Ở Việt Nam, HTOĐ mọc hoang ở rừng núi, nhiều nhất là các tỉnh phía Tây Bắc như Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La sau đến các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hòa Bình… HTOĐ là loại cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng. Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dưới 20oC. Ngoài ra cây còn mọc ở các nước khác như Trung Quốc (Giang Tô, Quảng Đông, Tứ Xuyên, Hồ Bắc), Nhật Bản, Ấn Độ [1,3]. Bộ phận dùng là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây HTOĐ. Thu hoạch cây thường tiến hành vào mùa thu hoặc mùa xuân. Đào về rửa sạch đất, bổ đôi hay bổ tư, đồ rồi phơi khô, có nơi không đồ mà phơi ngay, nếu muốn có hà thủ ô miếng thì hái về còn tươi, đem thái ngay, đồ chín rồi phơi hoặc đồ chín rồi mới thái và phơi [3]. 2
A B Hình 1. 1. Cây Hà thủ ô đỏ ra hoa (A) Các dạng củ và lát cắt của Hà thủ ô đỏ (B) 1.2. Thành phần hóa học Thành phần hóa học của rễ HTOĐ đã được xác định qua rất nhiều nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt ở Trung Quốc. Hơn 103 hợp chất hóa học được tìm thấy trong rễ củ HTOĐ, trong đó một số nhóm hợp chất chính đã được xác định gồm: stilben, quinon, flavonoid [17,19]. Ở Việt Nam, theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2007) HTOĐ chứa 1,7% anthraquinon; 1,1% protein; 45,2% tinh bột; 3,1% lipid; 4,5% chất hữu cơ; 26,4% các chất tan trong nước [1]. − Nhóm stilben: Stilben là nhóm hoạt chất chính có nhiều trong rễ củ HTOĐ, bao gồm: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside (THSG), 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben -2-O-β-D-(2''-O-monogalloyl estes)-glucopyranosid, 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben- 2-O-β-D-(3''-O-monogalloyl estes)-glucopyranosid, polydatin, rhaponticosid, 2,3,5,4′-tetra-2-O-(6''-O-acetyl)-β-D-glucopyranosid và polygonumosid A, B, C, D [16,20]. Trong đó THSG đã được quy định là chất đánh dấu hóa học cho HTOĐ trong DĐTQ (2015) với yêu cầu hàm lượng THSG không được thấp hơn 1% (tính theo dược liệu khô kiệt) [10]. − Nhóm quinon: 3
Quinon là thành phần hóa học đặc trưng khác trong rễ củ của HTOĐ, các hoạt chất chủ yếu thuộc nhóm anthraquinon [17,19]. Nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) đã thống kê các anthraquinon loại EM trong HTOĐ bao gồm: emodin, aloe-emodin, chrysophanol, physcion, emodin-3-methyl ether, emodin-6,8- dimethylether…[17]. Ngoài ra, các anthraquinon dạng kết hợp cũng được chỉ ra trong một số nghiên cứu khác gồm có emodin-8-O-D-glucopyranosid, emodin-3- methyl ether-8-O-D-glucopyranosid, physcion-8-O-β-D-glucopyranosid [14]… Hiện nay, DĐTQ (2015) [10] và DĐVN V (2018) [2] đều quy định dược liệu HTOĐ phải chứa không dưới 0,1% anthraquinon kết hợp, tính theo tổng hàm lượng của EM và PS (tính theo dược liệu khô kiệt). EM THSG Hình 1. 2. Công thức cấu tạo của EM và THSG − Nhóm flavonoid: Nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) đã chỉ ra các hợp chất thuộc nhóm flavonoid trong rễ củ HTOĐ bao gồm: tricin, rutin, quercetin, kaempferol, apigenin…[17]. − Các hợp chất khác: Ngoài các hợp chất đã nêu ở trên, HTOĐ còn chứa các hợp chất phenolic (bao gồm catechin, acid gallic, methyl gallat,…), các hợp chất có chứa nitơ và hợp chất coumarin glucosid [17]. 4
1.3. Công dụng và tác dụng sinh học Theo y học cổ truyền Việt Nam, HTOĐ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính ấm có tác dụng bổ máu, chữa thận suy, gan yếu, thần kinh suy nhược, mạnh gân xương, nhuận tràng, uống lâu làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng [1]. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, HTOĐ sống tươi và khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, chữa táo bón cho phụ nữ sau đẻ hoặc người già, mụn nhọt. HTOĐ chế có tác dụng bổ gan thận, dùng làm thuốc an thần, thuốc bổ và tăng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, mất ngủ, kích thích tạo hồng cầu và bạch cầu trong các bệnh về máu…Ở Ấn Độ, rễ HTOĐ được dùng làm thuốc bổ, làm đen tóc, ngoài ra còn có tác dụng đối với bệnh tăng đường máu [1]. Theo y học hiện đại, các nghiên cứu cho thấy HTOĐ có nhiều tác dụng sinh học khác nhau, bao gồm tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống viêm, chống tăng lipid máu, điều hòa miễn dịch, chống ung thư: − Tác dụng bảo vệ thần kinh: HTOĐ cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh thông qua hoạt động của EM và THSG. Nghiên cứu của Ahn và cộng sự (2016) tiến hành trên chuột thực nghiệm đã chứng minh được EM trong dịch chiết HTOĐ có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh chống lại độc tính do glutamate gây ra [6]. Trong khi đó, nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) cũng cho thấy THSG có khả năng ngăn ngừa độc tính, giảm tổn thương tế bào thần kinh trên cả in vitro và in vivo. Cụ thể, THSG bảo vệ các tế bào SH-SY5Y chống lại độc tính thần kinh bắt nguồn từ MPP+ (một chất độc đặc hiệu của tế bào thần kinh dopaminergic), góp phần làm giảm các triệu chứng của bệnh Parkinson [17]. − Tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa: Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2018) với dịch chiết nước ấm của HTOĐ cho thấy tác dụng chống oxy hóa trên cả in vitro và in vivo. Cụ thể, trên in vitro, HTOĐ làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GPx); trên in vivo, HTOĐ có khả năng thu dọn và làm giảm hoạt động của các gốc tự do, từ đó góp phần làm giảm quá trình lão hóa của con người [7]. 5
− Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm của HTOĐ chủ yếu thông qua hoạt động của EM và THSG. Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007) trên chuột thực nghiệm cho thấy THSG trong dịch chiết từ rễ củ HTOĐ có tác dụng chống viêm bằng cách ức chế enzym COX-2 trong tế bào đại thực bào [30]. Ngoài ra, Zeng Cheng và cộng sự (2011) đã chứng minh THSG là hợp chất dẫn đầu trong điều trị bệnh viêm đường ruột nhờ khả năng ức chế các chất trung gian gây viêm TNF-α, IL-6 và COX-2 [29]. Mới đây, Tsai và công sự (2018) đã chỉ ra tác dụng chống viêm xương khớp của THSG bằng cách sử dụng mô hình in vitro và in vivo. Cụ thể, THSG ức chế sản xuất oxit nitric và prostaglandin E₂ làm giảm phù chân và cải thiện trọng lượng cơ thể [24]. Trong nghiên cứu khác của Lin và cộng sự (2015) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM có tác dụng làm giảm viêm tuyến vú do nội độc tố lipopolysaccharid gây ra, giảm sự biểu hiện và nồng độ của các chất gây viêm như TNF-α, IL-6, IL-1β tùy thuộc liều lượng [17]. − Tác dụng làm giảm các yếu tố gây bệnh tiểu đường type 2: Nghiên cứu của Feng Ying và cộng sự (2010) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM là một chất ức chế mạnh và có chọn lọc enzym 11β-HSD1 (một enzym đóng vai trò quan trọng trong tiến triển của bệnh béo phì, kháng insulin và bệnh tiểu đường type 2), do đó cải thiện độ nhạy insulin và tăng chuyển hóa lipid, đồng thời làm hạ đường huyết [11]. Thử nghiệm khác của Tang và cộng sự (2017) trên chuột thực nghiệm cho thấy THSG cũng có tác dụng làm hạ đường huyết và cải thiện tình trạng không dung nạp glucose và kháng insulin [23]. − Tác dụng điều hòa miễn dịch: Tác dụng điều hòa miễn dịch của HTOĐ chủ yếu do các polysaccharid và anthraquinon glycosid có trong dược liệu [17]. Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2012) đã cho thấy khi sử dụng một phần polysaccharid được tinh chế từ HTOĐ làm tăng nồng độ IL-2 trong huyết thanh, tăng cường các thành phần chống oxy hóa, thúc đẩy quá trình tạo máu của tế bào B, T và đại thực bào [8]. Sun và cộng sự (2006) đã tiến hành một thử nghiệm in vitro để đánh giá ảnh hưởng của anthraquinon glycosid lên chức năng miễn dịch tế bào của chuột, kết quả cho thấy hợp chất này đã làm tăng sinh tế bào lympho T, lympho B, cải thiện hoạt động thực bào và đại thực bào [22]. 6
− Tác dụng chống ung thư: Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2011) chứng minh EM trong HTOĐ có tác dụng chống tăng sinh các tế bào ung thư tuyến tụy [18]. Trong nghiên cứu khác của Huang và cộng sự (2018) còn cho thấy EM có tác dụng tăng cường khả năng gây độc tế bào của các loại thuốc hóa trị liệu trong tế bào ung thư tuyến tiền liệt thông qua ức chế kháng đa thuốc [13]. − Tác dụng chống tăng lipid máu: Tác dụng chống tăng lipid máu của dược liệu này chủ yếu là nhờ một số thành phần như THSG, polysaccharid, anthraquinon. Nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) cho thấy THSG với liều 30 và 60 mg/kg/ngày, dùng đường uống trong 28 ngày có thể làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), giảm tỷ lệ cholesterol toàn phần/ cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (TC/HDL), tăng nồng độ cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), oxit nitric (NO) và superoxide dismutase (SOD) trong huyết thanh [17]. Nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (2014) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM, THSG, PS đều có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase – một enzym quan trọng trong quá trình tổng hợp TC và TG [26]. 1.4. Độc tính Nhìn chung, sử dụng HTOĐ đã qua chế biến là tương đối an toàn, trong khi HTOĐ chưa qua chế biến có thể gây độc tính trên gan, thận và các cơ quan khác. Tuy nhiên, cơ chế gây ra độc tính trên các cơ quan này vẫn chưa được chứng minh rõ ràng [17,19]. Các thảo dược thường gây ra độc tính thông qua hoạt động của các hợp chất hóa học hay các chất chuyển hóa trong quá trình chế biến. Qua một số nghiên cứu cho thấy thành phần gây độc chủ yếu trong HTOĐ là EM (Yu và cộng sự (2011)), THSG (Lin và cộng sự (2017)), tanin (Liu và cộng sự (2005)). Đáng chú ý gần đây, một số báo cáo chỉ ra rằng độc tính của HTOĐ có thể không phụ thuộc vào hàm lượng tuyệt đối của các dẫn xuất EM hay hàm lượng THSG mà phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối giữa hàm lượng EM và THSG. Nguyên nhân có thể do hàm lượng EM nhỏ nên không gây độc tính ở liều sử dụng [19]. Ngoài ra, Yu và cộng 7
sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của THSG đến sự hấp thu và chuyển hóa của EM, kết quả cũng cho thấy THSG có thể thúc đẩy quá trình hấp thu, ức chế quá trình chuyển hóa EM, dẫn đến tích tụ EM trong tế bào và gây ra độc tính trên gan [28]. Nguy cơ gây độc của HTOĐ còn ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác như kỹ thuật chế biến (thời gian chế biến, phụ liệu kết hợp, phương pháp xử lý mẫu), cách sử dụng (thời gian và liều dùng) [15,27]. Việc tuân thủ đúng quy trình chế biến và cách sử dụng HTOĐ là hết sức cần thiết để góp phần làm giảm độc tính, giảm tác dụng phụ, đảm bảo an toàn và mang lại hiệu quả điều trị. 1.5. Các phương pháp định lượng EM và THSG trong Hà thủ ô đỏ Hiện nay, nhiều quốc gia đã đưa chuyên luận dược liệu HTOĐ vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc [10], Hồng Kông [9], Việt Nam [2],… DĐTQ (2015) đã quy định sử dụng HPLC để định lượng THSG, EM và physcion trong rễ củ HTOĐ. Đối với chỉ tiêu định lượng, quy định hàm lượng anthraquinon kết hợp tính theo tổng hàm lượng của EM và PS không được thấp hơn 0,1% trong HTOĐ thô. Phương pháp định lượng là HPLC, thành phần pha động là methanol (MeOH) : nước (H2O) chứa 0,01% axit photphoric (80 : 20, tt/tt), detector UV 254 nm, tốc dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µl. Đối với chỉ tiêu định lượng THSG, quy định hàm lượng THSG không được thấp hơn 1,0% trong HTOĐ. Mẫu định lượng được xử lý bằng phương pháp chiết hồi lưu trong EtOH. Hệ dung môi pha động là acetonitril (ACN) : H2O (25:75), cột C18, detector UV 320 nm, tốc dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µl [10]. Nhược điểm của chuyên luận này là hai phương pháp khác nhau về thành phần pha động vì vậy không định lượng được đồng thời EM và THSG trong một lần phân tích. DĐHK (2008) quy định hàm lượng THSG là tiêu chí để đánh giá chất lượng HTOĐ. Mẫu định lượng được xử lý bằng phương pháp siêu âm với dung môi EtOH 50%. Phương pháp định lượng là HPLC rửa giải bằng ACN : H2O (17 : 83, tt/tt), tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử dụng cột ODS (4,6 x 250 mm), thể tích tiêm mẫu là 10 µl, bước sóng phát hiện 320 nm, thời gian phân tích là 27 phút. Tiêu 8
chuẩn định lượng hàm lượng là giới hạn của THSG không thấp hơn 2,2%. Nhược điểm của chuyên luận này là không đưa ra được phương pháp định lượng đồng thời EM và THSG mà chỉ quy định sử dụng phương pháp HPLC với các chất chuẩn được đưa vào đối chiếu trong định tính là THSG, EM, PS. Chương trình sắc ký định tính như sau: rửa giải bằng H2O (chứa 0,1% H3PO4): ACN (0 - 35 phút: 10 - 40; 35 - 55 phút: 40 - 100; 55 - 70 phút: 100:0); tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử dụng cột ODS (4,6 x 250 mm), bước sóng phát hiện là 290 nm [9]. Ở Việt Nam, chuyên luận HTOĐ trong DĐVN V chỉ quy định chỉ tiêu định lượng anthraquinon kết hợp (tính theo EM, PS) bằng phương pháp HPLC/UV. Điều kiện xử lý mẫu, điều kiện phân tích HPLC và mức hàm lượng quy định trong chuyên luận này tương tự chuyên luận HTOĐ trong DĐTQ (2015) [2]. Ngoài ra, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng EM và THSG trong HTOĐ. Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC định lượng EM và THSG được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1. 1. Các nghiên cứu định lượng EM và THSG bằng phương pháp HPLC Đối tượng Phương pháp xử TLTK Phương pháp phân tích phân tích lý mẫu Liang EM, HPLC-PDA, cột Alltima C18 (250 Chiết hồi lưu 0,3 g và cộng THSG, PS mm x 4,6 mm; 5 μm), rửa giải bằng mẫu thô với 50 ml sự ACN (chứa 0,1% axit fomic): H2O MeOH trong 2 giờ. (2012) (chứa 0,1% axit fomic) (0 phút: [16] 23:77; 20 phút: 70:30; 25 phút: 75:25; 35 phút: 100:0), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm vào cột là 20 μl, thời gian 35 phút. Wu và THSG, HPLC-DAD, cột hypersil C18 (250 Chiết siêu âm 0,2 g cộng sự EM, EG mm x 4,6 mm; 5 μm), rửa giải bằng mẫu thô (hoặc chế) CH3CN:H2O (0 phút: 10:90; 35 3 lần với 8 ml 9
(2012) phút: 40:60; 60 phút: 100:0), tốc độ aceton (hoặc nước), [27] dòng 1ml/phút, thể tích tiêm mẫu là mỗi lần 30 phút. 10 μl. Nguyễn THSG, HPLC/UV-VIS, pha đảo là cột Chiết hồi lưu 0,5 g Thị Hà resveratrol, Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 mẫu thô với 50 ml Ly và EM µm) và cột bảo vệ Supelguard EtOH 50% ở 700C cộng sự Ascentis C18 (20 mm x 4,0 mm, 5 trong 1 giờ. (2019) μm), rửa giải bằng ACN : H2O [4] (chứa 0,01% axit photphoric) (0 phút: 10:90; 5 phút: 30:70; 10 phút: 30:70; 15 phút: 70:30; 20 phút: 70:30; 25 phút: 100:0; 35 phút: 100:0; 40 phút: 10:90; 45 phút: 0:100), thể tích tiêm mẫu 10 μl, tốc độ dòng 1ml/phút, thời gian chạy là 45 phút. Như vậy, qua tham khảo DĐTQ (2015), DĐHK (2008) và các công trình nghiên cứu khác, nhận thấy mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và chưa đạt được điều kiện tối ưu về định lượng đồng thời, thời gian phân tích, lượng dung môi hóa chất, có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất. 1.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Các chất được rửa giải sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện (detector) và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành sắc ký đồ với các thông số về pic của chất phân tích. Bộ phận phát hiện là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp [5]. Detector cần đáp ứng các yêu cầu sau: - Đáp ứng nhanh và lặp lại 10
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp - Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng - Khoảng hoạt động tuyến tính rộng - Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng Tùy bản chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp. Bộ phận phát hiện đa sóng – DAD Bộ phận phát hiện didode array có thể xem như là bộ phận phát hiện đo độ hấp thụ UV-VIS đa kênh, mỗi kênh phát hiện ánh sáng ở một bước nhất định. Nguyên lý hoạt động là các phân tử hợp chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV và độ hấp thu tỷ lệ với nồng độ của chúng trong dung dịch. Bộ phận phát hiện diode array dùng hệ quang học đảo, khi ánh sáng đi qua mẫu đo sẽ phân tán thành các bước sóng hợp phần hướng tới cách tử nhiễu xạ và hướng tập trung vào dãy diode. Do ánh sáng tác động lên các diode được đo một cách liên tục, vì vậy độ hấp thu ánh sáng của mẫu đo ở tất cả các bước sóng có thể xác định đồng thời [5]. Ưu điểm của detector DAD là dễ dàng sử dụng với độ tin cậy cao, sử dụng được trong trường hợp triển khai dung môi theo kiểu gradient, không hủy hoại mẫu thử, tương đối nhạy và đặc hiệu, phát hiện ở nhiều bước sóng khác nhau. Ngoài ra detector DAD còn có chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh được pic sắc ký không phải là của hai thành phần trở lên. Nhược điểm của dector DAD là giá thành đắt hơn nhiều so với bộ phận phát hiện UV thông thường [5]. 11
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là năm mẫu HTOĐ đạt tiêu chuẩn DĐVN V do Công ty cổ phần xuất nhập khẩu Dược liệu Dương Thư cung cấp. Cả 5 mẫu HTOĐ sử dụng trong nghiên cứu đều có dạng phiến, đường kính 3-5 cm, dày khoảng 1-2 mm và được bảo quản trong túi PE kín. Bảng 2. 1. Thông tin về các mẫu Hà thủ ô đỏ sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mẫu Ký hiệu Số lô Tiêu chuẩn 1 HTOĐ Trung Quốc HTOĐ.M1 DT/B-HTO.18 DĐVN V 2 HTOĐ Việt Nam HTOĐ.M2 HTO.200519 DĐVN V 3 HTOĐ Trung Quốc HTOĐ.M3 HTO.20001 DĐVN V 4 HTOĐ Việt Nam HTOĐ.M4 HTO.20002 DĐVN V 5 HTOĐ Việt Nam HTOĐ.M5 HTO.20003 DĐVN V 2.2. Hóa chất − Chất chuẩn EM được mua từ nhà xản xuất Chengdu, Trung Quốc, độ tinh khiết 98,98%; CTPT: C15H10O5; KLPT: 270,24 ĐvC. − Chất chuẩn THSG được mua từ nhà sản xuất Chengdu, Trung Quốc, độ tinh khiết 99,84%; CTPT: C20H22O9; KLPT: 406,387 ĐvC. − MeOH và ACN đạt tiêu chuẩn HPLC được mua từ nhà sản xuất Merck KGA, Đức. − Nước khử ion đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m. − Nước cất một lần bằng thiết bị Aquatron A4000D, Bibby, Anh. − Dung môi EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích được mua từ nhà sản xuất Guangdong, Trung Quốc. 12