Kỹ thuật định danh vi khuẩn

Chia sẻ: Vo Canh Tung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

547
lượt xem 151
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA: Nguyên tắc: gen 16S rRNA gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn; Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh xác định vi khuẩn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật định danh vi khuẩn

KYÕ THUAÄT ÑÒNH DANH VI KHUAÅN Phaïm Thaùi Bình Caàu khuaån Gram (-) Tröïc khuaån Gram (-) Caàu khuaån Gram (+) Tröïc khuaån Gram (+) 1
PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG THÖÛ NGHIEÄM SINH HOÙA TRÖÏC KHUAÅN GRAM (-) Haemophillus HACEK(1) Tröïc khuaån Gram(-) Sphingomonas Moraxella (+) (-) Pasteurella Campylobacter Helicobacter Mac Conkey Agar Brucella Bordetella Acinetobacter(2) (-) (-) (+) Vibrio (+) Bartonella Stenotrophomonas Aeromonas Francisella Flavimonas Oxidase Pleiosomonas Legionella Chryseomonas Glucose Glucose Chromobacterium (+) (-) Pseudomonas Enterobacteriaceae: (+) Burkholderia (Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Flavobacterium (1)HACEK: Haemophilus Serratia, Edwarsiella, aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Proteus, Morganella, Alcaligenes Cardiobacterium hominis, Providencia, Salmonella, Eikenella corrodens, Shigella, Yersinia...) Achromobacter Kingella sp. (2)caàu tröïc khuaån Tröïc khuaån Gram (-) deã moïc Chryseobacterium Betty A. Forbes, et.al., 2002, Bailey & Scott’s, Diagnostic Microbiology, 7th edition, Mosby 2
Enterobacteriaceae ð Enterobacteriaceae bao goàm 120 loaøi khaùc nhau. ð Caùc hoï phuï chính: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Serratia, Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia. ð Ñeå ñònh danh ñeán loaøi coù theå thöïc hieän ñeán 40 phaûn öùng sinh hoùa. Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology. Nonfermentative Gram negative bacilli Sphigobacterium (-) (-) (+) (-) Acinetobacter Flavobacterium Oxidase Chryseobacterium Di ñoäng Di ñoäng (+) (+) Stenotrophomonas Pseudomonas Chryseomonas Burkholderia Flavimomas Alcaligenes Sphigomonas Comamonas Burkholderia cepacia Burkholderia gladioli 3
Haemophilus Vi khuaån X V XV H. Influenzae (+) (+) X V H. Haemoliticus H. parainfluenzae H. parahaemoliticus H. segnis (-) (+) XV H. paraprophilus X V H. paraphrophaemolyticus H. ducreyi (+) (-) H. aphrophilus Vi khuaån khaùc (khoâng phaûi XV (-) (-) Haemophilus) X V XV X V CAÀU KHUAÅN GRAM (-) Caàu khuaån Gram (-) (-) (+) M. catarrhalis Acinetobacter(*) Neisseriaceae Oxidase N. gonorrhoeae N. meningitidis N. lactamica N. sicca M. catarrhalis (*)caàu tröïc khuaån 4
TRÖÏC KHUAÅN GRAM (+) Tröïc khuaån Gram (+) (+) (+) (-) (+) Bacillus Listeria Catalase (-) Sinh baøo töû Di ñoäng Erysipelothrix rhusiopathiae (-) Arcanobacterium Corynebacterium Gardnerella vaginalis Lactobacillus CAÀU KHUAÅN GRAM (+) (+) (-) Micrococcaceae Streptococcaceae Catalase Streptococcus (-) (+) Oxidase Planococcus Enterococcus (+) Di ñoäng Aerococcus (-) Micrococcus Lactococcus Pediococcus (-) Leuconostoccus Stomatococcus Genella 6.5% NaCl (+) Patrick R. Murray, 1995, Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, Staphylococcus American Society for Microbiology. 5
Staphylococcus (R) (+) (-) S. saprophyticus S. aureus (S) Coagulase Novobiocin Mannitol Salt (-) (+) S. epidermidis (R) Staphylococcus coagulase negative khaùc (-) (-) (-) (+) S. schleiferi Urease Ornithin Alkaline Polymycin B decarboxylase phosphatase (S) (+) (+) S. lugdunensis S. hominis S. haemolyticus Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO Streptococcus & Enterococcus Vi khuaån Optochin Bile solution S. pneumoniae S S. pseudopneumoniae I (+) Tieâu huyeát a Optochin Bile solution Viridans streptococcus R Viridans streptococcus I (-) Vi khuaån Bacitracin CAMP SXT Bile esculin S. pyogenes S (-) S CAMP SXT S. agalactidae R (+) R Tieâu huyeát b C/F/G streptococcus R/S (-) R (-) Enterococcus R (-) (+) Bacitracin Bile esculin Vi khuaån Bile esculin 6.5% NaCl CAMP Enterococcus (+) (+) Non enterococcus (+) (-) S. agalactidae (-) (+) Viridans streptococcus (-) (-) CAMP Tieâu huyeát g Enterococcus Pyruvate E. faecalis (+) 6.5% NaCl Bile esculin E. faecium (-) Basic Laboratory Procedure in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO 6
PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG KITS THÖÔNG MAÏI Ñònh danh baèng kits thöông maïi giuùp ñònh danh nhanh choùng vaø chính xaùc hôn nhôø heä thoáng maõ ñònh danh 7
Tröïc khuaån Gram (-), deã moïc baèng heä thoáng IDS14GNR (Nam Khoa) 200ml/gieáng 35oC/12-16h Gieáng soá Thöû nghieäm Thuoác thöû (+) (-) Oxidase 1 Glucose Vaøng Tím 2 Nitrate ® Nitrite Tìm nitrite Ñoû Vaøng Di 3 ONPG Vaøng Traéng ñoäng 4 Sinh Urease Ñoû hoàng Vaøng/ñoû nhaït 35oC/ 5 PAD FeCl3 Xanh laù Vaøng nhaït LDC 12-16h 6 Citrate Xanh bieån Xanh laù/ vaøng 7 Esculin Ñen Khoâng ñen 8 H2S Ñen Khoâng ñen 8 Indol Kovac Voøng ñoû Voøng vaøng 9 VP Ñoû Vaøng 10 Malonate a-napthtol+KOH Xanh bieån Xanh laù/ vaøng Moãi nhoùm goàm coù 03 phaûn öùng ð Caùc phaûn öùng (-): 0 ñieåm. ð Phaûn öùng (+): 1 ñieåm (thöù nhaát cuûa nhoùm); 2 ñieåm (thöù hai cuûa nhoùm); 3 ñieåm (thöù ba cuûa nhoùm). ð Toång ñieåm cuûa nhoùm ñöôïc soá ñònh danh thöù nhaát. ð Taäp hôïp caùc soá ñònh danh ñöôïc maõ soá ñònh danh. IDS 14GNR- Heä thoáng ñònh danh Soá: ……………………………………………………………..…… tröïc khuaån Gram (-), deã moïc Teân: ……………………………………………………………………… ISO 9001:2000 WHO GMP/GLP OXI GLU NIT ONPG URE PAD CIT ESC H2s IND VP MLO LDC MOB 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 6 1 3 6 0 Keát quaû ñònh danh: Enterobacter cloaceae (ID: 100%, P: 0.67) 8
PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG MAÙY ÑÒNH DANH TÖÏ ÑOÄNG PHOENIX BioMerieux VITEK2 9
PHÖÔNG PHAÙP GIAÛI TRÌNH TÖÏ GEN 16S rRNA Nguyeân taéc Gen 16S rRNA goàm khoaûng 1542bp vôùi nhieàu trình töï baûo toàn. Trong ñoù coù moät ñoaïn trình töï #550bps ñaëc hieäu cho gioáng vaø loaøi cuûa vi khuaån. Giaûi trình töï ñoaïn ñaëc hieäu naøy giuùp ñònh danh chính xaùc 120bps vi khuaån 1542bps 2904bps 10
Quy trình thöïc hieän Taùch chieát DNA : – Ñun soâi 10min Laáy khuùm khuaån cho vaøo TE – Ñeå laïnh 5min 1X ñeå laøm thaønh huyeàn dòch – Ly taâm 5min. Vi khuaån treân töông ñöông Mc. F 1.0 Laáy dòch noåi maët thaïch Primers Taq polymerase dNTP Mg2+ DNA ñích PCR 16SrRNA Cho vaøo PCR mix ñeå (40X) khueách ñaïi gen 16S rRNA Ñieän di treân gel 94oC/15s 60oC/30s agarose ñeå xaùc 72oC/1min ñònh saûn phaåm PCR 11
Tinh saïch saûn SV gel & PCR cleanup system (Promega) phaåm PCR Xuaát keát quaû giaûi Ñaêng nhaäp vaøo trình töï ñeå phaân tích NCBI BLAST SEARCH Ño noàng ñoä DNA (10pg/ml) Xaùc ñònh teân vi khuaån Ñieän di mao quaûn caàn ñònh danh PCR giaûi trình töï treân CEQ 8000 (30X) 96oC/20s 50oC/20s 60oC/4min Agencourt Clean SEQ (Beckman Coulter) DTCS Quickstart mix (Beckman Coulter) Tuûa vaø tinh saïch saûn phaåm PCR giaûi trình töï 12
13