KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ

Chia sẻ: Tulip_12 Tulip_12 | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

657
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ

Đề tài Sinh học phân tử
Nguyễn Thị Xuân Thảo Nguyễn Thị Thúy Hằng Nguyễn Thị Mỹ Thuận Lê Thị Diệu Anh Phan Hoàng Yến Mai Văn Điểu Trần Văn Thảo Võ Hiệp
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA  Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp.
 Ứng dụng của phương pháp định tính, định lượng DNA được dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y học như để chẩn đoán các bệnh học về di truyền
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Mục đích Nguyên tắc hoạt động Các yếu tố ảnh hưởng
Mục đích Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN có trong dung dịch.
Nguyên tắc  Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA.
Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260nm).
Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm ký hiệu là OD260nm. OD260nm = 50µg/ml cho một dung dịch DNA mạch kép OD260nm = 40µg/ml cho một dung dịch DNA mạch đơn hoặc RNA
Độ hấp thụ ánh sáng của các
Công thức xác định hàm lượng DNA trong dung dịch  DNA mạch đôi Hàm lượng ADN (µg/ml)= 50 x OD260nm x n Trong đó : OD260nm : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở 260 nm 50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi n: hệ số pha loãng
 DNA mạch đơn hay ARN Hàm lượng DNA (µg/ml)= 40 x OD260nm x n Trong đó : 40: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn.
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang phổ Nồng độ ion Nhiệt độ PH Tạp chất protein
Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA, người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic.
- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch. - Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm > 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch, dung dịch DNA bị biến tính hoặc phân hủy. - Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm < 1,8 thì dung dịch DNA,ARN có lẫn tạp chất.
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, độ chính xác tương đối cao Nhược điểm: Chỉ kiểm tra được hàm lượng DNA trong mẫu tinh khiết.