Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:209

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng được công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro và tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỒNG TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Giang GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ HÀ NỘI, NĂM 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tác giả NCS. Nguyễn Hồng Trang
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi luôn được sự quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy, cô giáo, các nhà khoa học cùng với sự động viên của bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ PGS.TS. Vũ Thị Thu Giang Những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hết lòng giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện luận án này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi có thể hoàn thành luận án này. Trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đỗ Thị Thảo, ThS. Đỗ Thị Phương cùng các kiểm nghiệm viên của Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin gửi tới toàn thể các thầy, cô giáo, bạn bè đông nghiệp, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế - Công nghiệp Dược thuộc Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường cùng các chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội. Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn dành tặng tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ để tôi có thể yên tâm học tập, nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm NCS. Nguyễn Hồng Trang
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1. Quercetin .........................................................................................................3 1.1.1. Nguồn gốc ...............................................................................................3 1.1.2. Công thức hóa học ..................................................................................3 1.1.3. Tính chất lý hóa ......................................................................................4 1.1.4. Độ ổn định ..............................................................................................5 1.1.5. Các phương pháp định lượng quercetin ..................................................5 1.1.6. Tác dụng dược lý ....................................................................................5 1.1.7. Dược động học ........................................................................................7 1.1.8. Chỉ định ...................................................................................................8 1.1.9. Liều dùng ................................................................................................8 1.1.10. Tương tác thuốc .......................................................................................9 1.1.11. Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống của quercetin ....9 1.2. Tổng quan về phytosome .............................................................................11 1.2.1. Khái niệm ..............................................................................................11 1.2.2. Thành phần cấu tạo ...............................................................................11 1.2.3. Phân biệt phytosome với liposome .......................................................13 1.2.4. Ưu, nhược điểm của phytosome ...........................................................13 1.2.5. Kỹ thuật bào chế phytosome .................................................................16 1.2.6. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của phytosome .............19 1.2.7. Một số nghiên cứu về phytosome ở Việt Nam .....................................24 1.2.8. Ứng dụng phytosome trong lĩnh vực dược phẩm .................................26 1.3. Một số mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan ...............................28 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................................................................................31 2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu .............................................................31 2.1.1. Nguyên liệu ...........................................................................................31 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ...............................................................................32
2.1.3. Động vật thí nghiệm .............................................................................33 2.1.4. Địa điểm thực hiện nghiên cứu .............................................................33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.............................................................................34 2.2.1. Phương pháp bào chế phytosome quercetin .........................................34 2.2.2. Phương pháp bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin .......36 2.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của quercetin và phytosome quercetin...........................................................................................37 2.2.4. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nang cứng chứa phytosome quercetin ..................................................................................47 2.2.5. Nghiên cứu độ ổn định của bột phytosome quercetin và viên nang chứa phytosome quercetin...........................................................................................49 2.2.6. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome quercetin .............................................................................................................50 2.2.7. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo..............................51 2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu.................................................54 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................55 3.1. Xây dựng/thẩm định một số phƣơng pháp đánh giá ................................55 3.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ...................................55 3.1.2. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis ........................................58 3.1.3. Phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa ....................61 3.2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin ................66 3.2.1. Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ............................................66 3.2.2. Nghiên cứu nâng quy mô bào chế phytosome quercetin lên 500 g/mẻ và dự kiến tiêu chuẩn chất lượng........................................................................80 3.2.3. Theo dõi độ ổn định của phytosome quercetin ...................................101 3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome quercetin thông qua khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH ..................................................104 3.4. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột bị gây độc bằng carbon tetraclorid ................................................................................................105 3.5. Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin ...........111 3.5.1. Xây dựng công thức bào chế ..............................................................111 3.5.2. Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của viên nang cứng chứa phytosome quercetin ...........................................................................................................118
3.5.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang cứng chứa phytosome quercetin.........................................................................................118 3.6. Theo dõi độ ổn định của viên nang chứa phytosome quercetin .............119 3.6.1. Theo dõi hàm lượng ............................................................................120 3.6.2. Theo dõi độ hòa tan ............................................................................121 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................122 4.1. Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin .....122 4.1.1. Về phương pháp bào chế ....................................................................122 4.1.2. Về công thức bào chế ..........................................................................122 4.1.3. Về thông số kỹ thuật trong quá trình bào chế .....................................125 4.1.4. Về nâng cấp quy mô bào chế ..............................................................126 4.1.5. Về phương pháp đánh giá một số đặc tính của phytosome quercetin ..127 4.1.6. Về theo dõi độ ổn định của bột phytosome quercetin ........................139 4.2. Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome quercetin ..... ..............................................................................................................139 4.3. Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin ......140 4.4. Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin ..........................143 4.4.1. Về công thức bào chế ..........................................................................143 4.4.2. Về phương pháp bào chế ....................................................................145 4.4.3. Về tiêu chuẩn chất lượng của viên nang chứa phytosome quercetin ..146 4.4.4. Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang cứng chứa phytosome quercetin.........................................................................................147 4.4.5. Về theo dõi độ ổn định ........................................................................147 4.5. Đóng góp mới của luận án .........................................................................149 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................150 KẾT LUẬN: .........................................................................................................150 KIẾN NGHỊ: ........................................................................................................150 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Nội dung 1 ALT Alanin amino transferase 2 AST Aspartate amino transferase Biopharmaceutics classification system (Hệ thống phân loại 3 BCS sinh dược học bào chế) 4 CCl4 Carbon tetraclorid 13 Carbon-13 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt 5 C - NMR nhân đồng vị 13C) 6 DĐVN Dược điển Việt Nam 7 DLS Dynamic light scattering (Phương pháp tán xạ ánh sáng động) 8 DMSO Dimethyl sulfoxyd 9 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Differential scanning calorimetry (Kỹ thuật phân tích nhiệt quét 10 DSC vi sai) 11 EE Entrapment efficiency (Tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa) 12 ESI Electrospray ionization (Kỹ thuật ion hóa phun điện) U.S. Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực 13 US - FDA phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ) Fourier - transform infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại biến 14 FTIR đổi Fourier) 15 HCl Acid hydrocloric 1 Hydro - 1 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt 16 H - NMR nhân đồng vị 1H) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu 17 HPLC năng cao) 18 HPMC Hydroxy propyl methyl celulose Hydrogenated soy phosphatidyl cholin (Phosphatidyl cholin 19 HSPC đậu nành được hydrogen hóa)
STT Ký hiệu Nội dung International union of pure and applied chemistry (Hiệp hội 20 IUPAC quốc tế về hóa học thuần túy và ứng dụng) 21 KCl Kali clorid 22 KTTP Kích thước tiểu phân 23 Log P Partition coefficient (Hệ số phân bố dầu - nước) 24 MDA Malondialdehyd 25 MS Mass spectrometry (Phổ khối) 26 NaCMC Natri carboxy methyl celulose 27 NMR Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 28 PC Phosphatidyl cholin 29 PDI Polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) 30 PL Phospholipid 31 v/ph Vòng/phút 32 RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 33 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 34 SEM Scanning electron microscopy (Kính hiển vi điện tử quét) 35 SKD Sinh khả dụng 36 SPC Soy phosphatidyl cholin (Phosphatidyl cholin đậu nành) 37 SSG Sodium starch glycolate (Tinh bột natri glycolat) 38 STT Số thứ tự 39 t1/2 Thời gian bán thải 40 TBA Acid thiobarbituric 41 TCA Acid tricloacetic Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền 42 TEM qua) 43 USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) 44 UV-VIS Ultraviolet - visible spectroscopy (Phổ tử ngoại - khả kiến) 45 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) 46 XRD X - ray powder diffraction (Nhiễu xạ tia X trạng thái rắn)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân biệt phytosome và liposome ............................................................13 Bảng 1.2. Một số chế phẩm viên nang chứa phytosome quercetin lưu hành trên thị trường ........................................................................................................................28 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của CCl4 lên một số thông số phản ánh chức năng gan ........30 Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng .................................................31 Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................................32 Bảng 2.3. Thành phần viên nang cứng chứa phytosome quercetin ..........................36 Bảng 2.4. Tương quan giữa chỉ số nén và khả năng trơn chảy theo USP 41 ............47 Bảng 2.5. Thành phần hỗn dịch quercetin và hỗn dịch phytosome quercetin ..........51 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ...............................55 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp .....................................57 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc ký .........................................57 Bảng 3.4. Phổ UV-Vis của quercetin và phytosome quercetin .................................58 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống ...........................................58 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp .....................................60 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp UV-Vis định lượng quercetin ..60 Bảng 3.8. Độ hấp thụ quang của mẫu chứa phytosome quercetin và mẫu placebo ..61 Bảng 3.9. Độ tan của quercetin dạng tự do, dạng phytosome trong cloroform và ethyl acetat.................................................................................................................61 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tỷ lệ hoạt chất quercetin phytosome hóa khi sử dụng các dung môi khác nhau theo thời gian .....................................................................62 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến nồng độ quercetin trong ethyl acetat ..63 Bảng 3.12. Các thông số MS của mẫu phân tích ......................................................64 Bảng 3.13. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của phytosome quercetin tại các thời gian phản ứng khác nhau ........................................................65 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa ..........................................................................................................65 Bảng 3.15. Các thông số kỹ thuật trong quá trình bào chế phytosome quercetin .....66 Bảng 3.16. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo các phương pháp khác nhau ............................................................................................67 Bảng 3.17. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo phương pháp kết tủa trong môi trường nước ..........................................................................68
Bảng 3.18. Một số đặc tính của phytosome quercetin khi tiến hành hydrat hóa từ màng film và hydrat hóa từ bột phytosome ..............................................................69 Bảng 3.19. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với các loại phospholipid khác nhau...................................................................................................................70 Bảng 3.20. Độ ổn định của phytosome quercetin bào chế với các loại phospholipid khác nhau...................................................................................................................70 Bảng 3.21. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC (mol:mol) khác nhau .................................................................................................71 Bảng 3.22. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với các tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol khác nhau ...................................................................................73 Bảng 3.23. Độ ổn định của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với các tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol khác nhau .................................................................74 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan trong nước của phytosome quercetin .................................................................................................75 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa...76 Bảng 3.26. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với nhiệt độ phản ứng khác nhau ...........................................................................................................................77 Bảng 3.27. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với tốc độ quay khác nhau ...79 Bảng 3.28. Thành phần công thức bào chế phytosome quercetin.............................81 Bảng 3.29. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin ...............................82 Bảng 3.30. Độ tan trung bình (µg/ml) của quercetin nguyên liệu và quercetin trong phytosome ở các môi trường khác nhau ...................................................................83 Bảng 3.31. Hệ số phân bố log D của quercetin và phytosome quercetin .................84 Bảng 3.32. Khả năng giải phóng qua màng của phytosome quercetin và quercetin dihydrat (µg/cm2) ......................................................................................................85 Bảng 3.33. Độ hòa tan của phytosome quercetin và quercetin dihydrat (µg/ml) .....86 Bảng 3.34. Kết quả phân tích phổ DSC của các mẫu nghiên cứu ............................89 Bảng 3.35. Số sóng gốc -OH trong phân tử quercetin, gốc N+(CH3)3, (RO)2PO2- trong phân tử HSPC của các mẫu .............................................................................92 Bảng 3.36. Các thông số 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của quercetin ................95 Bảng 3.37. Các thông số 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của HSPC .....................95 Bảng 3.38. Các thông số 13C-NMR (125 MHz, DMSO - d6) của quercetin dạng tự do và quercetin dạng phytosome ...............................................................................98 Bảng 3.39. Các thông số MS của quercetin, HSPC và phytosome quercetin .........100
Bảng 3.40. Kết quả đánh giá đặc tính phytosome quercetin bào chế và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng .....................................................................................................100 Bảng 3.41. Một số đặc tính của bột phytosome quercetin khi bảo quản ở các điều kiện khác nhau trong thời gian 6 tháng ...................................................................101 Bảng 3.42. Độ hòa tan của bột phytosome quercetin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc ....................................................................................102 Bảng 3.43. Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của các mẫu ..............................104 Bảng 3.44. Khối lượng chuột trước và sau khi thí nghiệm .....................................105 Bảng 3.45. Sự thay đổi nồng độ AST và ALT trong huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 .......................................................................................................106 Bảng 3.46. Sự thay đổi hàm lượng GSH và MDA trong gan chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4 ..................................................................................................................108 Bảng 3.47. Khối lượng gan tương đối của chuột ở các lô thí nghiệm ....................110 Bảng 3.48. Một số đặc tính của bột phytosome quercetin ......................................111 Bảng 3.49. Thành phần công thức bào chế cốm chứa phytosome quercetin ..........111 Bảng 3.50. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của cốm phytosome quercetin ....111 Bảng 3.51. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ lactose ................................................................................................113 Bảng 3.52. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ lactose ................................................................................................113 Bảng 3.53. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ natri starch glycolat ...........................................................................114 Bảng 3.54. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ natri starch glycolat ...........................................................................114 Bảng 3.55. Sự thay đổi tỷ lệ rã trong : rã ngoài trong công thức CT9 ....................115 Bảng 3.56. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ rã trong : rã ngoài ..............................................................................115 Bảng 3.57. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ Tween 80 ...........................................................................................116 Bảng 3.58. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi thay đổi tỷ lệ Tween 80 ...........................................................................................116 Bảng 3.59. Thành phần viên nang phytosome quercetin ........................................117 Bảng 3.60. Kết quả đánh giá đặc tính viên nang chứa phytosome quercetin và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng ......................................................................................118
Bảng 3.61. Khối lượng chuột trước và sau khi thí nghiệm .....................................118 Bảng 3.62. Sự thay đổi nồng độ AST, ALT trong huyết thanh chuột và hàm lượng MDA trong gan chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4.................................................119 Bảng 3.63. Phần trăm quercetin còn lại của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc .........................................................................................120 Bảng 3.64. Phần trăm quercetin còn lại của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện thực ..........................................................................................................120 Bảng 3.65. Độ hòa tan của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc .....................................................................................................................121 Bảng 3.66. Độ hòa tan của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện thực ...121
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của quercetin ...................................................................3 Hình 1.2. Các vị trí của quercetin có thể liên kết với các ion kim loại .......................6 Hình 1.3. Hình minh họa quá trình hấp thu và chuyển hóa của quercetin ..................8 Hình 1.4. Cấu trúc của phytosome ............................................................................11 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của phopsholipid ...........................................................11 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của phosphatidyl cholin .................................................12 Hình 1.7. So sánh cấu trúc của phytosome và liposome ...........................................13 Hình 1.8. Hình ảnh SEM của phytosome (tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol 1:2:0,2) .... 20 Hình 1.9. Đồ thị phân tích nhiệt vi sai của quercetin (A), phosphatidyl cholin (B), cholesterol (C) và phytosome quercetin tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol là 1:2:0,2 (D) ....23 Hình 1.10. Giản đồ nhiễu xạ tia X của naringenin, phosphatidyl cholin, và phytosome naringenin tỷ lệ 1:1 .................................................................................24 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin theo phương pháp (a) bốc hơi dung môi và (b) kết tủa trong dung môi .............................................................35 Hình 2.2. Sơ đồ các giai đoạn bào chế viên nang phytosome quercetin ...................36 Hình 2.3. Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vivo theo mô hình gây độc tính gan bằng carbon tetraclorid ............................................52 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ của dung dịch quercetin trong methanol ...................................................................................56 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang (D) với nồng độ (C) của dung dịch quercetin trong ethanol tuyệt đối .......................................................59 Hình 3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phần dịch phía trên và phần lắng dưới đáy sau khi siêu âm 10 phút trong dung môi ethyl acetat ......................................................64 Hình 3.4. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của phytosome quercetin bào chế theo các phương pháp khác nhau .................................................66 Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp bào chế phytosome đến kích thước và phân bố kích thước tiểu phân .............................................................................................67 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin : HSPC đến hiệu suất và độ tan trong nước của phytosome quercetin ...........................................................................................72 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol đến kích thước tiểu phân và hiệu suất phytosome hóa..............................................................................73
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan trong nước của phytosome quercetin ....................................................................................................................75 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa...76 Hình 3.10. Giản đồ phân tích nhiệt vi sai của HSPC ................................................77 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt phối hợp quercetin với HSPC đến kích thước và phân bố kích thước tiểu phân ....................................................................................78 Hình 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ quay của bình cất quay đến kích thước tiểu phân và hiệu suất phytosome hóa ......................................................................................79 Hình 3.13. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin quy mô 500 g/mẻ ...........81 Hình 3.14. Hình ảnh chụp SEM của quercetin và phytosome quercetin ..................82 Hình 3.15. Độ tan của quercetin dihydrat và phytosome quercetin trong các môi trường có pH khác nhau ............................................................................................83 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng qua màng của phytosome quercetin và quercetin dihydrat .................................................................................................85 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của phytosome quercetin và quercetin dihydrat......................................................................................................................86 Hình 3.18. Giản đồ nhiễu xạ tia X của HSPC, quercetin dihydrat, hỗn hợp vật lý và phytosome quercetin .................................................................................................87 Hình 3.19. Giản đồ nhiệt quét vi sai của phytosome quercetin, hỗn hợp vật lý, quercetin dihydrat, cholesterol và HSPC ..................................................................88 Hình 3.20. Phổ IR của phytosome quercetin, hỗn hợp vật lý, quercetin dihydrat, cholesterol và HSPC .................................................................................................91 Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của (a) HSPC, (b) quercetin và (c) phytosome quercetin ..95 Hình 3.22. Phổ 13C-NMR của (a) quercetin và (b) phytosome quercetin .................97 Hình 3.23. Các pic m/z trên phổ MS của HSPC (a), quercetin (b), phytosome quercetin (c, d, e) .......................................................................................................99 Hình 3.24. Hình ảnh SEM của phytosome quercetin sau thời gian bảo quản ở điều kiện dài hạn .............................................................................................................103 Hình 3.25. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phytosome quercetin sau 6 tháng bảo quản ..103 Hình 3.26. Nồng độ AST và ALT trong huyết thanh chuột ở các lô thử nghiệm .... 107 Hình 3.27. Hàm lượng GSH và MDA trong gan chuột ở các lô thử nghiệm .........109 Hình 3.28. Khối lượng gan tương đối của chuột ở các lô thí nghiệm .....................110 Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ cốm và viên nang chứa phytosome quercetin ...............................................................................................113
Hình 3.30. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi tỷ lệ lactose ..............................................................................................................114 Hình 3.31. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi tỷ lệ natri starch glycolat .........................................................................................115 Hình 3.32. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi tỷ lệ rã trong : rã ngoài ............................................................................................115 Hình 3.33. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi tỷ lệ Tween 80 .........................................................................................................116 Hình 3.34. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ các mẫu viên nang .....117 Hình 3.35. Nồng độ AST, ALT trong huyết thanh chuột và hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lô thử nghiệm ................................................................................119
ĐẶT VẤN ĐỀ Tìm kiếm và sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là một trong những xu hướng phát triển của ngành Dược hiện nay. Theo thống kê mới nhất ở các nước phát triển, hơn một nửa số chế phẩm lưu hành trên thị trường có nguồn gốc từ dược liệu [25]. Sự gia tăng này xuất phát từ sự nâng cao nhận thức về vai trò của hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu trong việc hỗ trợ nâng cao sức khỏe hay hỗ trợ điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường. Quercetin là một flavonoid tự nhiên được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học khác nhau như chống viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa hình thành khối u… Đặc biệt, hoạt chất này còn được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh ngay cả ở nồng độ thấp [54]. Tuy nhiên, do những đặc tính bất lợi xuất phát từ tính chất của hoạt chất này, hầu như không tan trong nước, bị chuyển hóa, thải trừ nhanh khi dùng đường uống, đã hạn chế khả năng ứng dụng quercetin trên lâm sàng [32], [47]. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của quercetin dùng đường uống bao gồm hệ tiểu phân nano lipid rắn [76], hệ tiểu phân nano polyme [135]... Trong số các biện pháp trên, bào chế hoạt chất dưới dạng tạo phức hợp với phospholipid (phytosome) được xem là một hướng nghiên cứu bào chế hiện đại, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của quercetin. Trong phytosome, hoạt chất sẽ liên kết với phospholipid (PL) thông thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có tính chất lưỡng tính, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong dịch ruột vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác, phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh khả dụng của quercetin [78]. Hoạt chất sau khi bào chế dưới dạng phytosome có thể dễ dàng ứng dụng vào các dạng viên như viên nén, viên nang... với quy trình bào chế đơn giản, không đòi hỏi công nghệ cao và thiết bị đặc biệt. Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa hoạt chất bào chế dưới dạng phytosome mới bắt đầu được đưa vào nghiên cứu và sản xuất, nguồn nguyên liệu phytosome chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Do đó, việc tiến hành nghiên 1
cứu bào chế phytosome quercetin là cần thiết, góp phần phát triển công nghệ phytosome trong bào chế thuốc. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin. 2. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro và tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin. 3. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin. 2
1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Quercetin 1.1.1. Nguồn gốc - Quercetin là một trong những flavonoid bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm flavonol, có màu vàng. - Quercetin có nhiều trong táo, nho, hành tây, tỏi, rượu vang đỏ... Trong các nguồn thực vật này, quercetin thường tồn tại ở dạng liên kết với đường (glycosid) ít khi gặp dưới dạng tự do (aglycon) [98]. - Ở nước ta và một số nước châu Á khác, quercetin được thu nhận chủ yếu từ rutin trong nụ hoa khô của cây hòe (Sophora japonica L.) bằng phương pháp thủy phân [4]. Ngoài ra, hoạt chất này cũng được tách chiết từ một số dược liệu khác như củ hành tím (Allium cepa L.), cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)... - Quercetin sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng quercetin dihydrat [17], [100], [138]. 1.1.2. Công thức hóa học Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của quercetin [124] - Tên IUPAC: 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4- one. - Công thức phân tử: C15H10O7. - Khối lượng mol phân tử: 302,23 đvC [124]. - Xét trên phương diện hóa học, quercetin có cấu tạo khung kiểu C6 - C3 - C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Một phân tử quercetin có 5 nhóm hydroxyl (ở các vị trí 3, 3’, 4’, 5 và 7) do đó quercetin là một trong những hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong nhóm flavonoid [114]. Phần lớn flavonoid là các dẫn chất có gốc phenyl vì vậy về bản chất quercetin là polyphenol có tính acid yếu. 3
1.1.3. Tính chất lý hóa  Đặc tính lý học: - Cảm quan: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Bình thường tồn tại ở dạng dihydrat, trở nên khan ở 95 - 97oC. - Nhiệt độ nóng chảy: 316,5oC [73]. - Trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS), quercetin thuộc phân nhóm II vì hoạt chất có tính thấm tốt với hệ số thấm là (7,30 ± 1,95) x 10-4 cm/s nhưng ít tan [79]. Ở nhiệt độ 25oC, độ tan của quercetin trong môi trường nước khoảng 1 µg/ml; trong dịch dạ dày nhân tạo là 5,5 µg/ml, trong dịch ruột nhân tạo là 28,9 µg/ml; trong ethanol khoảng 2 mg/ml và trong DMSO là 30 mg/ml [18]. Độ tan của quercetin phụ thuộc vào nhiệt độ và pH. Khi nhiệt độ tăng từ 25oC đến 140oC, độ tan trong nước của quercetin tăng từ 0,00163 mg/ml lên 1,49 mg/ml [121]. Sự gia tăng độ tan quercetin cũng nhận thấy khi pH thay đổi từ 1,2 - 7,4 [69]. - Hệ số phân bố là 1,82 ± 0,32 trong môi trường n-octan/nước [106]. - Khối lượng riêng (g/cm3): 1,799 [55]. - Một đặc điểm quan trọng của quercetin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại do hiệu ứng liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen. Theo USP 41, hoạt chất có cực đại hấp thụ tại bước sóng 255 nm và 371 nm trong methanol [124].  Đặc tính hóa học: - Quercetin có tính acid yếu. Hằng số phân ly pKa1 = 7,17 (phenol); pKa2 = 8,26 (phenol); pKa3 = 10,13 (phenol); pKa4 = 12,30 (phenol); pKa5 = 13,11 (phenol) [50]. - Phản ứng của nhóm hydroxyl (-OH) [2]: + Phản ứng oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa (bạc nitrat, các gốc tự do,…) hay enzym polyphenoloxydase, quercetin sẽ bị oxy hóa thành các gốc ArO.. Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa với các gốc tự do khác tạo thành liên kết mới C - C, C - O hoặc O - O. - Phản ứng của vòng thơm: Phản ứng thế dễ hơn benzen; phản ứng diazo và azo hóa được sử dụng để phát hiện quercetin trên sắc ký đồ. Thuốc thử thường là những amin thơm [2]. - Phản ứng của nhóm carbonyl [2]: + Phản ứng Shinoda (hay cyanidin): Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như sắt, kẽm, magnesi trong môi trường HCl. Phản ứng này đặc trưng cho các flavonoid có nhóm carbonyl ở vị trí C4 và có nối đôi giữa C2 = C3 điển hình là flavonol (quercetin). 4