Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:189

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang)" trình bày các nội dung chính sau: Mô tả đặc điểm thực vật, xác định đặc điểm vi học và thẩm định tên khoa học của loài Giảo cổ lam quả dẹt; Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học của cao chiết và một số hợp chất phân lập được từ phần trên mặt đất của loài Giảo cổ lam quả dẹt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU ĐINH THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM QUẢ DẸT (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU ĐINH THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM QUẢ DẸT (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ PGS.TS. Phạm Thanh Huyền HÀ NỘI, 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và PGS.TS. Phạm Thanh Huyền. Kết quả đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án NCS. Đinh Thị Thanh Thủy
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các Thầy Cô giáo, các Nhà khoa học từ nhiều đơn vị, cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và PGS.TS. Phạm Thanh Huyền, những ngƣời Thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà, PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, cùng các Thầy, Cô giáo, các Nhà khoa học công tác tại Viện Dƣợc liệu, ThS. Nghiêm Đức Trọng, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh (Bộ môn Dƣợc lý - Trƣờng Đại học Y Hà Nội) đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, các anh chị em đồng nghiệp của Bệnh viện Nhiệt đới Trung ƣơng đã tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, Phòng Khoa học và Đào tạo, thƣ viện Viện Dƣợc liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học và thực hiện luận án. Lời sau cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên và chia sẻ giúp tôi đạt đƣợc kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! NCS. Đinh Thị Thanh Thủy
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................................. 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME ................................................ ..2 1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume................ 2 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume ........................................................ 8 1.1.3. Tác dụng sinh học và độc tính của chi Gynostemma Blume ....................................... 21 1.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GIẢO CỔ LAM QUẢ DẸT........................................... 32 1.2.1. Đặc điểm thực vật của Giảo cổ lam quả dẹt ................................................................ 32 1.2.2. Sinh thái và phân bố của Giảo cổ lam quả dẹt ............................................................ 33 1.2.3. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam quả dẹt ............................................................. 33 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 35 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 35 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................................... 35 2.1.2. Động vật thí nghiệm .................................................................................................... 35 2.1.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi và tế bào .................................................................... 35 2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ................................................................... 37 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 39 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu thực vật...................................................................................... 39 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................... 39 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học.................................................... 39 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 39 2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu thực vật ............................................................................... 39 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học ............................................................. 39 2.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu độc tính cấp ........................................................................ 42 2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng sinh học ................................................................ 43 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 51
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT ........................................................... 51 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật loài Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X.Chen & D. R. Liang) ...................................................................................................... 51 3.1.2. Kết quả giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu ................................................. 53 3.1.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu .......................................... 54 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................. 59 3.2.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ ..................................................................... 59 3.2.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất .................................. 61 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC ...................................................................................................................... 105 3.3.1. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp .......................................................................... 105 3.3.2. Kết quả nghiên cứu một số tác dụng sinh học của Giảo cổ lam quả dẹt ................... 109 BÀN LUẬN ........................................................................................................................ 138 4.1. Về thực vật ............................................................................................................... 138 4.2. Về thành phần hóa học............................................................................................ 140 4.2.1. Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ .............................................................. 140 4.2.2. Về kết quả phân lập các hợp chất .............................................................................. 140 4.3. Về độc tính cấp ......................................................................................................... 145 4.4. Về một số tác dụng sinh học ................................................................................... 146 4.4.1. Về tác dụng hoạt hóa MPK, CC, ức chế F S và SREBP-1c trên tế bào 3T3-L1 của Giảo cổ lam quả dẹt ...................................................................................................... 147 4.4.2. Tác dụng hạ glucose máu trên mô hình đái tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm ............. 151 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 153 KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 153 KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 155 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ....................................................... 156 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Viết đầy đủ ACC Acetyl-CoA carboxylase ADN Acid deoxyribonucleic ALT Alanine transaminase AMPK Adenosine monophosphate-activated protein kinase ARN Acid ribonucleic AST Aspartate transaminase BuOH n-Butanol DCM Dichloromethane DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (Phổ DEPT) ĐTĐ Đái tháo đƣờng EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol FAS Fatty acid synthase (Enzym tổng hợp acid béo) GL Các hợp chất gypenosid L GCB Cao n-butanol GCH Cao n-hexan GCL Giảo cổ lam GCE Cao ethyl acetat GCT Cao ethanol 80% GCT1 Cao ethanol 80% để thử độc tính GLI Gypenosid LI GPE Cao chiết giàu saponin từ G. pentaphyllum GPG G. pentaphyllum giàu gypenosid UL4 GCW Cắn nƣớc của cao EtOH 80% Glc β-ᴅ-Glucopyranosyl HDL High density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao) HFD High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tƣơng quan dị nhân đa liên kết)
Kí hiệu Viết đầy đủ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) HR-ESI-MS High-resolution Electrospray Ionisation - Mass Spectrometry (Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tƣơng tác dị nhân lƣợng tử đơn) IL Interleukin J Hằng số tƣơng tác (đơn vị là Hz) KLPT Khối lƣợng phân tử m/z Mass to charge ratio (Tỉ lệ khối lƣợng/điện tích) LD0 Lethal Dose 0% (Liều cao nhất không gây chết động vật thử nghiệm) LD50 Median Lethal Dose (Liều gây chết 50%) LD100 Absolute Lethal Dose (Liều thấp nhất gây chết 100% động vật thử nghiệm) LDL Low density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) MAPK Mitogen-activated protein kinase (Protein kinase hoạt hóa phân bào) MCD Methionine- and choline-deficient (Thiếu methionin cholin) MeOH Methanol MDA Malondialdehyde MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide NAFLD Nonalcoholic fatty liver disease (Bệnh gan nhiễm mỡ không do rƣợu) NASH Nonalcoholic steatohepatitis (Viêm gan nhiễm mỡ không do rƣợu) NFD Normal fat diet (Chế độ ăn bình thƣờng) NF-κB Nuclear factor kappa B (Yếu tố nhân kappa B) PGC-1α PP Rγ coactivator-1α SIRT Sirtuin SOD Superoxide dismutase SREBP-1c Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1c (Protein-1c liên kết yếu tố điều hòa sterol) STT Số thứ tự
Kí hiệu Viết đầy đủ STZ Streptozocin Rg3 Ginsenosid Rg3 TC Total cholesterol (Cholesterol toàn phần) TG Triglyceride TLTK Tài liệu tham khảo TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) δ Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị là ppm)
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [15] ...................................... 4 Bảng 1.2: Danh sách các loài Gynostemma ở Trung Quốc [16] .......................................... 5 Bảng 1.3: Danh sách các loài Gynostemma ở Thái Lan và Malaysia [14] .......................... 6 Bảng 1.4: Danh sách các loài Gynostemma ở Việt Nam [6]................................................ 7 Bảng 1.5: Các flavonoid phân lập đƣợc từ chi Gynostemma Blume ................................. 20 Bảng 2.1: Chế độ ăn NFD và HFD tính trên 100 g thức ăn ............................................... 48 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong dƣợc liệu .................................. 59 Bảng 3.2: Kết quả định tính saponin và flavonoid trong các cao chiết từ GCL quả dẹt .... 60 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC1 ................................................................ 68 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC2 ................................................................ 69 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC3 ................................................................ 70 Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC4 ................................................................ 73 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của các hợp chất GC5 - GC7....... 80 Bảng 3.8: Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của các hợp chất GC5 - GC7 ..... 81 Bảng 3.9: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC8 ................................................................ 82 Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC9 .............................................................. 84 Bảng 3.11: Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của các hợp chất GC10 - GC13. 92 Bảng 3.12: Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của các hợp chất GC10 - GC13 ............................................................................................................................................ 94 Bảng 3.13: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC14 ............................................................ 95 Bảng 3.14: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC15 ............................................................ 98 Bảng 3.15: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC16 .......................................................... 100 Bảng 3.16: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GC17 .......................................................... 103 Bảng 3.17: Kết quả thử độc tính cấp của cao chiết nƣớc Giảo cổ lam quả dẹt ................ 106 Bảng 3.18: Kết quả thử độc tính cấp của cao chiết cồn EtOH 80% GCT1 ...................... 108 Bảng 3.19: Ảnh hƣởng của mẫu thử lên khả năng sống sót của tế bào HepG2 ............... 109 Bảng 3.20: Ảnh hƣởng của mẫu thử khi kết hợp với acid oleic lên khả năng sống sót của tế bào HepG2 .................................................................................................................... 110 Bảng 3.21: Ảnh hƣởng của mẫu thử khi kết hợp với acid oleic lên tế bào HepG2 (%)... 110
Bảng 3.22: Sự thay đổi trọng lƣợng chuột tại các thời điểm nghiên cứu ......................... 118 Bảng 3.23: Sự biến đổi nồng độ glucose máu của chuột sau 8 tuần ................................ 120 Bảng 3.24: Ảnh hƣởng của GCT1 lên nồng độ glucose máu ........................................... 120 Bảng 3.25: Ảnh hƣởng của GCT1 lên nồng độ lipid máu của chuột nhắt trắng đái tháo đƣờng typ 2 sau 2 tuần uống thuốc ................................................................................... 122 Bảng 3.26: Trọng lƣợng gan của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần uống thuốc...................... 123 Bảng 3.27: Trọng lƣợng tụy của chuột ĐTĐ typ 2 sau 2 tuần uống thuốc ...................... 124 Bảng 3.28: Ảnh hƣởng của GCT1 lên chỉ số MDA trong tụy chuột................................ 125 Bảng 3.29: Kết quả đánh giá đại thể gan của chuột ở các lô khác nhau .......................... 127 Bảng 3.30: Kết quả đánh giá vi thể gan của chuột ở các lô khác nhau ............................ 128 Bảng 3.31: Kết quả đánh giá đại thể tụy của chuột ở các lô khác nhau ........................... 131 Bảng 3.32: Kết quả đánh giá vi thể tụy của chuột ở các lô khác nhau ............................. 134 Bảng 4.1. So sánh giữa thông tin công bố về G. compressum và mẫu nghiên cứu.... Error! Bookmark not defined. Bảng 4.2. So sánh hình ảnh quả của các loài Giảo cổ lam có tại Việt Nam .................... 139
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Khung cấu trúc dammaran thuộc nhóm saponin triterpen tetracyclic .................. 8 Hình 1.2: Các saponin cấu trúc 3β,19β,20β-trihydroxydammar-24-en ................................ 9 Hình 1.3: Các saponin cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-19-al.............................. 9 Hình 1.4: Các saponin cấu trúc 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en.................................. 9 Hình 1.5: Các saponin cấu trúc protopanaxadiol................................................................ 10 Hình 1.6: Các saponin cấu trúc 3β,12β,19β,20β-tetrahydroxydammar-24-en ................... 11 Hình 1.7: Các saponin cấu trúc 3β,12β,19β,20β-tetrahydroxydammar-24-en-19-al.......... 11 Hình 1.8: Các saponin cấu trúc 2α,3β,12β,20β-tetrahydroxydammar-24-en ..................... 12 Hình 1.9: Các saponin cấu trúc 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en-12-on ..................... 12 Hình 1.10: Các saponin có nhóm hydroxyl tại C-21 .......................................................... 13 Hình 1.11: Các saponin có nhóm hydroxyl tại C-25 .......................................................... 13 Hình 1.12: Các saponin có nhóm hydroxyl tại C-26 .......................................................... 14 Hình 1.13: Các saponin cấu trúc dammar-25-en-24-ol ...................................................... 14 Hình 1.14: Các saponin có nhóm carboxyl tại C-21 .......................................................... 15 Hình 1.15: Cấu trúc của gypentonosid A (150).................................................................. 15 Hình 1.16: Cấu trúc của gypenosid GC1 (151) .................................................................. 16 Hình 1.17: Các saponin cấu trúc hydroperoxyl tại C-25 .................................................... 16 Hình 1.18: Các saponin bị oxy hóa tại C-21 và hydroperoxyl tại C-25 ............................. 17 Hình 1.19: Các saponin cấu trúc dammar-25-en bị peroxid tại C-24................................. 17 Hình 1.20: Các saponin dehydrat hóa tại C-20................................................................... 17 Hình 1.21: Các saponin cấu trúc 21,23-epoxydammaran .................................................. 18 Hình 1.22: Các saponin cấu trúc 21,23-lactondammaran .................................................. 18 Hình 1.23: Các saponin cấu trúc 20,25-epoxydammaran .................................................. 18 Hình 1.24: Các saponin cấu trúc 20,24-epoxydammaran .................................................. 19 Hình 1.25: Các gypenosid có vòng pentacyclic ................................................................. 19 Hình 1.26: Gypenosid E (191) đóng vòng kép ................................................................... 19 Hình 1.27: Các gypenosid phân lập từ loài G. compressum .............................................. 34 Hình 2.1: Phản ứng nhuộm màu tế bào sống bằng phƣơng pháp MTT ............................. 45 Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu ....................................................... 45
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dƣỡng loài Giảo cổ lam quả dẹt.................................... 51 Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản đực của loài Giảo cổ lam quả dẹt ........................... 52 Hình 3.3: Đặc điểm cơ quan sinh sản cái của loài Giảo cổ lam quả dẹt ............................ 53 Hình 3.4: Đặc điểm bột dƣợc liệu ...................................................................................... 54 Hình 3.5: Vi phẫu cuống lá mẫu nghiên cứu ...................................................................... 55 Hình 3.6: Vi phẫu lá mẫu nghiên cứu ................................................................................. 57 Hình 3.7: Vi phẫu thân lá mẫu nghiên cứu ......................................................................... 58 Hình 3.8: Tóm tắt sơ đồ chiết cao tổng và cao phân đoạn của Giảo cổ lam quả dẹt ......... 62 Hình 3.9: Tóm tắt sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn B1 ...................................... 63 Hình 3.10: Tóm tắt sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn B2 .................................... 64 Hình 3.11: Tóm tắt sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn B3 .................................... 66 Hình 3.12: Tóm tắt sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn B7 .................................... 67 Hình 3.13: Tóm tắt sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao BuOH của Giảo cổ lam quả dẹt .. 68 Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất GC1 ................................................................ 69 Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất GC2 ................................................................ 70 Hình 3.16: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC3 ............................................................................................................. 72 Hình 3.17: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC4 ............................................................................................................. 75 Hình 3.18: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC5 ............................................................................................................. 76 Hình 3.19: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC6 ............................................................................................................. 78 Hình 3.20: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC7 ............................................................................................................. 79 Hình 3.21: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC8 ............................................................................................................. 84 Hình 3.22: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC9 ............................................................................................................. 87
Hình 3.23: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC10 ........................................................................................................... 88 Hình 3.24: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC11 ........................................................................................................... 90 Hình 3.25: Cấu trúc và các tƣơng tác HMBC chính (→) của GC12 ................................. 90 Hình 3.26: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC13 ........................................................................................................... 92 Hình 3.27: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC14 ........................................................................................................... 97 Hình 3.28: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC15 ......................................................................................................... 100 Hình 3.29: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC16 ......................................................................................................... 102 Hình 3.30: Cấu trúc hóa học ( ), các tƣơng tác COSY (─, B), HMBC (→, B) và NOESY (C) chính của GC17 ......................................................................................................... 105 Hình 3.31: Ảnh hƣởng của cao chiết đến khả năng sống sót của tế bào mô mỡ 3T3-L1 112 Hình 3.32: Khả năng hoạt hóa p- MPK và p- CC trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các cao chiết .................................................................................................................................. 112 Hình 3.33: Tác dụng ức chế F S và SREBP-1c trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của cao chiết GCB.................................................................................................................................. 113 Hình 3.34: Ảnh hƣởng của chất tinh khiết đến khả năng sống sót của tế bào mô mỡ 3T3- L1 ...................................................................................................................................... 114 Hình 3.35: Khả năng hoạt hóa p- MPK và p- CC trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của chất tinh khiết ........................................................................................................................... 115 Hình 3.36: Tác dụng hoạt hóa p- MPK và p-ACC theo nồng độ và thời gian của GC13 trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 ................................................................................................ 116 Hình 3.37: Tác dụng ức chế F S và SREBP-1c theo nồng độ và thời gian của GC13 trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 ....................................................................................................... 118 Hình 3.38: Hình ảnh đại thể gan chuột ở các lô khác nhau .............................................. 128 Hình 3.39: Hình ảnh vi thể gan chuột ở các lô khác nhau (HE x 400)............................. 131
Hình 3.40: Hình ảnh đại thể tụy chuột ở các lô khác nhau .............................................. 132 Hình 3.41: Hình ảnh vi thể tụy chuột ở các lô thí nghiệm ............................................... 136
ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là tên gọi chung cho các loài thuộc chi Gynostemma Blume, đã đƣợc nhân dân Trung Quốc, Nhật Bản sử dụng từ lâu nhƣ một loài thực phẩm. Đến năm 1976, khi nghiên cứu về các chất thay thế đƣờng cho bệnh nhân đái tháo đƣờng, các nhà khoa học Nhật Bản mới phát hiện ra các saponin trong Giảo cổ lam giống các saponin trong Nhân sâm [1]. Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu về Giảo cổ lam và đã có nhiều kết quả khẳng định giá trị của dƣợc liệu này. Hiện nay, trên thế giới chi Gynostemma Blume có khoảng 17 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á tới Đông Á. Thành phần chính của Giảo cổ lam là các saponin dammaran (gọi là gypenosid) có nhiều tác dụng đáng chú ý nhƣ hạ lipid, hạ glucose máu, điều hòa chức năng miễn dịch, chống oxy hoá, gây độc tế bào ... [2]. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ đã công bố 6 loài Giảo cổ lam, trong đó đã có 5 loài đƣợc nghiên cứu về thành phần và tác dụng sinh học bao gồm: G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, G. longipes C.V.Wu, G. burmanicum King ex Chakravi, G. laxum (Wall.) Cogn. và G. guangxiense X.X. Chen & D.H. Qin [3], [4], [5]. Tuy nhiên, loài G. compressum X.X. Chen & D.R.Liang (Giảo cổ lam quả dẹt) [6] ở Việt Nam chƣa có công bố nào về thành phần hoá học và tác dụng sinh học. Do đó để tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng hiệu quả và khẳng định giá trị của Giảo cổ lam quả dẹt, luận án: Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang) đƣợc thực hiện với 3 mục tiêu: 1. Nghiên cứu về thực vật học: Mô tả đặc điểm thực vật, xác định đặc điểm vi học và thẩm định tên khoa học của loài Giảo cổ lam quả dẹt. 2. Nghiên cứu về thành phần hoá học: Định tính các nhóm chất hữu cơ; chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập đƣợc từ phần trên mặt đất của loài Giảo cổ lam quả dẹt. 3. Nghiên cứu về tác dụng sinh học: Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học của cao chiết và một số hợp chất phân lập đƣợc từ phần trên mặt đất của loài Giảo cổ lam quả dẹt. 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN Giảo cổ lam là tên chung của các loài thuộc chi Gynostemma Blume. Đây là một chi thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), gồm 19 loài [163] và phân bố từ vùng nhiệt đới Châu Á đến Đông Á. Hiện nay, ở Việt Nam đã ghi nhận đƣợc 6 loài Giảo cổ lam, bao gồm: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn., Gynostemma longipes C. Y. Wu, Gynostemma burmanicum King ex Chakrav., Gynostemma compressum X. X. Chen & D. R. Liang và Gynostemma guangxiense X. X. Chen & D. H. Qin [6]. 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME 1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume 1.1.1.1. Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume Chi Gynostemma do nhà thực vật học Hà Lan gốc Đức Carl Ludwig Blume (1796 - 1862) (viết tắt là Blume) xác lập năm 1825, trên cơ sở của mẫu typ của loài Gynostemma simplicifolium Blume (mang số hiệu C. L. Blume 1493 (L.), thu thập ở Java, Indonesia) đƣợc công bố trong "Bijdr Flora Ned-Indonesia" No 23, 1825. Nhà thực vật này công bố 2 loài nhƣng chỉ đƣợc coi là đồng danh (synonyms) của Gynostemma Blume. Ngƣời Việt Nam đầu tiên đề cập đến các loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí - Cucurbitaceae) là Phạm Hoàng Hộ. Trong bộ "Cây cỏ Việt Nam" Q.I xuất bản năm 1999, ông cũng chỉ nêu ra đƣợc 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. và Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) [7]. Đến năm 2003, trong "Danh lục các loài thực vật Việt Nam", khi biên soạn họ Cucurbitaceae, Nguyễn Hữu Hiến cũng chỉ nhắc lại 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume [8] đã đƣợc các tác giả tiền bối công bố ở nƣớc ta [7], [9], [10]. Theo hệ thống phân loại thực vật của . Takhtajan 2009 [11], có thể phân loại chi Gynostemma Blume nhƣ sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Sổ (Dilleniidae) Liên bộ Hoa tím (Violanae) Bộ Bí (Cucurbitales) Họ Bí (Cucurbitaceae) Phân họ Nhandiroboideae Tông Zanonieae 2
Chi Gynostemma Blume. Một số nhà thực vật Việt Nam nhƣ Phạm Hoàng Hộ [7], Võ Văn Chi [12] cũng xếp chi Gynostemma Blume thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) tƣơng đồng với hệ thống phân loại của . Takhtajan. Chi Gynostemma Blume đƣợc chia thành hai phân chi (Subgenus), bao gồm:  (i) Subgenus Trirostellum với dạng quả nang, tự mở bằng 3 van và đƣợc chia thành 2 loại (Section) là:  Section Pentagyne  Section Trirostellae  (ii) Subgenus Gynostemma với dạng quả mọng, không tự mở. 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume Theo một số tài liệu về phân loại thực vật, đặc điểm chung của các loài thuộc chi Gynostemma Blume là cây thảo nhiều năm, có dạng dây leo nhẵn hoặc có lông. Các loài thƣờng mọc lan ở dƣới tán; rễ có củ hoặc không; cành mảnh, có lông thƣa hoặc lông mịn. Lá so le, kép chân vịt, 3 – 9 lá chét, hiếm khi đơn; phiến lá chét hình trứng – mác. Tua cuốn chẻ đôi, ít khi đơn. Cây đơn tính khác gốc. Hoa đơn tính, cụm hoa chùm hoặc chùy, nách lá hoặc đầu cành; cuống của hoa có khớp; lá bắc con ở gốc. Hoa đực: Ống đài ngắn, 5 thùy; các mảnh hình mác hẹp; tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe (rotate), 5 thùy xẻ sâu; các thùy hình mác hoặc trứng – mác, mép cuộn vào trong khi là nụ; nhị 5, đính vào gốc của ống bao hoa; chỉ nhị ngắn, hàn liền; bao phấn đứng, hình trứng, 2 ô, nứt dọc, trung đới hẹp, nhƣng không kéo dài; hạt phấn hình cầu hoặc elip, có sọc hoặc vạch theo chiều dọc hoặc nhẵn hoặc trơn, tự mở bằng lỗ; nhụy hoa tiêu giảm không có (tiêu giảm hoàn toàn). Hoa cái: Đài và tràng giống hoa đực; nhị lép tồn tại; bầu hình cầu, 2 – 5 ô; vòi nhụy 3, hiếm khi 2, 4 hoặc 5, rời nhau; núm nhụy 2 hoặc 1, hình lƣỡi liềm hoặc xẻ răng cƣa không đều; noãn 2, treo hoặc rủ trong mỗi ô. Quả mọng hình cầu, hình dáng và kích thƣớc giống đậu Hà Lan (pea), hoặc quả nang, có 3 thùy từ đỉnh, đỉnh có u hoặc 3 vòi nhụy dài tồn tại. Hạt 2 hoặc 3, hình trứng rộng, dẹp, có nhú hoặc gai nhú [13]. Các nghiên cứu về nhiễm sắc thể cho thấy, số nhiễm sắc cơ bản của các loài trong chi Gynostemma Blume là 2n = 22; có thể xuất hiện dạng đa bội, thƣờng là 2n = 22, 44, 66 hoặc 88. Hiện tƣợng đa bội nhiễm sắc thể xuất hiện thƣờng xuyên ở một số loài nhƣ G. 3
longipes (2n = 22, 44), G. cardiospermum (2n = 22, 66), G. yixingerse (2n = 22, 88) và G. pentaphyllum (2n = 22, 44, 66, 88) [14]. 1.1.1.3. Phân bố của các loài thuộc chi Gynostemma Blume Theo công bố mới nhất tham khảo trên trang web http://www.theplantlist.org (15/4/2020) [15], trên thế giới chi Gynostemma Blume có 19 loài đã đƣợc chấp nhận (Bảng 1.1). Các loài thuộc chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á đến Đông Á, từ dãy Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea. Trung Quốc là quốc gia có các loài thuộc chi Gynostemma nhiều nhất, gồm 14 loài (Bảng 1.2) trong đó có 9 loài đặc hữu phân bố ở miền tây nam Trung Quốc (phía nam tỉnh Thiểm Tây và khu nam lƣu vực sông Trƣờng Giang). Loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino phổ biến nhất và mọc rải rác cả ở Trung Quốc, Bangladesh, Bu Tan, Ấn Độ, Indonesia, phía nam Nhật Bản, phía nam Hàn Quốc, Lào, Maylasia, Myanmar, Nepal, New Guinea, Srilanca, Thái Lan và Việt Nam [13]. Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [15] STT Tên loài Ghi chú 1 G. aggregatum C. Y. Wu & S. K. Chen Đã đƣợc chấp nhận G. angustipetalum Craib G. blumei Hassk. 2 G. burmanicum King ex Chakrav. Đã đƣợc chấp nhận G. burmanicum var. molle C. Y. Wu 3 G. cardiospermum Cogn. ex Oliv. Đã đƣợc chấp nhận 4 G. caulopterum S. Z. He Đã đƣợc chấp nhận G. cissoides (Wall.) Benth. & Hook. f. ex Franch. & Sav. 5 G. compressum X. X. Chen & D. R. Liang Đã đƣợc chấp nhận G. crenulatum Ridl. G. elongatum Merr. 6 G. guangxiense X. X. Chen & D. H. Qin Đã đƣợc chấp nhận G. hederifolium (Decne.) Cogn. G. integrifoliolum Cogn. 7 G. intermedium W.J.de Wilde & Duyfjes Đã đƣợc chấp nhận 8 G. laxiflorum C. Y. Wu & S. K. Chen Đã đƣợc chấp nhận 9 G. laxum (Wall.) Cogn. Đã đƣợc chấp nhận 4
STT Tên loài Ghi chú 10 G. longipes C. Y. Wu Đã đƣợc chấp nhận 11 G. microspermum C. Y. Wu & S. K. Chen Đã đƣợc chấp nhận 12 G. pallidinerve Z. Zhang Đã đƣợc chấp nhận 13 G. papuanum W.J.de Wilde & Duyfjes Đã đƣợc chấp nhận G. pedatum Blume G. pedatum var. pubescens Gagnep. 14 G. pentagynum Z. P. Wang Đã đƣợc chấp nhận 15 G. pentaphyllum (Thunb.) Makino Đã đƣợc chấp nhận G. pentaphyllum f. dasycarpum (C. Y. Wu) W.J.de Wilde & Duyfjes G. pentaphyllum var. dasycarpum C. Y. Wu G. pentaphyllum f. fasciculare W.J.de Wilde & Duyfjes G. pentaphyllum f. grandiflorum W.J.de Wilde & Duyfjes G. pentaphyllum f. knemandrum W.J.de Wilde & Duyfjes G. pentaphyllum f. pubescens (Gagnep.) W.J.de Wilde & Duyfjes G. pentaphyllum f. simplicifolium (Blume) W.J.de Wilde & Duyfjes 16 G. pubescens (Gagnep.) C. Y. Wu Đã đƣợc chấp nhận G. siamicum Craib 17 G. simplicifolium Blume Đã đƣợc chấp nhận G. trigynum M. A. Lawson G. wightianum (Arn.) Benth. & Hook.f. ex B. D. Jacks. G. winkleri Cogn. 18 G. yixingense (Z. P. Wang & Q. Z. Xie) C. Y. Wu & S. K. Chen Đã đƣợc chấp nhận G. yixingense var. trichocarpum J. N. Ding 19 G. zhejiangense X. J. Xue Đã đƣợc chấp nhận Bảng 1.2: Danh sách các loài Gynostemma ở Trung Quốc [16] STT Tên loài STT Tên loài 1 G. pentagynum Z. P. Wang 9a G. burmanicum var. burmanicum 2 G. yixingense (Z. P. Wang & Q. Z. 9b G. burmanicum var. molle C. Y. Wu Xie) C. Y. Wu & S. K. Chen 3 G. cardiospermum Cogn. ex Oliv. 10 G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 5