Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:444

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam" được hoàn thành với mục tiêu nhằm chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy Thiêm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ tinh khiết và đủ khối lượng để thiết lập chất chuẩn gốc; Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid và CO1 tinh chế được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Phương Thiện Thương TS. Nguyễn Thị Liên HÀ NỘI, NĂM 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phương Thiện Thương và TS. Nguyễn Thị Liên. Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và được công bố một phần trong các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng được công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc các công trình nghiên cứu khoa học của các tác giả khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả của nhiều tập thể và cá nhân, của các thầy, cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Phương Thiện Thương – Phó Viện trưởng Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc, TS. Nguyễn Thị Liên – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, những người thầy đã định hướng, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận án. Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các Khoa/Phòng trong Viện đã tạo điều kiện về môi trường nghiên cứu, cơ sở vật chất, trang thiết bị, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án. Bộ Khoa học và Công nghệ đã cấp kinh phí cho Nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ cấp Bộ, mã số 01.2020M001, đồng nghiệp tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc đã phối hợp và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Công trình nghiên cứu này được hoàn thành với sự nỗ lực của bản thân và sự ủng hộ của gia đình, bạn bè, xin cảm ơn mọi người đã luôn sát cánh bên tôi, động viên khích lệ tôi hoàn thành nghiên cứu này. Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2022 NCS. Nguyễn Thị Phương Thảo
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU .................................................................................................................... 3 1.1.1. Sự cần thiết phải có chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu ............ 3 1.1.2. Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược liệu ....................................................................................................................... 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................. 5 1.2.1. Hy thiêm .................................................................................................... 5 1.2.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 5 1.2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................ 6 1.2.1.3. Thành phần hóa học................................................................................ 6 1.2.1.4. Tác dụng sinh học ................................................................................. 10 1.2.1.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Hy thiêm ..................................................... 11 1.2.1.6. Hợp chất darutosid ................................................................................ 12 1.2.2. Vối ........................................................................................................... 13 1.2.2.1. Vị trí phân loại ...................................................................................... 13 1.2.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................. 13 1.2.2.3. Thành phần hóa học.............................................................................. 14 1.2.2.4. Tác dụng sinh học ................................................................................. 18 1.2.2.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Vối .............................................................. 19 1.2.2.6. Hợp chất 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5' –dimethylchalcon (CO1) .. 20 1.3. TỔNG QUAN VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN HÓA HỌC................... 22 1.3.1. Định nghĩa, phân loại chất chuẩn hóa học............................................... 22 1.3.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học ................................................................... 23 1.3.2.1. Yêu cầu về hàm lượng với chất đánh dấu trong dược liệu ................... 23 1.3.2.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học gốc ......................................................... 24 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU ................................. 32 2.1.1. Dược liệu Hy thiêm ................................................................................. 32 2.1.2. Dược liệu nụ Vối và lá Vối...................................................................... 32
2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ........................................................ 33 2.2.1. Vật tư, hóa chất ........................................................................................ 33 2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................... 34 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 34 2.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các hợp chất............ 36 2.3.2. Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu để thiết lập chuẩn ............................................................................................................ 36 2.3.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng............................................................ 37 2.3.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD ....................................................................................................... 37 2.3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc ....... 38 2.3.3. Thiết lập chất chuẩn gốc .......................................................................... 39 2.3.3.1. Đóng lọ ................................................................................................. 39 2.3.3.2. Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói ..................................... 40 2.3.3.3.Xác định giá trị ấn định công bố trên chứng chỉ với chuẩn gốc định lượng .................................................................................................................. 40 2.3.3.4. Xác định độ không đảm bảo đo ............................................................ 43 2.3.3.5. Dán nhãn và bảo quản ống chuẩn ......................................................... 44 2.3.3.6. Theo dõi độ ổn định của chất chuẩn đã thiết lập .................................. 44 2.3.4. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid bằng HPLC ................................................................................................................. 45 2.3.4.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................... 45 2.3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 45 2.3.5. Xây dựng quy trình định tính, định lượng CO1 trong lá Vối và nụ Vối bằng HPLC ................................................................................................................. 46 2.3.5.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................... 46 2.3.5.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 47 3.1. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ................. 47 3.1.1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc darutosid................................. 47 3.1.1.1. Chiết xuất, tinh chế ............................................................................... 47 3.1.1.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất đã tinh chế ..................................... 49
3.1.2. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc CO1 ........................................ 52 3.1.2.1. Chiết xuất, tinh chế ............................................................................... 52 3.1.2.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất CO1 đã tinh chế ............................ 56 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN ............................................................................................................. 59 3.2.1. Nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn gốc định lượng ....................... 59 3.2.1.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn darutosid .................................................................................................. 59 3.2.1.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng .................................................................................................................. 68 3.2.2. Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng .............................. 70 3.2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu CO1 . 70 3.2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn định lượng .................................................................................................................. 78 3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ..................................................................... 80 3.3.1. Kiểm tra chất lượng, đóng lọ và đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói 80 3.3.2. Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng ......................... 81 3.2.2.1 Xác định độ tinh khiết sắc ký ................................................................ 81 3.2.2.2. Xác định tạp chất bay hơi ..................................................................... 84 3.2.2.3. Xác định tạp chất vô cơ ........................................................................ 85 3.2.2.4. Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo .............................................. 85 3.3.3. Theo dõi độ ổn định của các chất chuẩn thiết lập được .......................... 86 3.3.3.1. Chất chuẩn darutosid ............................................................................ 87 3.3.3.2. Chất chuẩn CO1.................................................................................... 88 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM, NỤ VỐI VÀ LÁ VỐI ................... 89 3.4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC .......................................................... 89 3.4.1.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu ........................................................ 89 3.4.1.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid bằng HPLC ........................................................................................................ 90 3.4.1.3. Khảo sát hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm ................. 100
3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC....................................................................................... 100 3.4.2.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu ...................................................... 100 3.4.2.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 bằng HPLC ........... 102 3.4.2.3. Khảo sát hàm lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối .............................. 109 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 111 4.1. VỀ CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN ...................................................................................... 111 4.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối và cây Hy thiêm cần phân lập ......... 111 4.1.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Hy thiêm .............................................. 111 4.1.1.2. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối ....................................................... 112 4.1.2. Về chiết xuất và tinh chế các chất ......................................................... 113 4.1.3. Về xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng ........................................................ 115 4.2. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN . 116 4.2.1. Định tính, xác định cấu trúc chất chuẩn gốc ......................................... 116 4.2.2. Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc định lượng ......................... 116 4.2.2.1. Xác định tạp chất bay hơi ................................................................... 117 4.2.2.2. Xác định tạp chất vô cơ ...................................................................... 117 4.2.2.3. Xác định tạp chất hữu cơ .................................................................... 118 4.3. VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN............................................................. 121 4.3.1. Đóng lọ và đánh giá đồng nhất .............................................................. 121 4.3.1.1. Đóng lọ ............................................................................................... 121 4.3.1.2. Đánh giá đồng nhất ............................................................................. 122 4.3.2. Xác định giá trị ấn định ......................................................................... 123 4.3.3. Theo dõi độ ổn định ............................................................................... 125 4.4. VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM..... 126 4.4.1. Định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC ............................................................................................................... 126 4.4.2. Định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC .......... 128 4.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................... 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 131
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà phân tích hóa học Analytical Chemists ASEAN Association of South East Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á Asian Nations CO1 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy- 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′- 3′,5′-dimethylchalcone dimethylchalcon CRS Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học DAD Diode Array Detector Đầu dò dãy diod quang DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DSC Differential Scanning Phương pháp quét nhiệt vi sai Calorimetry EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu ESI-MS Electrospray Ionisation Mass Khối phổ ion hóa tia điện Spectrum GACP Good Agricultural and Thực hành tốt trồng trọt và thu hái Collection Practices GC Gas Chromatography Sắc ký khí GMP Good manufacturing practice Thực hành sản xuất tốt GTAĐ Giá trị ấn định HL Hàm lượng HPLC High-Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-LC- High Resolution Liquid Sắc ký lỏng khối phổ ion hóa tia ESI-MS Chromatography Electrospray điện phân giải cao Ionisation Mass Spectrum ICH International Conference on Hội nghị quốc tế về hòa hợp Harmonisation Int’P International Pharmacopeia Dược điển Quốc tế IR Infrared spectroscopy Quang phổ hồng ngoại ISO International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Organization
KL Khối lượng KHCN Khoa học và Công nghệ KNV Kiểm nghiệm viên KTCL Kiểm tra chất lượng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng NIST National Institute of Standard Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và and Technology Công nghệ Hoa Kỳ NSX Nhà sản xuất PCRS Primary Chemical Reference Chất chuẩn hóa học gốc Standard PHPLC Preparative High-Performance Sắc ký lỏng điều chế Liquid Chromatography PTN Phòng thí nghiệm RS Reference Substance Chất chuẩn đối chiếu RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCRS Secondary Chemical Chất chuẩn hóa học thứ cấp Reference Standard S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu đường nền Spic Diện tích pic TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TCLQ Tạp chất liên quan TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lượng TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TKSK Tinh khiết sắc ký USP United State Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV-VIS Ultravioliet – Visible Quang phổ tử ngoại – khả kiến Spectrophotometer WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Sigesbeckia 5 Bảng 1.2 Một số hợp chất phân lập từ Hy thiêm 9 Bảng 1.3 Vị trí phân loại của chi Cleistocalyx 13 Bảng 1.4 Một số hợp chất phân lập từ Vối 17 Bảng 2.1 Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Mẫu Dược liệu nụ Vối và lá Vối dùng trong nghiên cứu 33 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR (600 MHz) và 13C-NMR (150 MHz) 51 của chất darutosid và tài liệu tham khảo Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) 58 của chất CO1 và tài liệu tham khảo Bảng 3.3 Khảo sát phương pháp HPLC xác định TCLQ trong nguyên 60 liệu darutosid Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid 63 Bảng 3.5 Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của darutosid 64 Bảng 3.6 Khoảng tuyến tính darutosid 65 Bảng 3.7 Độ lặp lại dung dịch darutosid 66 Bảng 3.8 Độ chính xác trung gian dung dịch darutosid trên KNV 2 66 Bảng 3.9 Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch darutosid 67 Bảng 3.10 Khảo sát phương pháp xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1 70 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic CO1 74 Bảng 3.12 Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của CO1 74 Bảng 3.13 Khoảng tuyến tính CO1 75 Bảng 3.14 Độ lặp lại dung dịch CO1 76 Bảng 3.15 Độ chính xác trung gian dung dịch CO1 trên KNV 2 76 Bảng 3.16 Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch CO1 77 Bảng 3.17 Kết quả đánh giá đồng nhất trong quá trình đóng gói 80 Bảng 3.18 Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid 82 Bảng 3.19 Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn CO1 83
Bảng 3.20 Tổng hợp hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid và CO1 84 Bảng 3.21 Hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn CO1 và 85 darutosid Bảng 3.22 Hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn CO1 và 85 darutosid Bảng 3.23 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn darutosid 87 Bảng 3.24 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn CO1 88 Bảng 3.25 Kết quả đánh giá phương pháp chiết Hy thiêm 89 Bảng 3.26 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic kirenol 93 Bảng 3.27 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid 94 Bảng 3.28 Khoảng tuyến tính kirenol và darutosid 94 Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ đúng với kirenol 96 Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ đúng với darutosid 96 Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu Hy thiêm 97 Bảng 3.32 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trên mẫu Hy thiêm 98 Bảng 3.33 Độ lặp lại của diện tích pic kirenol trong dung dịch LOD, 99 LOQ Bảng 3.34 Độ lặp lại của diện tích pic darutosid trong dung dịch LOD, 99 LOQ Bảng 3.35 Hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm 100 Bảng 3.36 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic CO1 104 Bảng 3.37 Khoảng tuyến tính với CO1 105 Bảng 3.38 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử nụ Vối 106 Bảng 3.39 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử lá Vối 107 Bảng 3.40 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu nụ Vối và lá Vối 107 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trên mẫu nụ Vối 108 Bảng 3.41 và lá Vối Kết quả thẩm định giá trị LOD, LOQ trên mẫu nụ Vối và lá 109 Bảng 3.42 Vối Bảng 3.43 Hàm lượng CO1 trong các mẫu nụ Vối và lá Vối 109
DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh về cây Hy thiêm 6 Hình 1.2 Một số ent-pimarane diterpenoid trong Hy thiêm 8 Hình 1.3 Một số ent-kaurant diterpenoid trong Hy thiêm 9 Hình 1.4 Hình ảnh về cây Vối 14 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học các chất 1-7 của Vối 15 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học các chất 8-21 của Vối 16 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học chất 22 của Vối 16 Hình 1.8 Sơ đồ quá trình thiết lập chất chuẩn 23 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu của Luận án 35 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cao ethyl acetat từ Hy thiêm 47 Hình 3.2 Sơ đồ tinh chế darutosid 48 Hình 3.3 Phổ UV-Vis của dung dịch darutosid trong methanol 49 Hình 3.4 Phổ hồng ngoại của darutosid 50 Hình 3.5 Phổ HR-LC-ESI-MS của darutosid 50 Hình 3.6 Công thức cấu tạo của darutosid 52 Hình 3.7 Sơ đồ chiết xuất, phân lập 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy- 53 3′,5′-dimethylchalcon từ nụ Vối Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC phân đoạn CO1 54 Hình 3.9 HPLC điều chế phân lập CO1 55 Hình 3.10 Kiểm tra độ tinh khiết của CO1 bằng DSC 56 Hình 3.11 Phổ UV-Vis của dung dịch hợp chất CO1 trong 56 methanol Hình 3.12 Phổ hồng ngoại của hợp chất CO1 57 Hình 3.13 Phổ MS của hợp chất CO1 57 Hình 3.14 Công thức cấu tạo của chất CO1 (2′,4′-dihydroxy-6′- 59 methoxy-3′,5′-dimethylchalcon) Hình 3.15 SKĐ khảo sát điều kiện HPLC trên nguyên liệu 61 darutosid để thiết lập chuẩn Hình 3.16 SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong 62 darutosid Hình 3.17 Phổ UV-Vis của darutosid và các tạp chất liên quan 63
Hình 3.18 Đường chuẩn của darutosid 65 Hình 3.19 SKĐ khảo sát điều kiện HPLC xác định TCLQ trong 71 nguyên liệu CO1 Hình 3.20 SKĐ xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1 71 Hình 3.21 Phổ UV-Vis của CO1 và các tạp chất liên quan 72 Hình 3.22 SKĐ thẩm định độ đặc hiệu phép thử TCLQ trong CO1 73 Hình 3.23 Đường chuẩn của CO1 75 Hình 3.24 Các chất chuẩn đã thiết lập được 86 Hình 3.25 SKĐ khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu thử Hy thiêm 90 Hình 3.26 Chồng phổ UV-Vis và tinh khiết của pic kirenol 92 Hình 3.27 Chồng phổ UV-Vis và tinh khiết của pic darutosid 92 Hình 3.28 SKĐ thẩm định độ đặc hiệu dung dịch thử Hy thiêm 93 Hình 3.29 Định lượng kirenol trong Hy thiêm - Đường chuẩn 95 Hình 3.30 Định lượng darutosid trong Hy thiêm - Đường chuẩn 95 Hình 3.31 SKĐ thẩm định đặc hiệu các dung dịch thử nụ Vối và 104 lá Vối Hình 3.32 Định lượng CO1 trong Vối – Đường chuẩn 105
ĐẶT VẤN ĐỀ Dược liệu đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính khoảng 80% dân số trên thế giới hiện nay có sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe, đặc biệt ở các nước còn khó khăn, các vùng khó tiếp cận với nền y học hiện đại [103]. Những thập kỷ gần đây xu thế con người quay trở lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng phổ biến làm tăng đáng kể nhu cầu về dược liệu trên toàn thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 1999 có 65 quốc gia thừa nhận và quản lý lưu hành dược liệu và thuốc từ dược liệu thì con số này đã tăng lên là 116 quốc gia vào năm 2012 và 124 nước vào năm 2018. Do đó, thị trường dược liệu đã phát triển toàn cầu và điều này đòi hỏi các quốc gia phải chú ý đến vấn đề đảm bảo chất lượng, an toàn, hiệu quả đối với dược liệu và thuốc từ dược liệu. Một trong những mục tiêu trong “Chiến lược hành động của Tổ chức Y tế thế giới với thuốc cổ truyền giai đoạn 2014 - 2023” là “Tăng cường đảm bảo chất lượng, an toàn, sử dụng hợp lý, hiệu quả thuốc cổ truyền” [89]. Tại Việt Nam, “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” theo quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng chính phủ nêu rõ mục tiêu thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dược liệu chiếm 30% [23]. Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tướng chính phủ “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030” đã chỉ ra một trong những giải pháp để nâng cao chất lượng thuốc từ dược liệu là tăng dần tỷ lệ nguyên liệu (cao chiết, tinh dầu, bột dược liệu) được tiêu chuẩn hóa trong các nhà máy sản xuất thuốc theo nguyên tắc, tiêu chuẩn GMP-WHO, đến năm 2030 năm đạt 100% nguyên liệu được tiêu chuẩn hóa [22]. Hy thiêm Siegesbeckia orientalis (L.) thuộc họ Cúc - Asteraceae là một dược liệu được nhân dân ta sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền, đã được chứng minh có tác dụng điều trị các bệnh phong thấp, bán thân bất toại, đau nhức các khớp xương, chữa các bệnh phong, bệnh hoa liễu, chữa suy nhược thần kinh, mất ngủ và cao huyết áp. Hy thiêm cũng được xác định là một trong 24 dược liệu có tiềm năng có thể khai thác tự nhiên [22]. Dược điển Trung Quốc [67] và Tiêu 1
chuẩn Hồng Kông về dược liệu [42] đều yêu cầu định lượng chất đánh dấu kirenol trong Hy thiêm. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, Hy thiêm trồng ở một số vùng của Việt Nam không chứa hoặc chứa ít kirenol, trong khi chứa một lượng đáng kể darutosid một diterpenoid được chứng minh có tác dụng tương đương kirenol trong chống viêm, làm lành vết thương [24], [25], [26], [98]. Vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim – Myrtaceae được coi là một vị thuốc quý. Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực, hạ đường huyết. Một số nghiên cứu chỉ ra 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′- dimethylchalcon (CO1) là thành phần flavonoid chính trong Vối [29], [37], [93]. Hợp chất CO1 được chứng minh có tác dụng chống viêm [43], [97], [99], tác dụng phục hồi tế bào gan [86], tác dụng làm giảm hấp thu glucose trên tế bào cơ và tế bào tạo mỡ nuôi cấy [62]. Hy thiêm, nụ Vối và lá Vối đều là các dược liệu được sử dụng lâu đời ở Việt Nam. Các dược liệu này đều đã được đưa vào DĐVN V. Tuy nhiên các chuyên luận trong DĐVN V còn đơn giản, chưa có định tính, định lượng các chất đánh dấu như xu hướng chung trong kiểm tra chất lượng dược liệu. Xuất phát từ thực tế đó luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam” đã được thực hiện với một số mục tiêu nghiên cứu như sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy Thiêm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ tinh khiết và đủ khối lượng để thiết lập chất chuẩn gốc. - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid và CO1 tinh chế được. - Thiết lập chất chuẩn gốc darutosid và CO1 - Ứng dụng chất chuẩn thiết lập được xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối, lá Vối. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1.1.1. Sự cần thiết phải có chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu Tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu nhằm mục đích đảm bảo chất lượng dược liệu được sử dụng làm thuốc, đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị. Để tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu thì ngoài các chỉ tiêu về cảm quan, định tính bằng soi bột, vi phẫu, phản ứng hóa học, còn cần có các chỉ tiêu định tính đảm bảo tính đặc hiệu hơn, định lượng được hoạt chất, chất đánh dấu trong dược liệu. Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế các hoạt chất, chất đánh dấu từ dược liệu nhằm tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu là xu thế chung trong đảm bảo chất lượng dược liệu trên thế giới. Châu Âu là cái nôi của thuốc hóa dược, tuy nhiên Dược điển Châu Âu cũng rất chú trọng trong xây dựng các chuyên luận dược liệu. Dược điển Châu Âu 10 (EP 10) có 214 chuyên luận dược liệu, trong đó có 208 chuyên luận bắt buộc phải sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng, 116 chuyên luận sử dụng các phương pháp phân tích đặc hiệu như HPLC, GC để định lượng chất đánh dấu [44]. Dược điển Nhật 17 (xuất bản năm 2016), bản tiếng Anh có 143 chuyên luận dược liệu. Trong đó 38 chuyên luận sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng [56]. Dược điển Nhật 18 (xuất bản năm 2021), bản tiếng Anh có 145 chuyên luận dược liệu. Trong đó số chuyên luận sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng tăng lên 66 chuyên luận [57]. Dược điển Trung Quốc 2015, bản tiếng Anh có 583 chuyên luận dược liệu. Trong đó 332 chuyên luận sử dụng phương pháp HPLC, GC định lượng chất đánh dấu [67]. Tiêu chuẩn Hồng Kông về dược liệu (từ tập 1- tập 10, xuất bản năm 2015 – 2020) có 323 chuyên luận dược liệu. Trong đó 310 chuyên luận định lượng chất đánh dấu bằng HPLC, GC [42]. DĐVN IV có hiệu lực năm 2010 có 264 chuyên luận dược liệu. Có 26 chuyên luận (chiếm 10%) bắt buộc sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng. Trong đó chỉ có 07 chuyên luận (chiếm 3%) định lượng chất đánh dấu bằng HPLC/GC [7]. DĐVN V (có hiệu lực từ năm 2018) có 372 chuyên luận về dược liệu và thuốc từ dược liệu tăng 58 chuyên luận so với DĐVN IV. Trong đó có 310 chuyên 3
luận dược liệu. Số lượng các chuyên luận sử dụng các phương pháp phân tích đặc hiệu để định tính, định lượng chất đánh dấu “marker” tăng hơn gấp ba so với DĐVN IV nhưng vẫn còn rất hạn chế, 83 chuyên luận (chiếm 27%) bắt buộc sử dụng chất đánh dấu cho định tính, định lượng. Trong đó chỉ có 59 chuyên luận (chiếm 19%) có định lượng chất đánh dấu bằng phương pháp HPLC, GC [8]. Như vậy có thể thấy sử dụng chất đánh dấu trong kiểm tra chất lượng dược liệu là xu hướng chung từ các nước phát triển mạnh về công nghiệp hóa dược như các nước Châu Âu đến các nước Châu Á có nền y học cổ truyền phát triển như Nhật Bản, Hồng Kông, Trung Quốc. Nhận thức được tầm quan trọng đó DĐVN V đã có đột phá về số chuyên luận bắt buộc sử dụng chất đánh dấu cho định tính/định lượng cũng như số chuyên luận có sử dụng HPLC/GC để định lượng chất đánh dấu so với DĐVN IV – tăng tương ứng là 3 lần và 8 lần. Tuy nhiên do chưa có nhiều nghiên cứu xác định thành phần chính, chất đánh dấu, chất có hoạt tính sinh học trong các dược liệu trồng tại Việt Nam, xây dựng phương pháp định tính/định lượng chất đánh dấu, thiết lập chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm dược liệu nên số chuyên luận bắt buộc sử dụng chất đánh dấu trong định tính/định lượng còn rất khiêm tốn. 1.1.2. Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược liệu Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới năm 2017 về “Lựa chọn chất đánh dấu có nguồn gốc dược liệu trong kiểm nghiệm dược liệu và thuốc có nguồn gốc từ dược liệu” định nghĩa [87]: - Chất đối chiếu là chất có công thức hóa học được xác định (thích hợp cho mục đích tiêu chuẩn hóa hoặc kiểm tra chất lượng dược liệu) - Chất đánh dấu là chất đối chiếu được xác định có trong thành phần hóa học của dược liệu. Chất đánh dấu có thể đóng góp vào tác dụng dược lý của dược liệu hoặc không. Tuy nhiên kể cả trường hợp có đóng góp vào tác dụng dược lý của dược liệu thì cũng không đủ bằng chứng để chứng tỏ rằng chỉ mình chất đánh dấu đó tạo nên tác dụng dược lý của dược liệu. Dược liệu và chế phẩm thuốc từ dược liệu rất phức tạp, do vậy việc định tính, định lượng là rất khó khăn. Định tính, định lượng chất đánh dấu trong dược liệu là chưa đủ để đảm bảo chất lượng dược liệu. Đảm bảo chất lượng dược liệu phải đi từ nuôi trồng thu hái tốt (GACP), sản xuất tốt (GMP). Việc lựa chọn chất chuẩn 4
có nguồn gốc dược liệu cho phép thử định tính, định lượng dược liệu và thuốc có nguồn gốc dược liệu tuân theo nguyên tắc ưu tiên sau: (1) Lựa chọn thành phần mà tác dụng điều trị đã được xác định. (2) Trường hợp chưa xác định được thành phần như đã nêu ở mục (1), lựa chọn thành phần có các tác dụng dược lý đã được thừa nhận. (3) Trường hợp chưa xác định được thành phần như đã nêu ở mục (1) và mục (2), lựa chọn chất đánh dấu là thành phần hóa học đặc trưng cho loài dược liệu đó, hoặc đặc trưng cho chi dược liệu đó, hoặc đặc trưng cho họ dược liệu đó. Các chất đánh dấu phải đáp ứng các yêu cầu sau: Chọn lọc và đặc hiệu với một phương pháp phân tích xác định; Tồn tại trong dược liệu ở hàm lượng đủ để định tính hoặc định lượng; Dễ chiết tách, tinh chế và bền vững ở điều kiện bảo quản xác định; Có thể dễ dàng phân tích định tính, định lượng) [87] 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.2.1. Hy thiêm 1.2.1.1. Vị trí phân loại Dược liệu Hy thiêm là phần trên mặt đất của cây Hy thiêm, có tên La tinh là Herbal Sigesbeckiae. Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiospermae) ở Việt Nam” [1], Thực vật chí Việt Nam [4], Thực vật chí Trung Quốc [74], Hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [31], Hệ thống phân loại của Linnaeus Carl von [63], vị trí phân loại chi Sigesbeckia trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1.1 Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Sigesbeckia Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopside (Lớp Ngọc Lan) Phân lớp Asteridae (Phân lớp Cúc) Bộ Asteraceae (Bộ Cúc) Họ Asteraceae (Họ Cúc) Chi Sigesbeckia Chi Sigesbeckia ở Việt Nam có 4 loài, trong đó loài có tên Hy thiêm (Sigesbeckia orientalis L.) được dùng phổ biến làm thuốc [9] 5
Tên khoa học: Sigesbeckia orientalis L., họ Cúc Asteraceae. Tên khoa học hiện chưa thống nhất giữa các tài liệu. Theo Dược điển Việt Nam [8], Dược điển Trung Quốc [67], Tiêu chuẩn Hồng Kông về dược liệu [42], tên chi là Siegesbeckia. Tuy nhiên có tài liệu cho rằng 2 tên chi này là tương đương nhau [1]. Tên gọi khác: Cỏ đĩ, Chó đẻ hoa vàng [9] 1.2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Hy thiêm là cây thảo sống hàng năm, cao chừng 30 – 90cm có nhiều cành nằm ngang. Thân cành đều có lông. Lá mọc đối, hình tam giác hay hình quả trám, dài 4 – 10 cm, rộng 3 – 6 cm có cuống ngắn, phiến lá men theo cuống, mép có răng cưa không đều và đôi khi 2 thuỳ ở phía cuống; 3 gân chính mảnh toả ra từ gốc. Hoa đầu có cuống dài 1-2cm. Bao chung có hai loại lá bắc; 5 lá ngoài to, hình thìa dài 5-10mm, mọc tỏa ra thành hình sao, có lông dính; các lá bắc khác ngắn hơn họp thành một bao chung quanh các hoa, 5 hoa phía ngoài là hoa cái hình lưỡi, các hoa khác hình ống, lưỡng tính, đều có tràng hoa màu vàng. Quả bế hình trứng 4 – 5 cạnh, màu đen. Mùa hoa quả tháng 4-7 [9]. Phân bố: phân bố ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Nội, Hòa Bình, vào đến Thanh Hóa, Hà Tĩnh [9]. Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây Hy thiêm 1.2.1.3. Thành phần hóa học Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy diterpenoid là thành phần chính, ngoài ra còn có các nhóm chất khác như sesquiterpen lacton, phenolic, steroid. 6