Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỮU CƠ MÃ SỐ: 9 44 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trần Văn Lộc

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: TS. Trần Văn Chiến

HÀ NỘI, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng sự.

Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực, các kết quả mới của luận án

chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020

Tác giả luận án

Lê Văn Hải

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Văn Lộc

và TS. Trần Văn Chiến, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn tôi thực hiện

luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung, PGS. TS. Nguyễn

Quyết Chiến, TS. Trần Thị Phƣơng Thảo đã cho tôi những góp ý hữu ích trong thời

gian học tập và thực hiện luận án. Xin cảm ơn các cán bộ phòng Tổng hợp Hữu cơ-

Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm của luận án.

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa

học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cán bộ Viện

Hóa học, cán bộ phòng Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ, đã tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Xin cảm ơn quỹ

phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (Nafosted) đã tài trợ cho nghiên cứu

này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố mẹ, anh chị em của tôi, đã hỗ trợ

và động viên tôi hoàn thành luận án này. Xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn

cổ vũ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.

Và cuối cùng, luận án này không thể hoàn thành nếu không có sự đồng hành

của Vợ và các con tôi. Xin dành sự biết ơn sâu sắc và trân quý nhất đến Vợ tôi,

ngƣời đã luôn hỗ trợ và chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020

Tác giả

Lê Văn Hải

iii

MỤC LỤC Trang

i LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii

iii MỤC LỤC ....................................................................................................................

vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................

viii DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... ix

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... xi

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. NIÊM KHUẨN, CÁC HOẠT CHẤT VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC .................. 3

1.1.1. Niêm khuẩn ....................................................................................................... 3

1.1.2. Một số hoạt chất và hoạt tính sinh học từ niêm khuẩn ..................................... 3

1.2. VI ỐNG VÀ VAI TRÒ TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC .................................. 8

1.2.1. Vi ống (microtube) ............................................................................................ 8

1.2.2. Tác dụng ức chế trùng hợp vi ống..................................................................... 9

1.3. TUBULYSIN ..................................................................................................... 10

1.3.1. Phân lập và xác định cấu trúc .......................................................................... 10

1.3.2. Hoạt tính sinh học của các tubulysin .............................................................. 12

1.3.3. Sinh tổng hợp các tubulysin ............................................................................ 15

1.4. TỔNG HỢP CÁC ɤ-AMINO ACID CỦA TUBULYSIN .................................. 17

1.4.1. Tổng hợp tubuvaline (Tuv) ............................................................................. 17

1.4.2. Tổng hợp tubuphenylalanine (Tup) ................................................................ 20

DẪN XUẤT TUBULYSIN ............................................................................... 23

1.5. TƢƠNG QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC

1.6. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN ............................................................................. 28

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM............. 29

2.1. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 29

2.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ........................................................................ 29

2.1.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ ............................................ 29

2.1.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ............................................. 30

2.2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 31

2.2.1. Hóa chất và dung môi ..................................................................................... 31

2.2.2. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide ...................................................... 31

2.2.3. Tổng hợp tubuphenylalanine ........................................................................... 32

2.2.4. Tổng hợp tubuvaline ....................................................................................... 35

2.2.5. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của Tuv (79) và Tup (47a) .................................... 42

2.2.6. Tổng hợp dipeptide ......................................................................................... 43

2.2.7. Tổng hợp tripeptide. ........................................................................................ 45

2.2.8. Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin .................................................................... 48

2.2.9. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin............................................................. 52

2.2.10. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự

tubulysin ........................................................................................................ 65

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 66

3.1. ĐỊNH HƢỚNG TỔNG HỢP TUBULYSIN VÀ DẪN XUẤT .......................... 66

3.2. TỔNG HỢP TUBUPHENYLALANINE ........................................................... 67

3.3. TỔNG HỢP TUBUVALINE ............................................................................. 72

3.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14) ....... 73

3.3.2. Tổng hợp N-methyltubuvaline-OMe (79) ....................................................... 76

3.4. LOẠI BỎ NHÓM BẢO VỆ BOC CỦA TUV VÀ TUP ..................................... 84

3.5. TỔNG HƠP DIPEPTIDE ................................................................................... 85

3.6. TỔNG HỢP TRIPEPTIDE ................................................................................. 89

3.6.1. Tổng hợp tripeptide 88 .................................................................................... 89

3.6.2. Tổng hợp tripeptide 89 .................................................................................... 90

3.6.3. Tổng hợp tripeptide 90, 90b ............................................................................ 92

3.6.4. Tổng hợp các tripeptide 91, 92........................................................................ 94

3.7. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN .................................................. 96

3.8. TỔNG HỢP CÁC CHẤT TƢƠNG TỰ TUBULYSIN ...................................... 99

3.8.1. Tổng hợp chất tƣơng tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine ........ 99

3.8.2. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N-

terminal ......................................................................................................... 101

3.8.3. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu C-

terminal ......................................................................................................... 105

3.8.4. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N- và C-

terminal ......................................................................................................... 108

TỰ TUBULYSIN ............................................................................................. 117

3.9. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT VÀ CHẤT TƢƠNG

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 121

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................................................ 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 124

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phƣơng pháp phổ và sắc ký

TLC

1H-NMR

C-NMR

ESI-HRMS

DEPT

ROESY Thin Layer Chromatography: Sắc ký bản mỏng High resolution electrospray ionization mass spectrometry: Phổ khối phân giải cao ion hóa phun điện tử Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 Distortioless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy: Phổ hiệu ứng Overhauser hạt nhân khung xoay.

s: singlet; d: doublet; t: triplet; q: quartet; qui: quintet; m: multiplet; dd: double doublet; br: broad; td: triplet of doublets; dt: doublet of triplets

Các dòng tế bào ung thƣ

HL-60 MCF-7 A549 HT29 SW480 Human leukemia cell line: Tế bào ung thƣ bạch cầu ngƣời Human mammary adenocarcinoma cell: Tế bào ung thƣ vú Bronchogenic carcinoma cell lines: Tế bào ung thƣ phế quản Human colorectal adenocarcinoma: Tế bào ung thƣ ruột kết Human colon carcinoma: Tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời

Các chữ viết tắt khác

CTPT tub Tuv Tup Mep TBSCl DIPEA

IC50

r.t DMF THF EtOAc Me TEA TFA eq DMAP

HATU Công thức phân tử Tubulysin Tubuvline Tubuphenylalanine N-methylpipecolic acid tert-Butyldimethylsilyl chloride N,N-Diisopropylethylamine The half maximal inhibitory concentration: Nồng độ tác dụng ức chế 50% sự tăng sinh dòng tế bào thử nghiệm Room temperature: nhiệt độ phòng N,N-Dimethylformamide Tetrahydrofuran Ethylacetate Methyl Triethylamine Trifluoroacetic acid Equivalent: Đƣơng lƣợng 4-Dimethylaminopyridine N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridin-1- ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N- oxide

vii

Ac h

HBTU

Acetyl Giờ (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate Dichloromethane Triisopropylsilane tert-Butyloxycarbonyl 2-Iodoxybenzoic acid Enzym nonribosomal peptide synthetases Enzym polyketide synthase DCM TIPS Boc IBX NRPS PKS

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Khả năng ức chế phát triển tế bào ung thƣ của các tubulysin…….. 13

Bảng 1.2: Ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ của tub A,D…………………. 14

Bảng 1.3: Độc tính tế bào của tubulysin A và D………………………........... 14

Bảng 1.4: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 56-59……………………....... 24

Bảng 1.5: Hoạt tính gây độc tế bào của các tubugi………………………....... 25

Bảng 1.6: Độc tính tế bào của các dẫn xuất tub 63, 64……………………..... 25

Bảng 1.7: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tub 65……………………...... 26

Bảng 1.8: Các dẫn xuất thế đầu C của tub 66……………………………....... 26

Bảng 1.9: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 67………………………........ 27

Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự 119 tubulysin tổng hợp đƣợc ……….…………………………………

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 : Một số hình thể dạng quả đa bào của niêm khuẩn……………... 3

Hình 1.2 : Một số cấu trúc macrolide từ niêm khuẩn……………………… 5

Hình 1.3 : Một số cấu trúc liên hợp thuốc- kháng thể của tubulysin……… 6

Hình 1.4 : Một số cấu trúc peptide từ niêm khuẩn………………………… 7

Hình 1.5 : Cấu trúc hóa học của eliamide và ratjadone …………………... 7

Hình 1.6 : Quá trình hình thành vi ống…………………………………….. 8

Hình 1.7 : Vi ống trong quá trình phân bào………………………………... 9

Hình 1.8 : Vùng liên kết của các tác nhân trên vi ống……………………... 10

Hình 1.9 : Chuỗi amino acid của tub A and D…………………………….. 11

Hình 1.10: Công thức hóa học của các tubulysin thiên nhiên……………… 12

Hình 1.11: Các dẫn xuất tub 56-59…………………………………………. 24

Hình 1.12: Các dẫn xuất tubugi…………………………………………….. 25

Hình 1.13: Các dẫn xuất tub 63, 64………………………………………… 25

Hình 1.14: Các dẫn xuất 65 ………………………………………………... 26

Hình 1.15: Các dẫn xuất tub 66 ……………………………………………. 26

Hình 1.16: Các dẫn xuất 67 ………………………………………………... 27

Hình 1.17: Tƣơng quan hoạt tính - cấu trúc của tubulysin ……………….. 27 Hình 3.1 : Phổ 1H-NMR hợp chất 42 ……………………………………... 70 Hình 3.2 : Phổ 1H-NMR hợp chất 47a ……………………………………. 72 Hình 3.3 : Phổ 1H-NMR hợp chất 70 ……………………………………... 74 Hình 3.4 : Phổ 1H-NMR hợp chất 14 ……………………………………... 76 Hình 3.5 : Phổ 1H-NMR Weinreb amide 22a …………………………….. 78 Hình 3.6 : Phổ 1H-NMR hợp chất 74 ……………………………….......... 79 Hình 3.7 : Phổ 1H-NMR hợp chất 15a …………………………………… 81 Hình 3.8 : Phổ 1H-NMR hợp chất 78 ……………………………………... 83 Hình 3.9 : Phổ 1H-NMR hợp chất 83 ……………………………………... 83 Hình 3.10: Phổ 1H-NMR hợp chất 81 …………………………………….. 85 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR hợp chất 84 ……………………………………... 87 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR hợp chất 85 ……………………………………... 88

Hình 3.13: Phổ 1H-NMR hợp chất 88 …………………………………….. 90 Hình 3.14: Phổ 1H-NMR hợp chất 89 ……………………………………... 92 Hình 3.15: Phổ 1H-NMR hợp chất 90 ……………………………………... 93 Hình 3.16: Phổ 13C-NMR hợp chất 90 …………………………………….. 94 Hình 3.17: Phổ 1H-NMR hợp chất 91 ……………………………………... 95

Hình 3.18: Phổ HRMS hợp chất 95 ……………………………………….. 97 Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất 95 ……………………………………... 97 Hình 3.20: Phổ 13C-NMR hợp chất 95 …………………………………….. 98 Hình 3.21: Phổ 1H-NMR hợp chất 96……………………………………… 100 Hình 3.22: Phổ 1H-NMR hợp chất 97 ……………………………………... 102 Hình 3.23: Phổ 1H-NMR hợp chất 100 ……………………………………. 104 Hình 3.24: Phổ 13C-NMR hợp chất 100 …………………………………… 105 Hình 3.25: Phổ 1H-NMR hợp chất 102 ……………………………………. 106 Hình 3.26: Phổ 1H-NMR hợp chất 104 ……………………………………. 108 Hình 3.27: Phổ 1H-NMR hợp chất 105 ……………………………………. 109 Hình 3.28: Phổ 13C-NMR hợp chất 105 …………………………………… 110 Hình 3.29: Phổ 1H-NMR hợp chất 106 ……………………………………. 111 Hình 3.30: Phổ 1H-NMR hợp chất 107 ……………………………………. 112 Hình 3.31: Phổ 1H-NMR hợp chất 108 …………………………………… 113 Hình 3.32: Phổ 1H-NMR hợp chất 109 ……………………………………. 115

Hình 3.33: Phổ MS hợp chất 110…………………………………………... 116 Hình 3.34: Phổ 1H-NMR hợp chất 110…………………………………….. 116

Hình 3.35: Các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin tổng hợp đƣợc ………. 118

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang

Sơ đồ 1.1 : Quá trình sinh tổng hợp tubulysin trong niêm khuẩn…………… 16

Sơ đồ 1.2 : Tổng hợp N,N-Boc, Me-tubuvaline theo Colombo và Wipf……. 18

Sơ đồ 1.3 : Tổng hợp N-Boc-tubuvaline-OMe theo DÖmling………………. 18

Sơ đồ 1.4 : Tổng hợp N,N-Boc-tubuvaline theo Raghavan ………………… 19

Sơ đồ 1.5 : Tổng hợp N,N-Boc,Me-tubuvaline theo Nicolaou……………… 19

Sơ đồ 1.6 : Tổng hợp dẫn xuất N-Cbz-tubuvaline-OEt (36) theo Wipf…….. 20

Sơ đồ 1.7 : Tổng hợp Tubutyrosine hydrochloride theo Pando…………….. 21

Sơ đồ 1.8 : Tổng hợp Tup-OTBDPS theo Wipf…………………………….. 21

Sơ đồ 1.9 : Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Muller……………………………. 22

Sơ đồ 1.10: Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Zanda……………………………. 22

Sơ đồ 1.11: Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Tamure…………………………... 23

Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide……………………… 32

Sơ đồ 3.1 : Định hƣớng tổng hợp tubulysin…………………………………. 67

Sơ đồ 3.2 : Tổng hợp ester 42 ………………………………………………. 68

Sơ đồ 3.3 : Cơ chế tạo thành chất 42 ……………………………………….. 69

Sơ đồ 3.4 : Phản ứng tổng hợp Tup 47a …………………………………….. 71

Sơ đồ 3.5 : Sơ đồ tổng hợp ngƣợc của Tuv 79…………………………….... 73

Sơ đồ 3.6 : Tổng hợp dẫn xuất thiazole 14 …………………………………. 73

Sơ đồ 3.7 : Cơ chế tạo thành chất 70 ………………………………………... 75

Sơ đồ 3.8 : Phản ứng gắn mạch giữa Weinred amide và 2-bromothiazole…. 75

Sơ đồ 3.9 : Tổng hợp Weinreb amide 73 …………………………………… 77

Sơ đồ 3.10: Cơ chế tạo thành hợp Weinreb amide 22a ……………………… 77

Sơ đồ 3.11: Phản ứng tổng hợp ketone 74 …………………………………... 79

Sơ đồ 3.12: Cơ chế tạo thành hợp chất 74 …………………………………... 80

Sơ đồ 3.13: Phản ứng tổng hợp tuv 15a ……………………………………... 80

Sơ đồ 3.14: Phản ứng tổng hợp chất 79 ……………………………………... 82

Sơ đồ 3.15: Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của hợp chất 42, 47a, 79 …………… 84

Sơ đồ 3.16: Phản ứng tổng hợp tripeptide từ dipeptide 78………………….. 86

Sơ đồ 3.17: Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86 ……………………….. 87

xii

Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp tripeptide 88 ……………………………….. 89

Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp tripeptide 89………………………………… 91

Sơ đồ 3.20: Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b ………………………….. 92

Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp các tripeptide 91, 92 ……………………….. 94

Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 93, 93a, 94, 95……………….. 96

Sơ đồ 3.23: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 93 từ tripeptide 88………………… 99

Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất 96 ………………………………… 100

Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp các hợp chất 97, 98 ………………………… 102

Sơ đồ 3.26: Phản ứng tổng hợp hợp chất 99 ………………………………… 103

Sơ đồ 3.27: Phản ứng tổng hợp hợp chất 100, 101…………………………... 103

Sơ đồ 3.28: Phản ứng tổng hợp hợp chất 102, 103 ………………………….. 106

Sơ đồ 3.29: Phản ứng tổng hợp hợp chất 104………………………………... 107

Sơ đồ 3.30: Phản ứng tổng hợp hợp chất 105, 106 ………………………….. 109

Sơ đồ 3.31: Phản ứng tổng hợp hợp chất 107 ……………………………….. 111

Sơ đồ 3.32: Phản ứng tổng hợp hợp chất 108 ……………………………….. 113

Sơ đồ 3.33: Phản ứng tổng hợp tetrapeptide 109 ……………………………. 114

Sơ đồ 3.34: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 110 ……………………………….. 115

MỞ ĐẦU

Các hợp chất thiên nhiên đƣợc xem là nguồn cung cấp vô hạn các lớp chất có

hoạt tính sinh học lý thú phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Sự

phong phú và đa dạng về các lớp khung chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là

cơ chế tác dụng của mỗi lớp khung chất này, đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các

nhà nghiên cứu từ trƣớc đến nay. Cho đến nay, việc nghiên cứu các hoạt chất từ các

nguồn vi sinh vật đã và đang thu đƣợc các kết quả tốt trong việc phát triển thuốc.

Các nghiên cứu từ vi khuẩn cho thấy, niêm khuẩn cung cấp số lƣợng đáng kể các

hoạt chất có hoạt tính sinh học (chiếm khoảng 5%) [1-4]. Với lƣợng lớn các chất thể

hiện hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh, trong đó một số hoạt chất đã đƣợc phát

triển thành thuốc ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ nhƣ epothilone và một số

dẫn xuất [5,6]. Tuy nhiên, một trong các hạn chế từ lớp niêm khuẩn là các hoạt chất

đều chứa hàm lƣợng rất nhỏ, không đáp ứng đƣợc nhu cầu của việc nghiên cứu

chuyên sâu. Do đó để phục vụ cho mục đích nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp

chất từ các nguồn vi sinh vật này thƣờng đạt đƣợc bằng cách tổng hợp toàn phần

hoặc sẽ đƣợc biến đổi về cấu trúc hóa học nhằm tạo ra lƣợng lớn sản phẩm cũng

nhƣ các dẫn xuất mới.

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào sàng lọc, phát triển các lớp

chất có hoạt tính gây độc tế bào cao, nhằm phát triển các thuốc kháng ung thƣ. Cho

đến nay các hoạt chất can thiệp vào chu trình của tế bào, quá trình hình thành hoặc

phân rã của vi ống, đã cho hiệu quả cao trong hóa trị liệu ung thƣ. Điều này do vai

trò đặc biệt quan trọng của vi ống cho sự sống của tế bào ung thƣ, giữ vai trò thiết

yếu cho sự phát triển và phân bào, duy trì hình thái học và có thể gây cảm ứng dẫn

đến chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [7,8]. Do vậy, các nghiên cứu phát

triển thuốc dựa trên đích là vi ống hứa hẹn nhiều triển vọng với hiệu quả tốt.

Tubulysin là một lớp chất tetrapeptide, đƣợc phân lập lần đầu tiên năm 2000

từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An d48 và Archangium gephyra

Ar 315 [9]. Các nghiên cứu đã cho thấy tubulysin là lớp chất kháng phân bào tốt

nhất đƣợc biết đến cho tới nay. Hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của các tubulysin

thể hiện trong phạm vi rộng trên nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ: ung thƣ

buồng trứng, ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ruột kết, phổi và ung thƣ máu

[10,11].

Nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và cơ thể sống (in vivo) cho thấy các

tubulysin có độc tính với tế bào ung thƣ cao, giá trị IC50 trên một số dòng tế bào ung

thƣ từ vài chục picomol đến vài nanomol. Tubulysin ức chế sự phát triển tế bào u

vƣợt trội khoảng 20-1000 lần so với các thuốc chống ung thƣ đang sử dụng nhƣ

vinblastine, epothilone hay taxol [10,12].

Các tubulysin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào qua cơ chế ức chế trùng hợp

vi ống, dẫn đến bắt giữ phân bào (G2/M) và gây chết tế bào theo chƣơng trình

[10,13].

Theo đánh giá của các nhà hóa dƣợc, tubulysin thiên nhiên là hợp chất hàng

đầu cho nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thƣ mới. Tuy nhiên, hàm lƣợng

của chúng trong niêm khuẩn rất thấp, do đó hƣớng nghiên cứu tổng hợp toàn phần

các tubulysin và các dẫn xuất của chúng là rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học.

Đề tài “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất

tubulysin” tiến hành nghiên cứu tổng hợp toàn phần các dẫn xuất và chất tƣơng tự

tubulysin mới dựa trên biến đổi hóa học của các amino acid ở đầu N- và C-terminal,

thay thế nhóm N,O- acetyl bằng nhóm methyl. Nhằm góp phần làm sáng tỏ tƣơng

quan giữa hoạt tính và cấu trúc hóa học của lớp chất tubulysin, đồng thời tìm kiếm

những hợp chất mới có hoạt tính sinh học đáng chú ý.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. NIÊM KHUẨN, CÁC HOẠT CHẤT VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

1.1.1. Niêm khuẩn

Niêm khuẩn (vi khuẩn nhớt) là nhóm vi khuẩn gram âm thuộc bộ

δ-proteobacteria, sống chủ yếu trong đất, xác thực vật, phân động vật và trong môi

trƣờng biển. Hầu hết các loài niêm khuẩn có các biểu hiện khác biệt về hình dạng so

với các vi khuẩn khác là khả năng tập hợp lại với nhau để tạo thành kiểu hình thể

dạng quả đa bào phức tạp trong điều kiện thiếu thức ăn (Hình 1.1) [1-3].

Đặc tính sinh học nổi bật của niêm khuẩn là khả năng tạo ra các lớp chất

chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học lý thú. Đến nay, đã có hơn 500 hợp chất,

dựa trên 100 cấu trúc khung cơ sở khác nhau đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc

hóa học. Các hợp chất này đều thể hiện các hoạt tính sinh học đa dạng nhƣ: hoạt

tính kháng nấm, kháng khuẩn, gây độc tế bào, kháng vi-rút, ức chế miễn dịch và

chống oxy hóa. Trong đó hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thƣ

thể hiện nổi trội nhất, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển thuốc

[3,5,14,15].

Hình 1.1: Một số hình thể dạng quả đa bào của niêm khuẩn [2,3].

1.1.2. Một số hoạt chất và hoạt tính sinh học từ niêm khuẩn

Niêm khuẩn đƣợc xem là nguồn sản xuất các lớp chất thứ cấp đa dạng về cấu

trúc với những hoạt tính sinh học lý thú. Các lớp chất từ niêm khuẩn đã góp phần

quan trọng trong phát triển các thuốc mới điều trị các bệnh truyền nhiễm và đặc biệt

là các bệnh liên quan đến khối u [16,17]. Trong đó, nhóm các hợp chất có hoạt tính

mạnh đã đƣợc quan tâm nghiên cứu và cho một số kết quả tốt, nhƣ tubulysin (1),

epothilone (2), disorazol (3). Một dẫn xuất bán tổng hợp từ epothilone là

ixabepilone đã đƣợc Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê

chuẩn cho phép sử dụng là thuốc điều trị ung thƣ vú di căn kháng taxane vào năm

2007 [6]. Bên cạnh đó, một lƣợng lớn các lớp chất đã và đang đƣợc nghiên cứu để

phát triển thành các thuốc chống ung thƣ mới.

Lớp chất macrolide: Nhiều macrolide có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đƣợc

phân lập từ niêm khuẩn.

Epothilone (2) (Hình 1.2). Đƣợc phân lập năm 1993 bởi Höfle và cộng sự từ

chi Sorangium cellitlosum SMP44 [18,19], epothilone có cấu trúc khung macrolide.

Hợp chất macrolactone này có chứa vòng thiazole ở mạch nhánh thể hiện hoạt tính

kháng nấm và khả năng gây độc tế bào mạnh. Năm 1995, Bollag và cộng sự chứng

minh cơ chế hoạt động của epothilone tƣơng tự nhƣ taxol, đó là thúc đẩy trùng hợp

và làm bền hóa vi ống dẫn đến cảm ứng gây chết tế bào theo chƣơng trình.

Epothilone đã đƣợc nghiên cứu thử nghiệm in vivo từ năm 2003 và nếu vƣợt

qua các đánh giá của thử nghiệm lâm sàng dẫn chất này sẽ thay thế taxol trong điều

trị các khối u đa kháng thuốc [5].

Disorazole (3) (Hình 1.2), đƣợc phân lập từ chi Sorangium cellulosum

Soce12 bởi Jansen và cộng sự năm 1993 [20,21]. Lớp chất disorazole là những

macrodilactone của hai hợp chất 2-pentadecyloxazol-4-carboxylic acid, với một số

sự thay đổi vị trí và cấu hình của các liên kết đôi và các nhóm thế oxi nhƣ epoxi,

hydroxyl hoặc methyl ether trong mạch carbon. Các hợp chất macrodilactone thể

hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào ung thƣ ngƣời. Disorazol

A1 gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô phổi, với giá trị IC50 = 2 pM và

trên dòng tế bào nguyên bào sợi (L-929) của chuột với IC50 = 3 pM [20-22]. Trong

một kết quả nghiên cứu khác, disorazol C1 thể hiện hoạt tính chống tăng sinh với

nhiều tế bào khối u, gây ra sự lão hóa tế bào sớm và cảm ứng dẫn đến quá trình chết

tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [23].

Các archazolid (4) (Hình 1.2) đƣợc phân lập bởi Sasse và cộng sự năm 2003

từ việc nuôi cấy các niêm khuẩn chủng Archangium gephyra và Cystobacter sp..

Các hợp chất này cũng bao gồm một vòng macrolactone có chứa vòng thiazole ở

mạch nhánh. Nghiên cứu về tác dụng sinh học cho thấy các chất thể hiện hoạt tính

mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thƣ của động vật có vú, với các giá trị IC50 trên

các dòng tế bào khác nhau từ 0,1 đến 1 ng/ml [24].

Chivosazol (5) (Hình 1.2) đƣợc phân lập bởi Irschik và cộng sự năm

Hình 1.2. Một số cấu trúc macrolide từ niêm khuẩn

1995 từ chi Sorangium cellulosumstrain Soeel2. Chất 5 có cấu trúc vòng lớn

với một vòng oxazol và liên kết glycoside với 6-deoxyglucose tại C-11.

Chivosazol cho thấy hoạt tính với các loại nấm men và nấm sợi, và biểu hiện hoạt

tính mạnh với các dòng tế bào của động vật có vú [25].

Lớp chất peptide: Tiêu biểu cho lớp chất peptide phân lập từ niêm khuẩn có

thể kể đến nhƣ tubulysin (1), chondramide (6), bengamide (7), nannocystin (8)

Tubulysin (1).(Hình 1.3), là tetrapeptide đƣợc phân lập năm 2000 từ 2 dòng

niêm khuẩn Archangium gephyra và Cystobacter sp. Lớp chất tubulysin đƣợc đánh

giá có hoạt tính với một số dòng tế bào ung thƣ mạnh hơn từ 20 đến 100 lần

vinblastine và taxol [10,13]. Tubulysin D thể hiện tác dụng độc tính đối với dòng tế

bào ung thƣ bạch cầu ngƣời (HL-60), và dòng tế bào U-lympho mô bào ngƣời (U-

937) ở giá trị IC50 = 3 pM.

Các tubulysin đang đƣợc nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu thử nghiệm

kết hợp với các kháng thể đơn dòng bằng cách tạo các liên hợp thuốc- kháng thể

(antibody-drug conjugates) nhằm giảm độc tính đối với các tế bào thƣờng, trong khi

vẫn duy trì đƣợc hoạt tính mạnh đối với các dòng tế bào ƣng thƣ (Hình 1.3). Sự phát

triển tiền lâm sàng của tubulysin là chất chống ung thƣ mới hứa hẹn thu đƣợc nhiều

kết quả đáng chú ý [10,26,27].

Hình 1.3. Một số cấu trúc liên hợp thuốc- kháng thể (ADCs) của tubulysin [27]

Cấu trúc depsipeptide trong chondramide (6) (Hình 1.4) đƣợc phân lập từ

loài Chondromyces crocatus bởi Jansen và cộng sự năm 1995 [28], thể hiện hoạt

tính kháng nấm và gây độc tế bào ở nồng độ vài nanomol. Cấu trúc vòng lớn của

chondramide chứa ba amino acid và một polyketide: alanine, N-methyltryptophan,

α-methoxy-β-tyrosine và 7-hydroxytrimethyloctenoic acid.

Bengamide (7) (Hình 1.4), đƣợc phân lập từ loài Myxococcus virescens và

loài bọt biển Jaspis coriacea [29,30]. Bengamide chứa các yếu tố cấu trúc bất

thƣờng, bao gồm các hợp chất sinh tổng hợp ketide và amino acid cùng nhau tạo ra

các chất kháng khuẩn và gây độc tế bào thú vị. Nghiên cứu trong ống nghiệm (in

vitro) trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô tuyến vú ở ngƣời (MDA-MB-435) cho thấy,

các bengamide A và O thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lƣợt là 1 nM và

0,3 nM.

Đƣợc phân lập từ chi Nannocystis sp., có cấu trúc vòng lớn với 9 trung tâm

lập thể bao gồm một tripeptide, một phần polyketide và một nữa epoxyamide.

Nannocystin (8) (Hình 1.4) đƣợc biết đến với tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào

ở nồng độ nanomol thông qua việc gây chết tế bào theo chƣơng trình [31].

Hình 1.4. Một số cấu trúc peptide từ niêm khuẩn

Một số cấu trúc khác: Polyketide mạch dài Eliamid (9) (Hình 1.5) một đầu

có chứa nhóm tetramic acid amide, đƣợc phân lập năm 2012 từ chi Sorangium

cellulosum bởi Höfle và cộng sự. Chất 9 ức chế mạnh phức hợp I (NADH-

ubiquinone oxyoreductase) của chuỗi hô hấp ty thể với IC50 tƣơng ứng 20 nM.

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của 9 cho thấy các tác động đặc biệt trên dòng tế bào

ung thƣ hạch (U-937), ung thƣ biểu mô (A-431) và tế bào ung thƣ cổ tử cung (KB-

3.1) ở ngƣời; dòng tế bào nguyên bào sợi ở chuột (L-929), với giá trị IC50 lần lƣợt là

0,5; 3,0; 1,0 và 0,5 ng/mL [32].

Ratjadone (10) (Hình 1.5) đƣợc phân lập năm 1995 với khung α-pyrone.

Chất 10 thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào, đặc biệt ratjadone

C có tác dụng ức chế tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt (PC-3) và tế bào ung thƣ biểu

mô (KB-V1) ở nồng độ 0,08 ng/mL [33].

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của eliamide và ratjadone

1.2. VI ỐNG VÀ VAI TRÕ TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC

1.2.1. Vi ống (microtube)

Vi ống là thành phần chính của tế bào nhân chuẩn và có vai trò quan trọng

trong các chức năng tế bào khác nhau nhƣ di chuyển và vận chuyển nội bào, duy trì

hình dạng tế bào, truyền tín hiệu tế bào [34]. Bên cạnh đó vi ống còn đóng một vai

trò quan trọng trong việc phân chia tế bào bằng cách tham gia vào sự di chuyển của

tế bào và gắn vào các nhiễm sắc thể trong các giai đoạn phân bào [35].

Về mặt cấu trúc, các vi ống đƣợc tạo bởi hai tiểu đơn vị protein hình cầu là

α- và β-tubulin (Hình 1.6). Hai tiểu đơn vị này kết hợp với nhau tạo thành một

dimer dị thể (α,β-heterodimer), các dimer sau đó lắp ráp thành dạng cấu trúc hình

ống (sự trùng hợp tubulin). Các dimer tubulin tự sắp xếp theo kiểu đầu - đuôi với

tiểu đơn vị α của dimer này liên kết với tiểu đơn vị β của dimer kia, sự sắp xếp này

dẫn đến sự hình thành các sợi protein hay còn gọi là sợi tơ giao thức

(protofilaments). Các sợi tơ tự sắp xếp song song tạo thành một tấm protein hình

chữ C, sau đó cuộn lại để tạo thành cấu trúc hình ống gọi là vi ống (microtubule).

Hình 1.6. Quá trình hình thành vi ống [36]

Sự sắp xếp đầu-đuôi của các dimer dị thể (heterodimer) dẫn đến sự phân cực

của vi ống, với tiểu đơn vị α ở một đầu và tiểu đơn vị β- ở đầu kia. Đơn vị α-tubulin

kết thúc mang điện âm (-), trong khi β-tubulin kết thúc mang điện dƣơng (+) [34].

Các vi ống ở trạng thái cân bằng động với các tế bào bên trong của α- và

β -tubulin, chúng liên tục xảy quá trình phát triển và rút ngắn bởi sự liên kết thuận

nghịch và sự phân ly của các dị thể dimer α /β -tubulin ở cả hai đầu. Điều này dẫn

đến sự di chuyển ngƣợc nhau của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào [37].

1.2.2. Tác dụng ức chế trùng hợp vi ống

Các vi ống tham gia vào các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào. Trong

giai đoạn đầu-pha trƣớc (prophase), các vi ống bắt đầu hình thành và phát triển về

phía các nhiễm sắc thể mới, tạo thành trục phân bào (gồm một bó các vi ống) (Hình

1.7). Giai đoạn bắt đầu của pha giữa (prometaphase) và ở pha giữa (metaphase),

trục phân bào tự gắn vào nhiễm sắc thể tại một điểm đặc biệt gọi là kinetochore, tại

đây các vi ống trải qua nhiều chu kỳ phát triển và rút ngắn tƣơng ứng với các dao

động qua lại của nhiễm sắc thể. Các quá trình này tiếp tục đƣợc diễn ra trong pha

sau (anaphase). Do đó, sự hiện diện của một tác nhân có tác dụng vào động học của

vi ống là có thể ngăn chặn chu kỳ tế bào và dẫn đến tế bào chết theo chƣơng trình

(apoptosis) [35,38].

Quá trình trùng hợp vi ống bắt đầu xảy ra khi nồng độ các đơn vị α/β -tubulin

đạt đến bảo hòa. Sự trùng hợp theo cơ chế kéo dài mầm (nhân), bắt đầu bằng việc

hình thành chậm một vi ống „hạt nhân‟ ngắn, sau đó là quá trình kéo dài nhanh

chóng các vi ống ở đầu của nó bằng sự bổ sung tubulin dimer không thể đảo ngƣợc

[36].

Hình 1.7. Vi ống trong quá trình phân bào [37]

Các chất can thiệp vào động học của vi ống, tức là tác động vào quá trình

phát triển (polymerization) hoặc rút ngắn (depolymerization) của vi ống. Nhóm các

chất ức chế trùng hợp tubulin (chất ức chế trùng hợp) làm giảm khối lƣợng vi ống

trong các tế bào ở nồng độ cao, chúng hoạt động nhƣ các tác nhân gây bất ổn vi

ống, tiêu biểu là: colchine, dolastatins, lớp chất vinca alkaloids (vinblastine,

vincristine, vinorelbine), lớp chất tubulysin [34,36].

Hình 1.8. Vùng liên kết của các tác nhân trên vi ống [39]

Các vinca alkaloids liên kết với β-tubulin, ngăn chặn sự trùng hợp của β -

tubulin thành các vi ống dẫn đến làm mất ổn định vi ống. Các vinca tạo ra vùng liên

kết vinca trên tubulin với hai vị trí liên kết riêng biệt trên các vi ống (Hình 1.8): liên

kết ái lực cao với tubulin ở đầu vi ống, và ái lực thấp với tubulin dọc theo bề mặt vi

ống. Đồng thời chúng cũng tự làm tăng ái lực của tubulin cho chính nó, dẫn đến sự

hình thành các tổ hợp xoắn ốc ngăn cản sự trùng hợp. Các vinca đƣợc xem là lớp

chất gây ra quá trình khử polyme hóa vi ống, ức chế tiến trình phân bào và dẫn đến

chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [34].

Tƣơng tự dolastatin, các tubulysin thiên nhiên ức chế mạnh sự phát triển trên

nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời cũng theo cơ chế ức chế trùng hợp tubulin.

Tubulysin chiếm vị trí liên kết vinca trên β-tubulin, ức chế sự trùng hợp của β-

tubulin dẫn đến gây chết tế bào theo chƣơng trình [12]. Cơ chế này ngƣợc lại với

epothilone, có tác dụng thúc đẩy sự trùng hợp tubulin, làm bền hóa vi ống và do đó

ngăn chặn sự phân chia tế bào [9,13,40].

1.3. TUBULYSIN

1.3.1. Phân lập và xác định cấu trúc

Tubulysin (1) (Hình 1.10) là các tetrapeptide thiên nhiên, đƣợc phân lập bởi

Höfle và cộng sự năm 2000 từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An

d48 và Archangium gephyra Ar 315 [9].

Các tubulysin chứa 4 amino acid khác nhau gồm: isoleucin (Ile), các amino

acid ít gặp trong tự nhiên nhƣ N-methyl pipecolinic acid (Mep), tubuvaline (Tuv)

[sự lai hóa của cặp amino acid Valine và Cystein], tubuphenylalanine (Tup), hoặc

tubutyrosin (Tut) [sự kéo dài mạch của phenylalanine hoặc tyrosin] (Hình 1.9).

Hình 1.9: Chuỗi amino acid của tub A and D

Sự khác nhau về số lƣợng và bản chất của các nhóm thế dẫn đến sự đa dạng

về cấu trúc và hoạt tính sinh học của lớp chất tubulysin.

Năm 2000, 4 tubulysin (A, B, D, E) đƣợc Höfle và cộng sự phân lập từ 2

dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis và Archangium gephyra [9]. Năm 2004,

cũng từ 2 dòng niêm khuẩn đó Steinmetz, Höfle và cộng sự đã phân lập đƣợc thêm

5 tubulysin mới gồm các tubulysin C, F, H, I, G) [10].

Đến năm 2009, tiền chất tubulysin D (pretubulysin D) đƣợc A. Ullrich và

cộng sự phân lập từ dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis [41].

Tiếp nối các nghiên cứu về tubulysin trên các chủng niêm khuẩn, năm 2010

Yi Chai và cộng sự đã phân lập đƣợc thêm 5 tubulysin ký hiệu U, X, W, V, Z, tiền

chất của tubulysin A (pretubulysin A) và 3 dẫn xuất của tubulysin A, E, D từ 2

chủng niêm khuẩn Angiococcus disciformis An d48 và Cystobacter sp. SBCb004

[42].

Đến nay đã có 14 tubulysin, 3 dẫn xuất và 2 tiền chất tubulysin đƣợc phân

lập và xác định cấu trúc (Hình 1.10). Các tubulysin và tiền chất đã đƣợc phân lập

trên 3 dòng niêm khuẩn là Archangium gephyra Ar 315 (tubulysin A, B, C, I, G),

Angiococcus disciformis An d48 (tubulysin A, B, D, E, F, H, U, pretubulysin D) và

Cystobacter sp. SBCb004 (tubulysin X, W, pretubulysin A).

Hình 1.10. Công thức hóa học của các tubulysin thiên nhiên

1.3.2. Hoạt tính sinh học của các tubulysin

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lớp chất tubulysin cho thấy chúng

không có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm men nhƣng thể hiện hoạt tính mạnh

trên các dòng tế bào ung thƣ động vật có vú [9,10,43,44].

Theo Hoefle và cộng sự [10] các tubulysin A-I đều thể hiện hoạt tính

chống tăng sinh mạnh. Trong đó, tubulysin D, F và H thể hiện hoạt tính mạnh hơn

các tubulysin A, C, G và I (có một nhóm hydroxy phenolic) mà không phụ thuộc

vào kích thƣớc của các nhóm thế trên Tuv -11-acyloxy. Chất 1D và 1A là những

chất có nhóm thế 3- methylbutyryl thể hiện hoạt tính mạnh nhất, trong khi 1H và 1I

với nhóm thế acetyl có hoạt tính yếu hơn, các hoạt tính này có giá trị từ 0,011 đến

0,68 ng/mL (Bảng 1.1)

IC50 (ng/mL)

Tubulysin

L929 0.011 0.013 0.015 0.031 0.07 0.091 0.093 0.30 0.68

KB-V.1 0.25 0.25 0.35 1.3 1.4 2.3 2.9 4.0 6.8

Ức chế trùng hợp tubulin (%) [a] 47 48 50 36 46 57 39 57 34

D E F H A B G C I

[a]: Xác định tại 10 µM tubulin và 1 µM tubulysin

Trong các nghiên cứu khác của Kaur và Ullrich cho thấy khả năng chống

Bảng 1.1: Khả năng ức chế phát triển tế bào ung thƣ của các tubulysin

tăng sinh trên một số dòng tế bào của tubulysin A (1A) mạnh gấp 10 đến 1000 lần

so với vinblastine và paclitaxel (Bảng 1.2). Trong một số thử nghiệm in vitro, 1A

còn thể hiện tiềm năng trong việc gây chết tế bào ung thƣ theo chƣơng trình mà

không ảnh hƣởng đến các tế bào thƣờng [43,44].

Các pretubulysin trong nghiên cứu in vitro cũng cho thấy ức chế di chuyển tế

bào ung thƣ và do vậy có thể làm giảm khả năng di căn của khối u. Hoạt chất

pretubulysin D (1PD) thể hiện tác dụng chống ung thƣ mạnh qua nghiên trên cơ thể

(in vivo) với dòng tế bào ung thƣ biểu mô gan, kết quả cho thấy khối lƣợng khối u

giảm đáng kể (17 lần) sau 16 ngày điều trị mà không có bất kỳ tác dụng phụ rõ ràng

nào. Bên cạnh đó, các vi mạch máu của khối u ít biểu hiện hơn khi đƣợc so sánh với

các nhóm đối chứng [45-47].

Trong nghiên cứu của Balasubramanian và cộng sự cho thấy tác dụng chống

tăng sinh mạnh của tub U (1U) trên dòng tế bào ung thƣ buồng trứng (1A9) và ung

thƣ vú (MCF-7) với giá trị IC50 lần lƣợt là 0.65 nM và 0.4 nM. Tác dụng ức chế

trùng hợp tubulin trong nghiên cứu in vitro ở giá trị IC50= 1.9 µM [48].

IC50 (nM)

GI50 (nM)

Hợp chất

HL60 HCT116 MCF7 A549 HTC-15

HL60

HCT116

Bảng 1.2: Ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ của tub A,D

1A

n.d

1D

0.0047

0.0031

0.67

0.013

0.10±0.12 n.d

0.059±0.03 n.d

0.007±0.004 n.d

Paclitaxel

139±40

1.95 ±1.01

0.066±0.064

n.d

Vinblastine

1.0

0.79

14.4±7.8

0.94 ±0.51

0.072 ±0.08

* n.d: Không xác định

Ngoài ra, các tubulysin có tác dụng ức chế đa kháng thuốc khối u cổ tử cung

(KB-V1), các dòng tế bào gây đa kháng thuốc khác đƣợc biểu hiện qua P-

glycoprotein với giá trị IC50 từ 0.1 đến 10 nM, trong đó chất 1A và 1D có hoạt tính

vƣợt trội (Bảng 1.3). Cả hai chất 1A và 1D đều có hoạt tính gây ức chế tốt dòng tế

bào ung thƣ đa kháng thuốc P-glycoprotein (P-gp) cổ tử cung, với giá trị IC50=0.31

nM, 1A biểu hiện đặc tính ức chế đa kháng thuốc đối với dòng tế bào ung thƣ ruột

kết (HTC-15) với giá trị GI50 = 0.12 nM [9,10,43,44].

Các tubulysin cho thấy đều thể hiện tác dụng ức chế trùng hợp tubulin. Các

chất có tác dụng ức chế trùng hợp vi ống đƣợc xác định gây ra quá trình chết tế bào

theo chƣơng trình (apoptotic) đối với các tế bào ung thƣ [10,43]. Đánh giá tác dụng

gây độc tế bào ung thƣ của tubulysin D (1D) qua cơ chế ức chế trùng hợp tubulin

trên các dòng tế bào ung thƣ bạch cầu tủy (K-562), ung thƣ cổ tử cung (KB-3.1),

ung thƣ sợi mô liên kết (L929), tế bào đa kháng thuốc (KB-V1) cho thấy, 1D thể

hiện hoạt tính mạnh gấp 10 đến 1000 lần so với các tác nhân khác nhƣ taxol,

vinblastine, epothilone và dolastatin 10 (Bảng 1.3) [12].

IC50 (ng/mL)

Dòng tế bào

Bảng 1.3: Độc tính tế bào của tubulysin A và D

1A

1D

1PA

Taxol Vinblastine Epothilone B Dolastatin 10

K562 KB3.1 L929 KB-V.1 HL-60 A549

0.35 0.04 0.022 2.32 0.16 0.018 3.87 0.21 0.017 n.d n.d 0,08 0.05 0.003 0.014 4.35 0.09 0.006

10 10 80 150 n.d n.d

6 7 15 120 n.d n.d

0,3 0,6 0,7 0,3 n.d n.d

0,1 0,2 0,1 1,2 n.d n.d

* n.d: Không xác định

So với taxol hay vinblastine cấu trúc hóa học của 1D ít phức tạp hơn, điều

này cho thấy triển vọng lớn đối với lớp chất tubulysin.

Các tubulysin thiên nhiên đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển tế bào

ung thƣ vƣợt trội so với các thuốc đang đƣợc sử dụng hóa trị liệu (taxan, epothilone,

vinca alkaloid). Các hoạt tính nổi bật này làm cho tubulysin trở thành lớp chất đầy

hứa hẹn trong nghiên cứu và phát triển thành tác nhân thuốc điều trị bệnh ung thƣ.

1.3.3. Sinh tổng hợp các tubulysin

Con đƣờng sinh tổng hợp tubulysin đƣợc nhóm nghiên cứu của Muller đề

xuất năm 2004 trên dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis And48 [40, 40b] và

nhóm của Y.Chai đề xuất năm 2010 trên dòng niêm khuẩn Cystobacter sp.

SBCb004 [42]. Các kết quả cho thấy không có sự khác nhau nhiều về cơ chế sinh

tổng hợp tubulysin trên 2 dòng niêm khuẩn này. Theo đó, tubulysin đƣợc tổng hợp

bằng cách ngƣng tụ các amino acid thông qua tổ hợp gene đƣợc hình thành từ tổ

hợp các enzym nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) và polyketide synthase

(PKS).

Tổ hợp NRPS-PKS bao gồm 7 mô-đun (2 PKS và 5 NRPS) trên 5 protein

(TubB- F) sản sinh ra pretubulysin A hoặc pretubulysin D, tiếp đó xảy ra các quá

trình oxy hóa, acyl hóa và một số chuyển hóa nhỏ khác để chuyển các pretubulysin

thành tubulysin (Sơ đồ 1.1).

Quá trình sinh tổng hợp có thể đƣợc chia thành 3 giai đoạn chủ yếu sau:

+ Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp pipecolinic acid từ nguyên liệu đầu L-lysine : L-

lysine đƣợc đề amin hóa và đóng vòng dƣới tác dụng của enzym cyclodeaminase

trong protein TubZ tạo thành acid pipecolinic.

+ Giai đoạn 2: Tổng hợp pretubulysin: Acid pipecolic đƣợc chuyển sang protein

TubB và đƣợc methyl hóa dƣới tác dụng của miền MT (methylate transferase) một

vị trí giữa miền A (adenylation- domain) của protein TubB có chức năng methyl

hóa. Các pipecolic acid này tiếp tục đƣợc gắn thêm isoleucine và valine dƣới tác

dụng của miền C, A, PCP trong protein TubC và đƣợc methyl hóa bỡi miền MT của

TubC tƣơng tự miền MT trong TubB.

Sản phẩm trung gian của quá trình sinh tổng hợp đƣợc chuyển sang protein

TubD, gồm một tổ hợp các module PKS và NRPS.

Đơn vị đầu tiên trong protein TubD là miền KS đại diện của PKS chứa một

vòng lặp hoàn chỉnh với bán phần malonate đƣợc sử dụng cho việc kéo dài chuổi,

kết quả này phù hợp với sản phẩm cuối cùng. Thứ tự các miền trong module PKS

của TubD có sự khác biệt so với các hệ thống PKS đã biết khác. Sự sắp xếp không

điển hình tƣơng tự cũng đƣợc tìm thấy ở module PKS trong TubF.

Sơ đồ 1.11: Quá trình sinh tổng hợp tubulysin trong niêm khuẩn

NRPS của TubD chứa miền A với chức năng vòng hóa dị vòng đặc hiệu đối

với cysteine, miền PCP và miền Ox (nằm phía sau PCP). Miền Ox đƣợc biết đến là

có khả năng oxy hóa dị vòng thiazoline.

Protein TubE kéo dài chuổi với phenylalanine hoặc tyrosine, dẫn đến việc

sản xuất ra tubulysin A hoặc D tƣơng ứng.

TubF, protein cuối cùng trong dây chuyền sản xuất tubulysin chứa tám miền

hoạt động, nó đƣợc xem là module PKS loại I lớn nhất. Giữa các miền KR và DH,

xuất hiện miền MT, có khả năng methyl hóa β-keto trung gian tại vị trí α, cho kết

quả nhóm methyl ở vị trí 2 của tubulysin. Các sản phẩm trung gian đƣợc bão hòa

bởi hoạt động của các miền KR, DH và ER, liên kết với ACP đƣợc giải phóng do

hoạt động của miền TE chuyển thành dạng axit tự do trong các pretubulysin.

+ Giai đoạn 3: Chuyển hóa pretubulysin thành tubulysin: Quá trình oxy hóa, acyl

hóa và một số chuyển hóa khác đối với pretubulusin A hoặc D để tạo thành các

tubulysin.

1.4. TỔNG HỢP CÁC γ-AMINO ACID CỦA TUBULYSIN

Các nghiên cứu tổng hợp toàn phần tubulysin và dẫn xuất đều hƣớng đến

việc đơn giản hóa quy trình tổng hợp hai γ-amino acid là tubuphenylalanine (Tup)

và tubuvaline (Tuv). Việc tổng hợp Tuv và Tup (hoặc Tut) là các công việc phức

tạp và khó khăn, do yêu cầu cao về các nhóm chức có sự chọn lọc lập thể, trong đó

cấu hình ở vị trí Cα của các γ-amino acid đặc biệt quan trọng. Do vậy, trong luận án

này chúng tôi tập trung chủ yếu vào tổng quan các phƣơng pháp tổng hợp

tubuphenylalanine (Tup) và tubuvaline (Tuv).

1.4.1. Tổng hợp tubuvaline (Tuv)

Tubuvaline là amino acid quan trọng nhất trong việc duy trì hoạt tính sinh

học của lớp chất tubulysin. Việc tổng hợp thành công các tubulysin phụ thuộc nhiều

vào kết quả tổng hợp ɤ- amino acid này. Các nghiên cứu cho thấy rằng, tổng hợp

tubuvaline thƣờng bắt đầu từ valine amino acid bằng cách gắn thêm 1 hoặc 2

nguyên tử carbon vào mạch valine trƣớc khi gắn vòng thiazole để tạo thành Tuv.

Wipf [49] và Colombo [50] đã đƣa ra quy trình tổng hợp N,N-Boc, methyl-

tubuvaline (16) bắt đầu từ Cbz-valine (11) qua 12 bƣớc phản ứng để thu đƣợc sản

phẩm mong muốn, nhƣ trình bày trên sơ đồ 1.2.

Theo phƣơng pháp tổng hợp này, Cbz-valine (11) đƣợc nối dài thêm một

nguyên tử carbon tạo methyl ester 12 bằng phản ứng Arndt-Eistert. Sau 6 bƣớc

phản ứng tiếp theo chất 12 đƣợc chuyển thành N,N-Boc,Me-homovalinal (13).

Bƣớc phản ứng chính trong quy trình tổng hợp của Wipf và Colombo là gắn vòng

bromothiazol-OTBS (14) vào chất 13 bằng phản ứng Grignard với tác nhân sec-

BuMgCl trong điều kiện khan ở nhiệt độ thấp thu đƣợc 2 đồng phân lập thể Tuv-

CH2OTBS (15a và 15b; với tỷ lệ 2:1), và hiệu suất phản ứng 60%. Từ hợp chất 15a

qua phản ứng acetyl hóa, desilyl hóa, khử hóa alcol thành andehyde và oxi hóa

andehyde thu đƣợc chất 16, với hiệu suất tổng đạt trên 60%.

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp N,N-Boc, Me-tubuvaline theo Colombo và Wipf [49]

Theo hƣớng nghiên cứu của Dömling [11], chất N-Boc-TuvOMe (20) đƣợc

tổng hợp trong 1 bƣớc phản ứng từ hợp phần 3 cấu tử gồm Boc-L-homovalinal (17), isonitrile (18) và thioacetic acid (19) với sự xúc tác BF3.Et2O/THF ở -78 oC, phản ứng khuấy qua đêm (Sơ đồ 1.3).

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp N-Boc-tubuvaline-OMe theo DÖmling

Phản ứng đạt hiệu suất 40% với tỷ lệ đồng phân lập thể tại C-α là 3:1. Quy

trình của Dömling mặc dù ít bƣớc phản ứng nhƣng cần những tác nhân chọn lọc

phức tạp, yêu cầu về điều kiện phản ứng cao.

Parker [51] và Raghavan [52] đã đƣa ra quy trình tổng hợp N,N-Boc-

tubuvaline (26) bằng phản ứng chính giữa Weinreb amide 22 tạo vòng với 2-

bromothiazol-OTBS (14) bằng xúc tác BuLi (Sơ đồ 1.4).

Theo Raghavan và cộng sự [52], hợp chất Weinreb amide 22, tạo thành từ

hợp chất diazoketone 21 với sự xúc tác của bạc (I), đƣợc gắn vòng 2-bromothiazol-

OTBDPS (14) trong môi trƣờng bazơ mạnh nBuLi tạo dẫn xuất ketone 23. Chất 23

qua phản ứng desilyl hóa và oxi hóa thu đƣợc acid 25. Nhóm ketone tiếp tục đƣợc

khử chọn lọc và acetyl hóa thu đƣợc 26.

Sơ đồ 1.4: Tổng hợp N,N-Boc-tubuvaline theo Raghavan

Phƣơng pháp tổng hợp tubuvaline theo Raghavan qua những phản ứng đơn

giản, tác nhân phản ứng dễ tìm, quy trình dễ thực hiện, hiệu suất chung khá cao.

Trong một nghiên cứu khác, Nicolaou và cộng sự [53,54] đã thực hiện phản

ứng giữa N,N-Boc,Me -homovalinal (13) và vòng thiazole acetate 27 với sự có mặt

của PI(OCOCF3)2, hiệu suất phản ứng đạt 81% (Sơ đồ 1.5). Dẫn xuất ketone 28 tạo

thành đƣợc khử hóa chọn lọc bằng BH3-Me2S/(S)-CBS, alcol 29 qua tiếp 4 bƣớc

phản ứng tạo thành N,N-Boc,Me- tubuvaline (16) với hiệu suất chung 66%.

Sơ đồ 1.5: Tổng hợp N,N-Boc,Me-tubuvaline theo Nicolaou

Theo kết quả nghiên cứu của Wipf và cộng sự [55] chất N-Cbz-

tubuvalineOEt (36) đƣợc tổng hợp qua 9 bƣớc, bắt đầu bằng phản ứng oxi hóa N-

Cbz-valinol 30 và tăng mạch carbon bằng phản ứng Wittig tạo ester không no 31.

Phản ứng chính tạo vòng thiazole của 36 đƣợc tổng hợp trực tiếp từ dẫn xuất

thioamide 35 với ethyl bromopyruvate, phản ứng đạt hiệu suất 70% (Sơ đồ 1.6).

Sơ đồ 1.6: Tổng hợp dẫn xuất N-Cbz-tubuvaline-OEt (36) theo Wipf

Ngoài ra, xuất phát từ aziridine đƣợc tổng hợp từ L-valine, bằng phản ứng

mở vòng với allylMgBr để tăng mạch carbon trƣớc khi tạo thành tubuvaline qua 10

bƣớc phản ứng tiếp theo, trong đó phản ứng chính đạt hiệu suất trên 70% đã đƣợc

Chandrasekhar và cộng sự báo cáo trong một nghiên cứu về tổng hợp các hợp phần

chính tuv-tup của tubulysin [56].

1.4.2. Tổng hợp tubuphenylalanine (Tup)

Cùng với tubuvaline, tubuphenylalanine (Tup)/tubutyrosine (Tut) là một ɤ-

amin acid quan trọng trong cấu trúc tubulysin. Đây là một trong 2 đơn vị cấu trúc

quyết định hoạt tính mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thƣ của lớp chất này.

Phenylalanine thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là tác nhân ban đầu trong quy trình tổng

hợp Tup. Việc chèn thêm nguyên tử carbon vào mạch của phenylalanine thƣờng

đƣợc thực hiện qua phản ứng Wittig trƣớc khi tạo sản phẩm ɤ-amino acid Tup.

Pando và Wipf đã tổng hợp HCl*H-Tut-OH (40) qua 5 bƣớc phản ứng, bắt

đầu từ N-Boc-4-BnO-phenylalaniol (37). Theo quy trình tổng hợp của Pando và

cộng sự [57], chất 37 bị oxi hóa dƣới tác dụng của TEMPO, trƣớc khi thực hiện

phản ứng Wittig để tăng mạch carbon tạo ra dẫn xuất ethyl ester không no 38. Chất

38 đƣợc khử bởi H2 xúc tác Pd/C tạo ra hỗn hợp đồng phân N-Boc-Tut-OEt (39) với

tỷ lệ 2,5:1 (Sơ đồ 1.7). Chất 39 đƣợc thủy phân trong môi trƣờng kiềm và loại bỏ

Sơ đồ 1.7. Tổng hợp Tubutyrosine hydrochloride theo Pando

nhóm bảo vệ Boc nhận đƣợc HCl*H-Tut-OH (40).

Wipf thực hiện chuyển hóa ester 42 qua 4 bƣớc phản ứng tạo thành hỗn hợp

sản phẩm đồng phân isomer N-Boc-tubuphenylalaniol (43) với tỷ lệ 3:1 (Sơ đồ 1.8).

Chất 43a đƣợc bảo vệ nhóm hydroxyl bằng tert-Butyl(chloro)diphenylsilane

(TBDPSCl) và loại bỏ nhóm bảo vệ Boc thu đƣợc hợp chất Tup-OTBDPS (44) [55]

Sơ đồ 1.8. Tổng hợp Tup-OTBDPS theo Wipf

Theo Muller và cộng sự [41], để tạo ra ester không no 42, chất N-Boc- phenylalanine methyl ester (45) đƣợc khử hóa với DIBAL ở -78oC tạo aldehyde

trung gian và theo sau bởi phản ứng Wittig. Hợp chất ethyl ester 42 sau đó đƣợc

chuyển thành dẫn xuất ester của menthol 46 qua phản ứng Steglich. Phản ứng khử

46 bằng H2 xúc tác Pd/C đƣợc hỗn hợp đồng phân với tỷ lệ 4:1 đạt hiệu suất 95%.

Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc chất 47a thu đƣợc HCl*H-Tup-OH 48 (Sơ đồ 1.9).

Sơ đồ 1.9. Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Muller

Trong một quy trình tƣơng tự Muller, Zanda và cộng sự [58,59], đã tổng hợp

HCl*H-Tup-OH (48) bắt đầu bằng phản ứng acyl hóa giữa menthol với

bromoacetyl bromide. Hợp chất 49 tạo ra đƣợc phản ứng với triphenylphosphine và

methyl iodide thu đƣợc dẫn xuất phosphine 51 là tác nhân chính cho phản ứng

Wittig với N-Boc-phenylalaninal 52 (Sơ đồ 1.10). Ester không no 46 đƣợc khử

bằng H2 có mặt Pd/C thu đƣợc hỗn hợp đồng phân lập thể 47 với tỷ lệ 2:1. Chất 47a

đƣợc thủy phân trong HCl đặc (6N) tạo thành axit Tup (48) với hiệu suất 97%.

Sơ đồ 1.10. Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Zanda

Tamure và cộng sự [60,61] đã thực hiện phản ứng tăng mạch carbon của

phenylalanine bằng phản ứng Evans aldol mà không sử dụng phản ứng Wittig (Sơ

đồ 1.11). Theo đó, phản ứng Evans aldol đƣợc thực hiện giữa N-Boc-phenylalaninal

(52) và một dẫn xuất oxazolidinone 53 có mặt của xúc tác (Z)-boronenolate, sau đó

hỗn hợp đƣợc xử lý với H2O2/MeOH tạo ra chất 54 với độ chọn lọc lập thể cao và

hiệu suất đạt 77%. Nhóm hydroxyl đƣợc loại bỏ bằng phản ứng Barton-McCombie

dƣới tác dụng của xúc tác Bu3SnH/AIBN, thu đƣợc sản phẩm 55. Hợp chất HCl*H-

Tup-OH (48) đƣợc tạo thành qua các phản ứng thủy phân lần lƣợt với LiOH/H2O2

và HCl 4M.

Sơ đồ 1.11. Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Tamure

Ngoài ra, trong nghiên cứu tổng hợp 4-Nitro-Tup-OH của Parker và cộng sự,

chuỗi phản ứng đƣợc bắt đầu từ Boc-4-Nitro-phenylalanine qua 7 phản ứng với hiệu

suất chung 19% [51].

1.5. TƢƠNG QUAN GIỮA CẤU TRÖC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

Các nghiên cứu về tubulysin cho tới nay đều tập trung vào 4 khía cạnh chính

đó là: vai trò hóa lập thể cũng nhƣ các nhóm chức trong Mep, Tuv và Tup; hoặc

chức năng của nhóm N,O-acetal. Một số dẫn xuất tubulysin chứa các nhóm chức

khác nhau ở vị trí Tuv, Tup, Mep và N,O-acetal đã đƣợc tổng hợp và nghiên cứu, từ

đó thiết lập nên các đặc tính cần thiết cho mỗi vị trí này.

Vai trò quan trọng của nhóm acetyl (Ac) trong amino acid Tuv và nhóm

N,O-acetal đƣợc nghiên cứu bởi Pattersson và các cộng sự. (Hình 1.11, Bảng 1.4)

[62]. Hoạt tính sinh học của 56 và 57 cho kết quả khá bất ngờ (Bảng 1.4). Hoạt tính

gây độc tế bào ung thƣ biểu mô đại tràng (SW-480) của 56 giảm không đáng kể so

với 1D. Kết quả này cho thấy việc loại bỏ nhóm O-acetyl vẫn duy trì tốt hoạt tính

sinh học của tubulysin. Hợp chất 57 cho thấy hoạt tính trên 2 dòng tế bào ung thƣ

L929 và KB-3.1 chỉ kém 1D khoảng 4 lần trong khi hoạt tính đối với dòng tế bào

SW-480 mạnh hơn 1D. Điều này rõ ràng xác nhận nhóm N,O-acetal không quan

trọng đối với các tubulysin.

Hợp chất

IC50 (ngmL-1) L929

SW-480 KB-3.1 1A9

0.056 0.25 0.23 n.d 3.87

0.022 0.057 0.016 n.d 0.21

0.070 0.22 0.13 n.d 2.32

n.d n.d n.d 0.2 n.d

Bảng 1.4. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 56-59

1D 56 57 58 59

Hình 1.11. Các dẫn xuất tub 56- 59

* n.d: Không xác định

Các dẫn xuất 58 và 59 duy trì đáng kể hoạt tính chứng tỏ rằng nhóm OAc có

thể thay thế đƣợc với các nhóm chức khác nhƣ (OH, CO, Me, H) [48,52,63]. Trong

một nghiên cứu khác, một vài dẫn xuất đƣợc gọi là tubugi, ở đó nhóm N,O-acetal

đƣợc thay thế bằng nhóm N-alkylamide, đã cung cấp thêm dẫn chứng về vai trò của

nhóm N,O-acetal (Hình 1.12, Bảng 1.5) [64]. Kết quả này xác nhận phạm vi thay

đổi lớn có thể tiến hành ở vị trí của Tuv.

Các kết quả nghiên cứu vai trò của dị vòng thiazole của Tuv cho thấy sự

không quan trọng của vòng thiazole trong một số trƣờng hợp nhất định. Nhóm

nghiên cứu của Nicolaou đã xác nhận vai trò của dị vòng thiazole trong Tuv có thể

thay thế đƣợc mà không ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt tính. Sự thay thế vòng thiazole

bằng vòng pyridine vẫn giữ hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhƣ desacetoxy

tubulysin H [54]. Nhóm của Yang và cộng sự đã thay thế vòng thiazole trong

tubulysin V bằng vòng triazole vẫn giữ hoạt tính gây độc tế bào thậm chí mạnh hơn

tub V đối với dòng tế bào ung thƣ vú (MCF-7) [65]. Do đó, những thay đổi về cấu

trúc hóa học của nhóm Tuv rất hữu ích cho việc đơn giản hóa quy trình tổng hợp

các dẫn xuất mới của tubulysin.

GI50 (nM)

Hợp chất

PC-3

HT-29

0.23

0.14

Bảng 1.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các tubugi

60

0.29 0.22 0.21

0.34 0.56 0.32

61 62 1A

7.2

5.3

Taxol

Hình 1.12. Các dẫn xuất tubugi

Để khảo sát ảnh hƣởng kích thƣớc vòng, cấu hình của trung tâm bất đối và

bậc amin cần thiết ở đầu N của peptid, một số dẫn xuất của tubulysin đƣợc tổng hợp

và đánh giá hoạt tính trên dòng tế bào ung thƣ buồng trứng (1A9) (Bảng 1.6) [52].

Hợp chất 63a và 63c (Hình 1.13) đã thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ cao

nhất. Tuy vậy, cả hai đều kém hoạt tính hơn nhiều so với dẫn xuất hemiasterlin

(HTI-286) đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng.

Compound

1A9;IC50 (µM)

Bảng 1.6. Độc tính tế bào của các dẫn xuất tub 63, 64

Me.HCl Me.HCl Me.HCl Me.HCl H.HCl H.HCl H.HCl H.HCl

1 1 2 2 1 1 2 2

Cấu hình* R S R S R S R S

0.8 18 0.2 25 >33 >33 23 24 0.03

Hình 1.13. Các dẫn xuất tub 63, 64

63a 63b 63c 63d 64a 64b 64c 64d HTI-286

Phù hợp với 63(a,c), sự thay thế của nhóm Mep với N,N-dimethyl-glycin tạo

peptide với N-terminal là amin bậc 3 (65a) ( Hình 1.14) giảm không đáng kể hoạt

tính ức chế so với tub D (Bảng 1.7) [55,62]. Ngƣợc lại, khi ở N-terminal chứa các

amin bậc 2 nhƣ 64a-d hoạt tính gây độc tế bào giảm rõ rệt khi so sánh với tub D.

Ngoài ra, so sánh 63(a,c) và 63(b,d) cho thấy yêu cầu về hóa lập thể ở N-terminal

của peptide phải có cấu hình R (D-amino acid). Vai trò lập thể và cấu hình của

amino acid ở N-terminal cũng đƣợc Toader và cộng sự khảo sát [66], theo đó việc

thêm dị vòng hoặc thay đổi cấu hình R của amino acid ở N-terminal đều làm giảm

đáng kể hoạt tính gây độc tế bào. Từ các nghiên cứu trên có thể kết luận nhóm chức

amin bậc 3 (hoặc sản phẩm N-alkyl hóa) và cấu hình R của amino acid ở N-terminal

của peptide là yêu cầu bắt buộc cần phải có để duy trì hoạt tính sinh học cho các

tubulysin.

IC50 (ngmL-1)

Hợp chất

L129

SW-480

KB-31

0.056 0.04 120 45

0.022 0.010 15 8.8

0.070 0.029 80 40

Bảng 1.7. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tub 65

1D 65a 65b 65c

Hình 1.14. Các dẫn xuất 65

Các tubulysin thiên nhiên với nhóm Tup ở đầu C (tub D-F và H) thể hiện

hoạt tính mạnh hơn các tubulysin có nhóm Tut (tub A-C, G và I). Điều này có thể

do sự tăng cƣờng của nhóm ƣa nƣớc (OH) và tính thẩm thấu của màng tế bào [10].

Vai trò của amino acid Tup đƣợc khảo sát bởi nhóm nghiên cứu của Sasse và

Yang [9,65]. Kết quả nghiên cứu cho thấy không phải tất cả sự thay thế của nhóm

Tup đều duy trì đƣợc hoạt tính sinh học tốt (Hình 1.15; Bảng 1.8). Tripeptide (66d,

Mep-Ile-Tuv) giảm đáng kể hoạt tính, trong khi dẫn xuất thiếu nhóm phenyl hoặc

methyl (66b) vẫn duy trì hoạt tính ở mức độ tƣơng tự nhƣ các tripeptide (66d)

[62,67].

Hợp chất

IC50 (nM) SW-480

KB 3.1

(cid:13)L929

0.056 0.24 3.5 0.30 2.2

0.022 0.30 0.91 0.35 0.35

0.070 0.25 1.8 0.22 1.5

Bảng 1.8. Các dẫn xuất thế đầu C của tub 66

1D 66a 66b 66c 66d

Hình 1.15. Các dẫn xuất tub 66

Hợp chất L-phenylalanin (66a) của pretubulysin D có hoạt tính yếu hơn so

với trƣờng hợp N-methyl amide của dẫn xuất Tup 66c [44].

Vai trò về hóa lập thể của Tup không quan trọng nhƣ trong trƣờng hợp của

Tuv (Bảng 1.9, Hình 1.16). Sự đảo cấu hình của nhóm methyl ở C2 tạo thành sản

phẩm (67a) không có hoạt tính gây độc tế bào [57,68,69]. Ngƣợc lại, sự loại bỏ

trung tâm lập thể ở C2 tạo sản phẩm C2-desmethyl (67b) vẫn duy trì đƣợc hoạt tính

tƣơng tự nhƣ 1V. Trong khi hợp chất C2-dimethyl (67c) chỉ giảm không đáng kể

hoạt tính so với hợp chất C2-methyl có cấu hình S [44,48,52,70].

IC50 (µM)

Hợp chất

1A9 MCF-7

Tubulin inhi.

0.00065 0.12 >50 0.30 14.2

0.0004 0.24 ND 0.17 12.2

1.9 1.1 3.6 12.5 8.5

Bảng 1.9. Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 67

1U 1V 67a 67b 67c

Hình 1.16. Các dẫn xuất 67

Các kết quả nghiên cứu trên đây có thể đƣợc tóm tắt trong mô hình đƣợc thể

hiện trên hình 1.17:

Hình 1.17. Tƣơng quan Hoạt tính - Cấu trúc của tubulysin

Nhóm Tuv thể hiện vai trò quan trọng nhất về khả năng duy trì hoạt tính

kháng ung thƣ của tubulysin. Có thể thấy phạm vi thay đổi hóa học rộng mà ít gây

ảnh hƣởng đến hoạt tính của tubulysin, nhƣ thông qua sự biến đổi chức năng của

nhóm N,O-acetal, nhóm acetoxy (OAc) và vòng thiazole. Tƣơng tự, các thay đổi

của Tup có thể tiến hành trên phạm vi rộng. Những kết quả này đặt cơ sở để giả

thiết rằng các dẫn xuất tubulysin có thể đƣợc đơn giản hóa và dễ dàng chấp nhận

hơn các sản phẩm thiên nhiên do có các tính chất hóa lý tối ƣu hơn, từ đó có thể cải

tiến quy trình tổng hợp tubulysin.

1.6. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Tổng hợp một số dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin với sự thay thế nhóm

N,O-acetyl bằng nhóm methyl, thay đổi cấu trúc của Methylpipecolic acid (Mep) ở

đầu N-terminal bằng các acid dị vòng, và thay đổi cấu trúc của amino acid

tubuphenylalanine (Tup) ở đầu C-terminal.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các tetrapeptide tổng hợp đƣợc trên

một số dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ: A459, HT-29, MCF7, SW-480 và HL-60,

nhằm làm rõ thêm tƣơng quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các tubulysin, đồng

thời tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học đáng chú ý.

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ

Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại nhƣ phƣơng pháp bảo vệ nhóm

chức, phƣơng pháp loại bỏ nhóm bảo vệ, ngƣng tụ Horner-Wadsworth-Emmons,

phản ứng Arndt-Eistert, phản ứng tổng hợp Weinreb amide, phản ứng Dondoni,

phản ứng khử chọn lọc ketone, các phƣơng pháp ghép mạch peptide..., đƣợc thực

hiện tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ -Viện Hoá học -Viện Hàn lâm Khoa học & Công

nghệ Việt Nam.

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản

phẩm. Thông thƣờng chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc

và sự phát quang khác nhau. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các

chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có

thể tìm đƣợc dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác

xa nhau) từ đó tìm đƣợc hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất.

Bản mỏng đƣợc soi dƣới đèn UV (λ = 254 nm) và nhúng vào dung dịch KMnO4

hoặc thuốc thử acid hiện màu và sấy. Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi thích hợp,

các chất đƣợc phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký cột hoặc bằng sắc ký lớp mỏng

điều chế với chất hấp phụ là silica gel.

2.1.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ

Các hợp chất hữu cơ tổng hợp đƣợc đƣợc xác định cấu trúc thông qua phân tích phổ khối lƣợng phân giải cao (HRMS) và các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H, 13C-

NMR.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker Avance-500 MHz, chất nội chuẩn là TMS cho 1H-NMR và tín hiệu dung môi cho 13C-NMR, tại trung tâm phân tích cấu trúc Viện Hoá học - Viện Hàn

lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối lƣợng phân giải cao HRMS (ESI) đo trên máy Agilent Technologies

6530 Accurate -Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hoá sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa

học & Công nghệ Việt Nam

2.1.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

2.1.3.1. Phương pháp thử

Phƣơng pháp thử khả năng gây độc tế bào in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc

gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử gây độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát

hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều

kiện in vitro. Phép thử này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Skehan [71].

Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tubulysin thực hiện tại Viện Công

nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam theo phƣơng pháp

của Skekan trên 5 dòng tế bào ƣng thƣ do Trƣờng Đại học Long-Island, US và

trƣờng Đại học Milan, Italia cung cấp gồm: tế bào ung thƣ vú- MCF7 (Human

breast carcinoma), tế bào ung thƣ phổi ở ngƣời-A549 (human lung

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời- HT29 (human colorectal

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ bạch cầu cấp ở ngƣời- HL60 (human acute

leukemia), tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời- SW480 (human colon carcinoma)

2.1.3.2 Cách tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào

Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật

độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào

đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận với

lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein

càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử đƣợc thực hiện trong điều kiện cụ thể

nhƣ sau:

Chất thử đƣợc pha thành các dải nồng độ thích hợp, các tế bào thử nghiệm

đƣợc trypsin hóa để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm nhằm điều chỉnh mật

độ cho phù hợp với thí nghiệm.

Chất thử đã pha ở các nồng độ đƣợc đƣa vào các giếng của đĩa 96 giếng,

thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng

độ chất thử trong giếng là 100-20-4-0.8 M. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có

chất thử nhƣng có TBUT (180l) đƣợc sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ,

giếng đối chứng ngày 0 tế bào đƣợc cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.

Sau 48 giờ, tế bào đƣợc cố định bằng TCA trong 1 giờ, đƣợc nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng. 10 mM

unbuffered Tris base để hòa tan lƣợng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.

Đọc kết quả OD ở bƣớc sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader

(Biotek).

Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử đƣợc xác định

thông qua công thức sau:

Phép thử đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồngđộ

10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml đƣợc sử dụng nhƣ là chất đối chứng dƣơng.

DMSO 10% đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự

phát triển) đƣợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.

2.2. THỰC NGHIỆM

2.2.1. Hóa chất và dung môi

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp đƣợc mua từ hãng Aldrich-Sigma.

Các dung môi chạy cột (DCM, EtOAc, nHexane) đƣợc cất trƣớc khi sử dụng. Các

dung môi khan làm phản ứng (DMF, DCM, acetonitrile (ACN), EtOAc) đƣợc đun

hồi lƣu 4h với CaH2 và cất loại trƣớc khi sử dụng. Dung môi tetrahydrofuran (THF)

đƣợc đun hồi lƣu 5h với Na dƣới khí quyển N2 trƣớc khi cất và sử dụng.

Triethylamine (TEA) và N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) đƣợc đun hồi lƣu với

CaH2 trong 2h, trƣớc khi sử dụng. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) sử dụng bản mỏng

nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254. sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel Merck

(60 Å, 230-400 mesh), sắc ký lớp mỏng điều chế với chất hấp phụ là silica gel

Merck (60PF254).

2.2.2. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide

Quy trình tổng hợp tetrapeptide là các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin

đƣợc tóm tắt qua sơ đồ gồm 4 bƣớc phản ứng (Sơ đồ 2.1). Theo đó, các ɤ-amino

acid quan trọng của tubulysin là tubuvaline và tubuphenylalanine đƣợc tổng hợp,

tiếp theo với các phản ứng ghép mạch amide để tạo thành các dipeptide, trippeptide

và tetrapeptide. Dipeptide (Ile-Tuv) đƣợc tổng hợp từ phản ứng ghép mạch amide

giữa Tuv với Boc-isoleucine, dipeptide này đƣợc sử dụng nhƣ là khung cơ bản

trong việc phát triển mạch peptide để tạo ra các tetrapeptide mới. Với việc thay đổi

các amino acid ở đầu C- terminal tạo ra các tripeptide khác nhau. Từ các tripeptide

tổng hợp đƣợc, qua phản ứng ghép mạch amide với các acid dị vòng thu đƣợc các

tetrapeptide là các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin.

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide

2.2.3. Tổng hợp tubuphenylalanine

N-(tert-Butyloxycarbonyl)-L-phenylalanine methyl ester (45).

L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (100 mg, 0.46 mmol) trong

hỗn hợp dung môi THF/H2O đƣợc thêm dung dịch NaHCO3 (77 mg,

0.92 mmol) và Boc2O (120 mg, 0.55 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc

khuấy ở nhiệt độ phòng 18h rồi chiết với EtOAc (2x50 mL). Dịch chiết

đƣợc làm khan với Na2SO4 và dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm thu đƣợc

sản phẩm 45 (120,6 mg, 94%), là chất lỏng không màu; Rf = 0.47 (hexane/EtOAc = 4/1); 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.31-7.22 (m, 3H, H-phenyl), 7.12 (d, J

= 7.1 Hz, 2H, H-phenyl), 4.98 (br s, 1H, H-2), 3.71 (s, 3H, COOMe), 3.13-3.02 (m, 2H, H-3), 1.41 (s, 9H, H-Boc); 13C- NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) 172.3 (C-1), 155.0 (CO-Boc), 136.0 (C-4), 129.2 (C-5, 9), 128.5 (C-6, 8), 127.0 (C-7), 79.9 (C-

tertBoc), 54.4 (C-2), 52.1 (C- OCH3), 38.3 (C-3), 28.3 (C-Boc).

N-(tert-Butyloxycarbonyl)-L-phenylalaninol (45a).

Methyl ester 45 (250 mg, 0.89 mmol) trong dung môi MeOH (10 mL)

đƣợc thêm NaBH4 (135.3 mg, 3.56 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc

khuấy ở nhiệt độ phòng 20h. Kết thúc phản ứng dung môi đƣợc quay

cất đến khô, phần rắn đƣợc hòa tan trong nƣớc và trung hòa bằng HCl

(5%) đến môi trƣờng trung tính. Lọc lấy tủa, rửa lại bằng nƣớc và sấy ở 45oC thu đƣợc 45a (214,5mg, 96%), là chất rắn màu trắng. 1H-NMR (500 MHz,

CDCl3) δ ppm: 7.31-7.28 (m, 2H, Phenyl), 7.26-7.2 (m, 3H, Phenyl), 4.78 (brs, 1H,

H-2), 3.86 (brs, 1H), 3.65 (dd, J = 3.0 Hz, 11.0 Hz, 1H, H-1), 3.54 (dd, J = 3,0 Hz;

11,0 Hz; 1H, H-1), 2.83 (d, J = 7.0 Hz, 2H, H-3), 1.41 (s, 9H, H-Boc).

(S)-tert-Butyl(1-oxo-3-phenylpropan-2-yl)carbamate (52)

Ancol 45a (200 mg, 0.8 mmol) trong EtOAc và IBX (672 mg, 2.4

mmol) đƣợc đun hồi lƣu 5h. Kết thúc phản ứng, sản phẩm rắn đƣợc lọc

bỏ, dịch lọc đƣợc quay cất đến khô thu đƣợc sản phẩm 52 (187.3 mg, 97%) là chất lỏng màu vàng nhạt. 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.64 (s, 1H, CHO), 7.37-7.28 (m, 3H, phenyl), 7.20-7.17 (m, 2H,

phenyl), 5.04 (s, 1H, H-2), 4.44 (d, J = 6.4 Hz, 1 H), 3.13 (d, J = 6.4 Hz, 2H, H-3),

1.41 (s, 9H, H-Boc).

(S,E)-Ethyl-4-((tert-butoxycarbonyl)amino)-2-methyl-5-phenylpent-2-enoate (42)

Aldehyde 52 (250 mg, 1.0 mmol) trong DCM (10 mL) ở 0oC

đƣợc thêm vào NaH (36 mg, 1,5 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở 0oC trong 1h và dung dịch triethyl-2-

phosphonopropionate (375 mg, 1.5 mmol) trong DCM (4

mL) đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc nâng dần đến nhiệt độ

phòng và khuấy 12h. Kết thúc phản ứng, quay cất dung môi và tinh chế trên cột

silica gel (EtOAc/nHexane; 4/6) thu đƣợc sản phẩm 42 (249,8 mg, 75%) là chất lỏng không màu. 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.32-7.31 (m, 2 H), 7.24 (t, J

= 7.2 Hz, 1 H), 7.20-7.18 (m, 2 H), 6.54 (dq, J = 9.1, 1.2 Hz, 1H, H-3), 4.68-4.61

(m, 2H, H-4), 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 2H, H-1‟), 2.94 (dd, J = 13.3, 5.6 Hz, 1H, H-5),

2.80 (dd, J = 13.4, 7.1 Hz, 1H, H-5), 1.72 (d, J = 0.7 Hz, 3H, CH3-), 1.43 (s, 9H, H- Boc), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H, H-2‟). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 167.7(C-

1); 154.9 (CO-Boc); 140.2 (C-6); 136.7 (C-3); 129.5 (C-7); 129.3 (C-11); 128.7 (C-

8); 128.5 (C-10); 128.4 (C-2); 126.9 (C-9); 77,3 (C-tertBoc), 60.7 (C-1‟); 41.2 (C-

4); 28.4 (C-Boc, C-5); 14.2 (C-2‟); 12.6 (CH3) .

(S,E)-4-((tert-Butoxycarbonyl)amino)-2-methyl-5-phenylpent-2-enoic acid (69)

Ester 42 (150 mg, 0.45 mmol) trong THF/H2O (2/1; 5 mL) đƣợc

thêm vào LiOH (43.2 mg, 1.8 mmol). Hỗn hợp phản ứng khuấy ở

nhiệt độ phòng 12 h, sau đó cất loại dung môi đến khô. Chất rắn

thu đƣợc đƣợc axit hóa với HCl (5%), lọc kết tủa, rửa với H2O và

màu trắng. [α]D sấy khô thu đƣợc sản phẩm acid 69 (109,8 mg, 80 %), là chất rắn 20 +44.9). 1H- NMR (500 MHz, 20 +44.0 (c 1, CHCl3, lit.75 [α]D

CDCl3) δ ppm: 10.25 (s, 1H), 7.35-7.19 (m, 5H, H-phenyl), 6.64 (d, J = 8.7 Hz, 1H,

H-3), 4.67 (s, 1 H, H-4); 2.97 (dd, J = 13.1, 5.4 Hz, 1H, H-5), 2.81 (dd, J = 13.3,

7.1 Hz, 1 H, H-5), 1.71 (s, 3 H, CH3), 1.44 (s, 9H, H-Boc).

(S,E)-(1’R,2’S,5’R)-2’-Isopropyl-5’-methylcyclohexyl-4-

Hỗn hợp phản ứng gồm dicyclohexylcarbodiimide DCC

((tertButoxycarbonyl)amino)-2-methyl-5-phenyl-pent-2-enoate (46).

(253.4 mg, 1.23 mmol), acid 69 (250 mg, 0.82 mmol),

menthol (152.8 mg, 0.98 mmol) và DMAP (2 mg, 0.01

mmol) trong DCM (6 mL) đƣợc khuấy 16 h ở nhiệt độ

phòng. Lọc bỏ kết tủa trắng tạo thành. Dung môi đƣợc

quay cất dƣới áp suất thấp. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế qua sắc ký cột silica gel

(EtOAc/nHexane; 20/80) thu đƣợc sản phẩm ester 46 (301.5mg, 83%), là chất lỏng không màu. 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.33-7.25 (m, 3H, H-phenyl), 7.19-7.16 (m, 2H, H-phenyl), 6.49 (dd, J = 9.1, 0.9 Hz, 1H, H-3), 4.77- 4.51 (m,

2H, H-1‟, H-4), 3.01-2.90 (m, 1 H, H-5), 2.89-2.77 (m, 1H, H-5), 2.07-2.01 (m, 1H,

H-2‟), 1.93-1.83 (m, 1H, H-5‟), 1.74-1.69 (m, 5H, CH3, H-6‟); 1.44-1.40 (m, 9H, H-

Boc); 1.34-1.29 (m, 1H, H-7‟), 1.12-1.00 (m, 2H), 0.95-0.89 (m, 8H), 0.79 (d, J =

6.9 Hz, 3H, H-9‟).

(2S,4R)-(1’R,2’S,5’R)-2’-Isopropyl-5’-methylcyclohexyl 4-((tert-

butoxycarbonyl)-amino)-2-methyl-5-phenylpentanoate (47a)

Alkene 46 (200 mg, 0.45 mmol) và Pd/C (20 mg, 10% wt)

trong hỗn hợp dung môi EtOAc/MeOH (2/1; 12 mL) đƣợc

khuấy dƣới áp suất khí quyển H2 trong 48h. Hỗn hợp phản

ứng đƣợc lọc loại bỏ Pd/C. Cất loại dung môi dƣới áp suất

giảm, sản phẩm thô đƣợc đƣa lên cột silica gel (với hệ rửa

giải hexane/EtOAc 15:1) thu đƣợc sản phẩm chính 47a ( 150 mg, 75%), là chất rắn màu trắng, và sản phẩm phụ 47b (30 mg, 15%). Chất 47a: 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.29-7.27 (m, 2 H), 7.21 (t, 1 H), 7.19-7.15 (t, 2 H), 4.69 (td, J= 11, 4.5 Hz, 1H, H-1‟), 4.34 (brs, 1 H, H-4), 3.87 (brs, 1 H), 2,78-

2.74 (m, 2H, H-5), 2,55 (brs, 1 H, H-2), 2,00-1.97 (d, J = 12 Hz, 1 H, H-2‟), 1.86-

1.84 (m, 2H, H-3), 1.69-1.64 (m, 2 H, H-6‟), 1.50-1.35 (m, 14H, H-Boc, H5‟,3‟,4‟),

1.16 (d, J = 7 Hz, 3 H, CH3-C2), 1.08-1.01 (m, 2 H), 0.96-0.84 (m, 9 H, H-8‟, 9‟), 0.75 (d, J = 6.5 Hz, 3 H, H-10‟). Chất 47b 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.29-7.27 (m, 2 H), 7.22-7.20 (t, 1 H), 7.19-7.15 (t, 2 H), 4.66 (m, 1H), 4.32 (brs, 1

H), 3.85-3.83 (m, 1 H), 2.78-2.74 (m, 2H), 2,62-2.53 (m, 1 H), 2,08-2.03 (d, J = 12

Hz, 1 H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.71-1.67 (m, 2 H), 1.52-1.49 (m, 2H), 1.39 (br s,

12H), 1.15-1.14 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1.08-1.01 (m, 2 H), 0.96-0.84 (m, 9 H, H-12, H-

8‟, 9‟), 0.76 (d, J = 6.5 Hz, 3 H, H-10‟).

2.2.4. Tổng hợp tubuvaline

2.2.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14)

Ethyl 2-aminothiazole-4- carboxylate (70)

Thioure (330 mg, 3.4 mmol) trong ethanol đƣợc thêm vào ethyl

bromopyruvate (0.5 mL, 3.4 mmol). Hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu trong 4h, sau đó để nguội đến nhiệt độ thƣờng và làm lạnh ở 0 oC

trong 14h. Kết tủa tạo thành đƣợc lọc, thu đƣợc chất 70 là tinh thể màu trắng (438.6 mg, 75%). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.12 (s, 1H), 4.45 (q, J = 7 Hz, 2H), 1.40 (t, J = 7 Hz, 3H).

Ethyl 2-bromothiazole-4-carboxylate (71)

Hỗn hợp phản ứng gồm chất 70 (679 mg, 3.95 mmol), KBr (1.6g,

13.8 mmol), CuSO4.5H2O (1.19g, 4.74 mmol) đƣợc thêm vào 56ml H2SO4 30%, và làm lạnh đến 0 oC. NaNO2 (400 mg, 5.92 mmol) đƣợc thêm chậm vào tiếp tục khuấy ở 0 oC 30 phút sau đó ở nhiệt độ

phòng thêm 12h. Hỗn hợp phản ứng đƣợc chiết bằng EtOAc, dịch chiết đƣợc làm

khan bằng Na2SO4, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm thu đƣợc chất rắn màu trắng 71 (665 mg, 70%). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.14 (s, 1H), 4.44 (q, J = 7 Hz, 2H), 1.42 (t, J = 7 Hz, 3H).

Chất 71 (500mg, 2.12 mmol) trong 30 ml hỗn hợp dung môi

(2-bromothiazol-4-yl)methanol (72)

EtOH/THF (2/1), đƣợc thêm vào CaCl2 (941.3 mg, 8.48 mmol) và

NaBH4 (322.2 mg, 8.48 mmol). Hỗn hợp đƣợc khuấy ở nhiệt độ

phòng 15h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại hết. Chất rắn

đƣợc hòa tan với nƣớc và dung dịch NH4Cl, chiết với EtOAc. Dịch chiết đƣợc làm

khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 72 là chất lỏng không màu (386.7 mg, 95%). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 7.41 (s, 1H), 4.66 (s, 2H).

Hợp chất 72 (400 mg, 2.06 mmol) trong 15ml DCM đƣợc thêm

2-Bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14)

imidazole (210 mg, 3.09 mmol) và tert-butyldimethylsilan chloride

(342.2 mg, 2.27 mmol). Hỗn hợp đƣợc khuấy 10h ở nhiệt độ phòng.

Kết thúc phản ứng dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm, chất

rắn còn lại đƣợc thêm nƣớc và chiết bằng EtOAc. Dịch chiết đƣợc

làm khan bằng Na2SO4, quay cất đến khô dƣới áp suất giảm thu đƣợc chất 14 dạng lỏng không màu (613.4 mg; 97%). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.02(s, 1H), 4.70 (s, 2H), 0.82 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).

2.2.3.2. Tổng hợp ɤ-amino acid Tuv-OMe (79)

(S)-tert-butyl -(1-diazo-4-methyl-2-oxopentan-3-yl)carbamate (21)

N-Boc-Val-OH (550 mg, 2.6 mmol) trong THF đƣợc thêm TEA (0.8 mL, 5.7 mmol) và khuấy ở 0 oC 15 phút, ethyl chloroformate (0.3

mL, 3.3 mmol) đƣợc thêm vào và hỗn hợp phản ứng đƣợc tiếp tục khuấy ở 0 oC

trong 40 phút. Hỗn hợp đƣợc lọc qua phễu lọc để loại bỏ hết chất rắn. Dịch lọc đƣợc

quay cất đến khô thu đƣợc chất lỏng màu vàng nhạt.

Điều chế dung dịch diazomethane: Hợp chất diazal (2.5 g) trong diethyl ether (25 mL) đƣợc thêm nhỏ giọt chậm vào dung dịch KOH 40 % ở nhiệt độ 65 oC.

Dung môi ether đƣợc hứng trực tiếp vào bình có chứa hợp chất anhydride trung gian đƣợc điều chế từ trên và hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 0 oC 3h và ở nhiệt độ

phòng 12h. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc thêm vào NaHCO3, chiết lấy dịch

THF/Et2O, làm khan bằng Na2SO4 và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 21 chất lỏng màu vàng nhạt, (407.2 mg, 65%). 1H-NMR (500 MHz,

CDCl3) δ ppm 4.33-4.22 (m, 1 H, H-3), 2.31-2.26 (m, 1H, H-4), 1.46 (s, 9H, H-

Boc), 0.97 (d, J = 7 Hz, 3 H, H-5), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-6). Chất 21 sau khi xử

lý tiếp tục đƣợc sử dụng cho phản ứng tổng hợp amit 22a.

tert-Butyl-(R)-(1-(methoxy(methyl)amino)-4-methyl-1-oxopentan-3-

yl)carbamate (22a)

Chất N,O-dimethylhydroxylamine hydrochloride (400 mg, 3.9

mmol) trong 7 mL THF đƣợc thêm vào TEA (1.8 mL, 19.6

mmol), hỗn hợp đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 24h. Chất rắn tạo

thành đƣợc lọc bỏ, rữa bằng THF, thu đƣợc sản phẩm N,O-

dimethylhydroxylamine trong THF/TEA. Dịch THF/TEA ở trên đƣợc thêm vào

chất diazo 21 (460 mg, 1.9 mmol) và C6H5COOAg (87 mg, 0.38 mmol). Hỗn hợp

phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm và lọc loại bỏ kết tủa. Dung môi

đƣợc cất dƣới áp suất giảm. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica gel

(nHexan/EtOAc, 90/10) thu đƣợc sản phẩm 22a là chất lỏng không màu (364.4.mg, 70%). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm:5.23 (d, J = 7 Hz, 1H); 3.77-3.71 (m, 4H, H-3, H-8), 3.69 (s, 3H, H-7), 2.58-2.57 (dd, J = 13 Hz, 2H, H-2), 1.94-1.99 (m,

1H, H-4), 1.42 (s, 9H, H-Boc), 0.92 (d, J = 7 Hz, 3H, H-5); 0.91 (d, J = 7 Hz, 3H,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 173.3 (C-1), 155.7 (CO-Boc), 79.8 (C- tertBoc), 64.3 (C-8), 56.4 (C-7), 48.7 (C-3), 30.4 (C-2), 28.4 (C- Boc), 20.1 (C-4),

H-6).

19.7 (C-5), 19.6 (C-6).

(R)-tert-Butyl -(1-(methoxy(methyl)amino)-4-methyl-1-oxopentan-3-

yl)(methyl)carbamate (73).

Chất 22a (100 mg; 0.37 mmol) trong 3 mL THF đƣợc làm lạnh đến 0 oC và NaH (45 mg, 1.85 mmol) đƣợc thêm từ từ vào, hỗn hợp đƣợc khuấy ở 0 oC 1h, dung dịch MeI (0.12 mL, 1.85 mmol) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở 0 oC thêm 1h, và ở nhiệt độ

phòng 16h. Kết thúc phản ứng, dung dịch NH4Cl đƣợc thêm vào và chiết với

EtOAc, dịch chiết làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm và

tinh chế trên cột silica gel (Hexan/EtOAc - 5/1) thu đƣợc sản phẩm 73 là chất lỏng màu vàng nhạt ( 94,9 mg, 90%). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 3.69 (s, 3H,

H-9), 3.16 ( s, 3H, H-8), 2.76 (s, 3H, H-7), 2.65-2.58 (m, 1H, H-3), 2,04 (s, 1H, H-

2); 1.91-1.76 (m, 2H, H-4, H-2), 1.42 (s, 9H, H-Boc), 0.95 (d, J = 7 Hz, 3H, H-5),

0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-6).

tert-butyl-(R)-(1-(4’-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)thiazol-2’-yl)-4-

methyl-1-oxopentan-3-yl)(methyl)carbamate (74)

Chất 14 (215 mg, 0.7 mmol) trong bình cầu 2 cổ

đƣợc nạp khí N2, thêm vào 10 mL THF, và làm lạnh đến -78 oC, dung dịch BuLi (89.6 mg, 1.4 mmol) đƣợc thêm vào, hỗn hợp đƣợc khuấy 1h ở -78 oC.

Chất 79 (200 mg, 0.7 mmol) trong THF đƣợc thêm vào. Phản ứng tiếp tục đƣợc khuấy ở -78 oC thêm 1h và ở nhiệt độ phòng 12h. Kết thúc phản ứng, dung dịch

NH4Cl đƣợc thêm vào và chiết bằng EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng

Na2SO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm và tinh chế trên cột silica gel

(Hexan/EtOAc= 10/1) thu đƣợc sản phẩm 74 là chất lỏng màu nâu nhạt (175.6 mg, 55%). 1H- NMR: (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 7.54 (s, 1H, H-3‟), 4.89 (s, 2H, H-4‟),

4.26 (m, 1H, H-3), 2.72 (s, 3H, H-7), 2.59-2.57 (m, 1H, H-4), 1.89-1.86 (m, 1H, H-

2), 1.76 (m, 1H, H-2); 1.31 (s, 9H, H-Boc), 1.02 (d, J = 7 Hz, 3H, H-6), 0.96 (s, 9H, H-tBu), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-5), 0.1 (s, 6H). 13C-NMR: (125 MHz, CDCl3) δ ppm 192.0 (C-1), 166.5 (C-1‟), 159.5 (C-2‟), 155.8 (CO-Boc), 121.3 (C-3‟), 79.3

(C-tertBoc), 62.0 (C-4‟), 59.8 (C-3), 59.2 (C-7), 44.6 (C-2), 39.9 (C-4), 31.9 (C-

Boc), 31.2 (C-tertBu), 29.6 (C-Bu), 28.4, 25.8, 14.0 (C-5), 13.8 (C-6), -6.8.

tert-butyl((1R,3R)-1-(4’-(((tert-butyldimethylsilyl)oxy)methyl)thiazol-2’-yl)-

1-hydroxy-4-methylpentan-3-yl)(methyl)carbamate (15a)

Chất 74 (250 mg, 0,55 mmol) trong 20 mL THF đƣợc làm lạnh đến 0 oC, thêm vào lần lƣợt 10% mol xúc tác

CBS (15.2 mmg; 0.055 mmol) và BH3.Me2S (41.3

mg, 0.55 mmol). Hỗn hợp đƣợc khuấy ở nhiệt độ

phòng 12h. Kết thúc phản ứng, dung dịch NH4Cl đƣợc thêm vào và chiết với

EtOAc. Dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi và tinh chế sản

phẩm thô trên cột sắc ký silica gel (Hexan/EtOAc; 5/1) thu đƣợc 15a (192.7 mg,

85% ee) là chất lỏng không màu,và 15b (18,1 mg; 15% ee). Sản phẩm 15a: Rf = 25 -15.2 (c 1.5, CH2Cl2), 1H- NMR: (CDCl3, 500 0,52 (Hexan/EtOAc; 5/1), [α]D

MHz) δ ppm: 7.11 (s, 1H, H-3‟), 4.93 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H, H-4‟), 4.69

(dt, 1H, J = 11, 2.5 Hz, H-1), 3.99 (m, 1H, H-3), 2.73 (s, 3H, H-7), 2.06 (m, 2H, H-

2), 1.76 (m, 1H, H-4), 1.47 (s, 9H, H-Boc), 0.96 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-5), 0.93 (s, 9H, t-Bu), 0.91 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-6), 0.1 (s, 6H). 13C- NMR: (CDCl3, 125 MHz)

δ ppm: 174.9 (C-1‟), 158.4 (C-2‟), 156.7 (CO-Boc), 113.2 (C-3‟), 80.5 (C-tertBoc),

69.1 (C-1), 62.3 (C-4‟), 57.8 (C-3), 37.9 (C-7), 29.7 (C-2), 29.6 (C-4), 28.5 (C- Boc), 28.42 (C-tertBu), 25.9, 20.1 (C-6), 18.3 (C-5), -5.3. 15b: 1H- NMR: (500

MHz, CDCl3) δ ppm: 7.05 (s, 1H), 5.01 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.70 (d, J

= 9 Hz, 1H), 3.83 (dt, J = 2.5 Hz, 11.5 Hz, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.35-2.32 (m, 1H),

2.22 (td, J = 11.5, 2.5 Hz, 1H), 1.76-1.71 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.4 (s, 9H, Boc),

0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-5), 0.94 (s, 9H, tBu), 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-6), 0.11

(s, 6H).

(1R,3R)-3-((tert-Butoxycarbonyl)(methyl)amino)-1-(4’-(((tert-

butyldimethylsilyl) oxy) methyl thiazol-2’-yl)-4-methylpentyl acetate (75)

Chất 15a (200 mg, 0.44 mmol) trong 10 mL DCM

đƣợc thêm TEA (1 mL), Ac2O (0.06 mL; 0.66 mmol)

và DMAP (10.7 mg, 0.088 mmol). Hỗn hợp phản ứng

đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 14h. Kết thúc phản ứng,

hỗn hợp đƣợc thêm nƣớc và chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan với Na2SO4,

dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm, thu đƣợc sản phẩm 75 là chất lỏng màu nâu nhạt (208.2 mg, 95%). 1H- NMR: (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 7.24 (s, 1H, H-

3‟), 5.99 (dd, J = 11.5, 3.0 Hz, 1H, H-1), 4.73 (s, 2H, H-4‟), 4.09 (m, 1H, H-3), 2.69

(s, 3H, H-7), 2.32 (td, J = 15.1, 11.5, 3.7 Hz, 1H, H-3), 2.18 (s, 3H, H-OAc), 2.14

(t, J = 3.0 Hz, 1H), 1.77-1.76 (m, 1H), 1.44 (d, J = 3.2 Hz, 9H, Boc), 0.98 (dd, J =

6.6, 1.8 Hz, 3H, H-5), 0.93 (s, 9H, tBu), 0.87 (m, 3H, H-6), 0.05 (s, 6H).

(1R,3R)-3-((tert-Butoxycarbonyl)(methyl)amino)-1-(4’-(hydroxymethyl)

thiazol-2’-yl)-4-methylpentyl acetate (76)

Chất 75 (100 mg, 0.2 mmol) trong DCM đƣợc thêm vào

tetrabutylammonium fluoride (57.4 mg, 0.22 mmol) và

khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3h. Kết thúc phản ứng, cất

loại dung môi, sản phẩm rắn đƣợc hòa tan trong nƣớc và

chiết với EtOAc. Dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, và cất loại hết dung môi

dƣới áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 76 là chất lỏng không màu (72.6 mg, 94%). 1H- NMR: (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.13 (s, 1H, H-3‟), 5.92 (dd, J = 11.5 Hz,

3.0 Hz, 0.3H, H-1), 5.82 (dd, J = 11.5, 3.0 Hz, 0.7H, H-1), 4.73 (s, 2H, H-4‟), 4.07

(td, J = 8.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-3), 2.69 (s, 3H, H-7), 2.32 (dt, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz,

1H, H-4), 2.14 (s, 3H, H- OAc), 2.04 (dt, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-2), 1.77–1.76

(m, 1H, H-2), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 0.98 (d, J = 6.5 Hz,, 3H, H-5), 0.87 (dd, J = 6.5,

3H, H-6).

(1R,3R)-3-((tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino)-1-(4’-formylthiazol-2'-yl)-4-

methylpentyl acetate (77)

Hỗn hợp phản ứng gồm ancol 76 (150 mg, 0.39 mmol), IBX

(327.6 mg, 1.17 mmol) trong EtOAc đƣợc khuấy ở nhiệt độ

hồi lƣu trong 5h. Sau phản ứng chất rắn đƣợc lọc bỏ, dịch lọc

đƣợc rửa 2 lần với Na2S2O3 và làm khan bằng Na2SO4. Dung

môi đƣợc quay cất dƣới áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 77 (142.2 mg, 95%) dạng lỏng màu vàng nhạt. Rf= 0,7 (Hexan/EtOAc = 7/1), 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ

(ppm): 9.72 (H-4‟, d, 1H, H-4‟), 8.24 (H-3‟, d, J = 6.2 Hz, 1H, H-3‟), 5.88 (H-1, dd,

J = 11.5, 3.0 Hz, 1H, H-1), 4.08 (td, J = 11.4, 3.7 Hz, 1H, H-3), 2.69 (s, 3H, H-7),

2.32 (ddd, J = 15.1, 11.5, 3.7 Hz, 1H, H-2), 2.19 (s, 3H, H- OAc), 2.14 (t, J = 3.0

Hz, 1H, H-2), 1.77-1.63 (m, 1H), 1.43 (d, J = 3.2 Hz, 9H, Boc), 0.97 (dd, J = 6.6,

1.8 Hz, 3H, H-6), 0.88-0.83 (m, 3H, H-5).

2-((5R,7R)-5-acetoxy-7-((tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino)-8-

methylpentyl)thiazole-1-carboxylic acid (78)

Chất 77 (200 mg, 0.52 mmol) trong DMF đƣợc thêm vào

oxone (319.2 mg, 0.52 mmol.). Hỗn hợp đƣợc khuấy ở

nhiệt độ phòng 12h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc và

chiết với EtOAc. Dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4

và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc sản phẩm 78 (193.4 mg, 93%)

1H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.1 (s, 1H, H-3), 5.98 (dd, J = 11.5

dạng rắn màu trắng.

Hz, 3.0 Hz, 0.3H, H-5), 5.92 (dd, J = 11.5, 3.0 Hz, 0.7H, H-5), 4.01 (td, J = 3 Hz,

11.5 Hz, 1H, H-7), 2.74 (s, 3H, H-11), 2.32 (dd, J = 11.5, 3.7 Hz, 1H), 2.14 (s, 3H,

OAc), 2.14 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 1.77-1.63 (m, 1H), 1.43 (s, 9H, H-Boc), 0.97 (d, J =

13C- NMR (CD3OD, 125 MHz), δ ppm: 172.1 (C-1), 171.7 (C-4), 168.9 (CO- Ac), 158.1 (C-2), 154.4 (CO-Boc), 125.7 (C-3), 81.4 (C-5), 80.9 (C-tertBoc), 71.4

6.6, 3H, H-5), 0.88 (d, J = 6.6, 3H, H-6);

(C-7), 58.1 (C-6), 35.9 (C-Boc), 31.4 (C-8), 21.2 (CH3-Ac), 20.4 (C-9), 20.2 (C-10)

Methyl-2-((5R,7R)-5-acetoxy-7-((tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino)-8-

methylpentyl)thiazole-1-carboxylate (79).

Chất 78 (150 mg, 0.38 mmol) trong 10 mL Et2O ở 0 oC,

đƣợc thêm vào dung dịch diazomethan trong ether (nhƣ

đƣợc miêu tả trong quy trình tổng hợp chất 21). Hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 0 oC 3h và đƣa về nhiệt độ phòng

12h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại đến khô thu đƣợc sản phẩm lỏng 79

1H- NMR: (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.82 (s, 1H, H-3), 5.94 (dd, J = 11.5

màu vàng (156 mg; 96%).

Hz, 3.0 Hz, 0.3H, H-5), 5.82 (dd, J = 11.5, 3.0 Hz, 0.7H, H-5), 4.10 (m, 1H, H-7),

3.88 (s, 3H, H-OMe); 2.69 (s, 3H, H-11); 2,36-2,30 (m,1H, H-8); 2,15 (s, 3H, H-

OAc), 2.05-1.99 (m, 1H, H-6), 1.72-1.67 (m, 1H, H-6), 1.44 (s, 9H, H-Boc); 0.98 (d, J = 7 Hz, 3H, H-9), 0.87 (d, J = 7 Hz, 3H, H-10). 13C- NMR: (125 MHz, CDCl3)

δ ppm: 170.2 (C-4), 169.7 (C-1), 156.3 (CO-Ac), 145.9 (C-2), 141.6 (CO-Boc),

130.9 (C-3), 79.75 (C-tertBoc), 69.21 (C-5), 56.47 (C-7), 53.26 (OMe), 34.89 (C-

11), 30.5 (C-6), 29,70 (C-8), 28.4 (C-Boc), 21.0 (C-9), 19.9 (C-10).

2.2.5. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của Tuv (79) và Tup (47a)

Methyl-2-((5R,7R)-5-acetoxy-7-((trifluoroacetic)(methyl)amino)-8-

methylpentyl)thiazole-1-carboxylate (80)

Ester 79 (100 mg, 0.24 mmol) trong 1mL DCM làm lạnh đến 0 oC, hỗn hợp gồm TFA/TIPs/H2O

(1 mL, với tỷ lệ 95/2,5/2,5) đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở 0 oC trong 2h. Kết thúc phản

ứng, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 80 (98 mg, 95%) là chất rắn vàng nhạt. 1H- NMR: (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 7.82 (s, 1H, H-3), 5.82 (dd, J = 11.5, 3.0 Hz, 1H, H-5), 4.14-4.05 (m, 1H, H-7), 3.88 (s, 3H, OMe), 2.69 (s,

3H, H-11), 2.36-2.30 (m, 1H, H-8); 2.15 (s, 3H, OAc), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.72-1.67

(m, 1H), 0.98(d, J = 7 Hz, 3H, H-9), 0.87 (d, J = 7 Hz, 3H, H-10).

(2S,4R)-(1’R,2’S,5’R)-2’-Isopropyl-5’-methylcyclohexyl 4-((trifluoroacetic)

amino)-2-methyl-5-phenylpentanoate (81)

Ester 47a (150 mg, 0.33 mmol) trong 1ml DCM làm lạnh đến 0 oC, hỗn hợp gồm TFA/TIPS/H2O (1mL; với tỷ lệ 95/2,5/2,5) đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở 0oC trong 2h. Kết thúc phản ứng, cất loại dung môi dƣới

áp suất giảm thu đƣợc sản phẩm 81 (143.9 mg, 95%) chất rắn màu vàng nhạt. 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.32 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.26-7.23 (m, 1H), 7.21 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.70 (td, J = 10.9, 4.3 Hz, 1H),

4.39-4.37 (m, 1H), 3.90 (brs, 1 H), 2.87-2.75 (m, 2H), 2.65-2.54 (m, 1H), 2.02 (d, J

= 11.9 Hz, 1H), 1.93-1.83 (m, 2H), 1.73-1.67 (m, 2H), 1.51-1.37 (m, 5H), 1.17 (t, J

= 7.4 Hz, 3H), 1.12-1.02 (m, 2 H), 0.98-0.84 (m, 9H, H-8‟,9‟), 0.77 (d, J = 7.0 Hz,

3H, H-10‟).

(S,E)-Ethyl-4-(( trifluoroacetic)amino)-2-methyl-5-phenylpent-2-enoate (82)

Ester 42 (150 mg, 0.45 mmol) trong 1ml DCM làm lạnh đến 0 oC, hỗn hợp gồm TFA/TIPS/H2O (1mL, với tỷ lệ 95/2,5/2,5) đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở 0 oC

trong 2h. Kết thúc phản ứng, cất loại dung môi dƣới áp

1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.32-7.31 (m, 2 H), 7.24 (t, J = 7.2 Hz,

suất giảm thu đƣợc sản phẩm 82 (148.3 mg, 95%) là tinh thể vàng nhạt.

1 H), 7.20-7.18 (m, 2 H), 6.54 (dq, J = 9.1, 1.2 Hz, 1 H, H-3), 4.68-4.61 (m, 2 H, H-

1‟), 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 1H, H-4), 2.94 (dd, J = 13.3, 5.6 Hz, 2H, H-5), 2.80 (dd, J

= 13.4, 7.1 Hz, 1 H), 1.72 (d, J = 0.7 Hz, 3 H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3 H (C-2‟).

Methyl-2-((1R,3R)-1-hydroxy-4-methyl-3-(methylamino)pentyl)thiazole-4-

carboxylate (83)

Chất 77 (200 mg, 0.52 mmol) trong MeOH đƣợc làm lạnh đến 0 oC, dung dịch thionyl chloride (1 mL) đƣợc thêm chậm vào. Hỗn hợp đƣợc khuấy ở 0 oC thêm 1h và ở nhiệt

độ phòng 12h. Kết thúc phản ứng, cất loại dung môi, cặn

đƣợc thêm vào Na2CO3 đến pH ≈ 9 và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan

bằng Na2SO4, sau đó cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc chất 83 (104

1H- NMR: (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 8.13 (s, 1H, H-3), 5.37-5.30 (t, 1H, H- 5), 3.93 (s, 1H, OMe), 2.40 (H-11, s, 3H, H-11), 2.39-2.36 (m, 1H, H-7), 2.21-2.16 (m, 1H, H-8), 2.03-1.94 (m, 2H, H-6), 0.89 - 0.87 (m, 6H, H-9, H-10). 13C- NMR:

mg, 55 %).

(CDCl3, 125 MHz), δ ppm: 179.8 (C-1), 162.1 (C-4), 147.0 (C-2), 127.4 (C-3), 71.4

(C-5), 62.6 (OMe), 52.2 (C-7), 32.7 (C-6), 32.5 (C-8), 19.6 (C-9), 16.8 (C-10)

2.2.6. Tổng hợp dipeptide

Muối 80 (150 mg, 0.35 mmol) trong DMF đƣợc

thêm vào DIPEA (1mL), khuấy hỗn hợp 15 phút ở

nhiệt độ phòng và chất Boc-Ile-OH (87.8 mg, 0.38

mmol) và HATU (173.2 mg, 0.46 mmol) lần lƣợt

đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 16h. Kết thúc phản ứng,

hỗn hợp đƣợc thêm EtOAc, và rửa với nƣớc. Dịch chiết đƣợc làm khan bằng

Na2SO4, cất loại dƣới áp suất giảm đến khô. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên cột

sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 3/1) thu đƣợc sản phẩm 84 (125,2 mg, 67%), là

chất lỏng không màu.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8.13 (s, 1H, H-3 ), 5.73 (dd, J = 3 Hz,

11.5 Hz, 1H, H-5); 4.54 (br, 1H, H-2‟), 3.94 (s, 3H, OMe), 2.98 (s, 3H, H-11), 2.37-

2.31 (m, 1H, H-7), 2.20-2.19 (m, 1H), 2.16 (s, 3H, OAc), 1.76-1.67 (m, 1H); 1.44

(s, 9H, H-Boc), 1.00- 0.91 (overlap, 9H, H-9,10,6‟), 0.83 (d, J = 7 Hz, 3H, H-5‟).

Chất 84 (200 mg; 0,38 mmol) trong 3ml THF/H2O

(3/1) đƣợc thêm vào LiOH (91.2 mg, 3.8 mmol).

Phản ứng đƣơc khuấy ở nhiệt độ phòng 12h. Kết

thúc phản ứng, cất loại dung môi, thêm HCl loảng đến môi trƣờng axit nhẹ, lọc tủa, sấy ở 45 oC thu đƣợc sản phẩm 85 (149.1 mg,

1H- NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm) 8.29 (s, 1H, H-3), 4.69 (dd, J = 10.5;

90%) là chất rắn màu trắng.

1.5 Hz; 1H, H-5), 4.50-4.48 (m, 1H, H-2‟), 3.16 (s, 3H, H-11), 2.90 (m, 1H, H-7),

2.25 (m, 1H, H-3‟), 1.98-1.92 (m, 1H, H-8), 1.85-1.83 (br, 2H, H-6), 1.68-1.63 (m,

2H, H-4‟), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.25-1.23 (m, 2H), 1.00-0.97 (overlap, 6H, H-9,10), 0.95 (d, J =7 Hz, 3H, H-6‟), 0.87 (d, J =7 Hz, 3H, H-5‟). 13C-NMR (125 MHz,

CD3OD) δppm: 180.1 (C-1‟), 172.9 (C-1), 164.1 (C-4), 157.9 (CO-Boc), 148.3 (C-

2), 128.9 (C-3), 80.4 (C-tertBoc), 69.8 (C-5), 61.5 (C-2‟), 56.7 (C-7), 38.6 (C-11),

37.5 (C-6), 31.0 (C-3‟), 28.6 (C-Boc), 25.6 (C-8), 20.8 (C-4‟), 20.5 (C-9), 20.1 (C-

10), 14.6 (C-6‟), 11.2 (C-5‟).

Hợp chất 85 (100 mg, 0.21 mmol) trong DCM đƣợc

thêm vào 1mL TEA và tiếp sau với acetic anhydride

(23.6 mg, 0.23 mmol) và 1% mol DMAP. Phản ứng

đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc

phản ứng thêm nƣớc và chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.13 (s, 1H, H-3 ), 5.76-5.69 (m, 1H, H-5), 4.54-4.52 (m, 1H, H-2‟), 2.98 (s, 3H, H-11), 2.37-2.31 (m, 1H, H-7), 2.20-

đuổi dung môi thu đƣợc sản phẩm 86 dạng lỏng màu vàng nhạt (100.2 mg, 94%).

2.19 (m, 1H, H-3‟), 2.18 (s, 3H, OAc), 1.76-1.67 (m, 1H, H-8), 1.44 (s, 9H, H-Boc),

1.00-0.91 (overlap, 9H, H-5‟, H-9,10), 0.83 (d, J = 7 Hz, 3H, H-7‟).

Muối 80 (150 mg, 0.35 mmol) trong DMF đƣợc thêm

vào DIPEA (1mL), khuấy hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ

phòng và chất Boc-leucin (87.8 mg, 0.38 mmol) và

HATU (173.2 mg; 0.46 mmol) lần lƣợt đƣợc thêm

vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 16h. Kết

thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc thêm EtOAc, và rửa với nƣớc. Dịch chiết đƣợc làm

khan bằng Na2SO4, cất loại dƣới áp suất giảm đến khô. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế

trên cột sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 3/1) thu đƣợc sản phẩm 87 (129.1 mg,

70%) là chất lỏng không màu.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm = 8.13 (s, 1H, H-3 ), 5.76 (dd, J = 11.5 Hz, 3.0 Hz, 1H, H-5), 4.53 (t, 1H, H-2‟), 3.94 (s, 3H, OMe), 2.98 (s, 3H, H-11),

2.37-2.31 (m, 1H, H-7), 2.16 (s, 3H, OAc), 2.20-2.19 (d, 1H, H-3‟), 1.76-1.67 (m,

1H, H-3‟), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.18 (d, J = 7 Hz; 6H, H-9,10), 1.00 (d, 3H, H-5),

0.83 (d, J = 7 Hz, 3H, H-6).

2.2.7. Tổng hợp tripeptide.

2.2.7.1. Tổng hợp tripeptide 88

Muối trifluoroacetic của 84 (150 mg,

0.41 mmol) trong DMF đƣợc thêm 0,5

mL DIPEA và N-methylpipecolinic

acid (64.5 mg. 0.45 mmol). Hỗn hợp

đƣợc khuấy 10 phút, chất HATU (205.5

mg, 0.54 mmol) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng

trong 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc

đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế bằng

sắc ký cột silica gel (hệ rửa giải nHexan/EtOAc; 1/1) thu đƣợc sản phẩm 88 (135.8

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.13 (s, 1H, H-3), 7.05 (d, J = 9 Hz,

mg, 60%).

1H), 5.75 (d, J = 11 Hz, 1H, H-5), 4.76 (t, J = 8 Hz, 1H, H-13), 4.5 (br, 1H, H-1‟),

3.93 (s, 3H, OMe), 3.03 (s, 3H, H-11), 2.37-2.32 (m, 1H, H-7‟), 2.25 (brs, 3H, H-

6‟), 2.24 (m, 1H, H-5‟), 2.16 (m, 1H, H-5‟), 2.17 (s, 3H, OAc), 1.83-1.79 (m, 4H),

1.70-1.67 (m, 1H, H-14), 1.63-1.59 (m, 4H), 1.15-1.10 (m, 1H), 0.99- 0.98 (overlap,

13C-NMR (125MHz, CDCl3), δ (ppm): 176.7 (C-12), 173.8 (C-18), 171.4 (C- 4), 170.5 (C-OAc), 161.8 (C-1), 146.7 (C-2), 128.1 (C-3), 69.9 (C-5), 69,5 (C-1‟),

6H), 0.91 (t, J = 7 Hz, 3H, H-17), 0.78 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16).

55.5 (C-7), 53.3 (C-13), 52.5 (C-5‟), 49.7 (C-OMe), 48.7 (C-6‟), 44.6 (C-11), 36.8

(C-6), 34.5 (C-8), 30.4 (C-14), 29.8 (C-2‟), 25.0 (C-4‟), 24.4 (C-15), 23.1 (C-3‟),

20.7 (C-9), 20.0 (C-10, 15.9 (C-17), 10.8 (C-16).

2.2.7.2. Tổng hợp tripeptide 89, 90, 90b, 91, 92.

Các muối trifluoroacetic (81, 82), phenylalanine methyl ester hydrochloride

trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq DIPEA và chất 85 hoặc 86 (1,1 eq) đƣợc thêm vào

tiếp sau. Hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút và chất HATU (1,2 eq) tiếp tục đƣợc thêm

vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc

và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung

môi. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel (hệ rửa giải

nHexan/EtOAc -1/1) thu đƣợc các tripeptide 89, 90, 90b, 91, 92 với hiệu suất đạt

60- 64%

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.11 (s, 1H, H-9), 7.29-7.27 (m, 2H, H-phenyl),

Hợp chất 89, chất lỏng không màu.

7.25-7.22 (m, 3H, H-phenyl), 6.67 (dd, J =

9 Hz, 1.5 Hz, 1 H, H-4), 5.65 (dd, J = 11.5,

2.5 Hz, 1H, H-11), 5.17-5.10 (m, 1H, H-

19), 4.54 (t, J = 7 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 10

Hz, 7 Hz, 1H, H-5), 4.22-4.15 (m, 2H, H-1‟), 3.11-3.08 (dd, J = 10 Hz, 7 Hz, 1H),

3.01 (s, 3H, H-17), 2.93-2.91 (dd, J = 10 Hz, 7 Hz, 1H, H-6), 2.33 (m, 1H, H-13),

2.16 (s, 3H, OAc), 2.06-2.04 (m, 1H), 1.76 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 1.65-1.61 (m,

1H), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.30-1.26 (t, J = 7 Hz, 3H, H-2‟), 1.14 (d, J =7 Hz, 3H,-

H-23), 0.98 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-15), 0.93 (t, J = 7 Hz, 3H, H-16), 0.84 (d, J = 7

Hz, 3H, H-22).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm:174.3 (C-18), 170.2 (C-10), 170.1 (CO-OAc), 167.8 (C-1), 160.0 (C-7), 156.0 (CO-Boc), 149.7 (C-8), 138.9 (C1-

Phenyl), 136.5 (C-4), 130.5 (C-9), 129.6 (C2,6-phenyl), 128.5 (C3,5-phenyl), 126.8

(C-2), 123.7 (C4-phenyl), 79.5 (C-tert), 69.5 (C-11), 60.8 (C-19), 55.1 (C-13), 48.7

(C-5), 40.9 (C-6), 37.0 (C-17), 34.6 (C-20), 30.0 (C-14), 29.7 (C-Boc), 28.4 (C-21),

28.3(C-2‟), 24.1 (CH3-Ac), 20.7 (C-15), 20.1 (C-16), 19.5 (C-3), 14.2 (C-2‟), 12.7

(C-23), 11.1 (C-22)

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm:

Hợp chất 90, chất lỏng không màu

8.01 (s, 1H, H-9), 7.28-7.21 (m, 5H, H-

phenyl), 5.63 (dd, J = 11 Hz, 2 Hz, 1H,

H-11), 5.11 (d, J = 10 Hz, 1H, H-1‟),

4.66 (td, J = 10.5 Hz, 4.5 Hz, 1H, H-19),

4.53 (t, J = 10.5 Hz, 1H, H-5), 4.44 (t, J

= 9.5 Hz, 1H, H-13), 4.37 (m, 1H), 3.06 (s, 3H, H-17), 2.90 (m, 2H, H-6), 2,59-2,56

(m, 1H, H-20), 2.32 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.18 (s, 3H, OAc), 2.08-2.00 (m, 3H, H-3),

1.90-1.83 (m, 2H), 1.73-1.67 (m, 2 H), 1,68-1,63 (m, 1H), 1.51-1.37 (m, 6H), 1.41

(s, 9H, H-Boc), 1.18 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-15), 1.03 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-9‟), 0.94

(d, J = 7.5 Hz, 3H, H-7‟), 0.9-0.88 (overlap, 9H, H-23, 15,16), 0.77 (d, J = 7.0 Hz,

3 H, H-22).

13C- NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm: 175.7 (C-18), 174.4(C-10), 170.1 (CO-Ac), 169.9 (C-1), 160.3 (C-7), 156.0 (CO-Boc), 150.1 (C-8), 137.6 (C1-

phenyl), 129.7 (C2,6-phenyl), 128.4 (C3,5-phenyl), 126.5 (C-9), 123.4 (C4-pheny),

79.5 (C-tertBoc), 74.3 (C-11), 69.6 (C-1‟), 55.2 (C-19), 48.7 (C-13), 47.0 (C-5),

40.9 (C-6), 40.7 (C-17), 37.7 (C-20), 37.1 (C-2), 34.7 (C-2‟), 34.3 (C-5‟), 31.4 (C-

14), 30.1 (C-10), 28.3 (C-Boc), 26.2 (C-8‟), 24.1 (C-4), 23.3 (CH3-Ac), 22.7, 22.1

(C-21), 21.6, 20.8 (C-10‟), 20.2 (C-9‟), 19.5 (C-7‟), 18.0 (C-15), 17,6 (C-16), 16.0

(C-3), 15.9 (C-23), 11.2 (C-22).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm:

Hợp chất 90b, chất lỏng không màu

8.01 (s, 1H, H-9), 7.29-7.22 (m, 5H),

5.35 (dd, J = 11 Hz, 2 Hz, 1H, H-11),

5.09 (d, J = 10 Hz, 1H, H-1‟), 4.67 (td,

J = 10.5 Hz, 4.5 Hz, 1H, H-19), 4.53 (t,

J = 10.5 Hz, 1H, H-5), 4.44 (t, J = 9.5

Hz, 1H, H-13), 4.37 (m, 1H), 3.06 (s, 3H, H-17), 2.90 (m, 2H, H-6), 2,59-2,56 (m,

1H), 2.32 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.08-2.00 (m, 3H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.73-1.67 (m, 2

H), 1,68-1,63 (m, 1H), 1.51-1.37 (m, 6H), 1.41 (s, 9H), 1.18 (d, J = 7.5 Hz, 3H),

1.03 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 0.9-0.88 (overlap, 9H),

0.70 (d, J = 7.0 Hz, 3 H, H-22).

1H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-6), 7.29-7.26 (m, 3H, H-phenyl), 7.18-

Hợp chất 91, chất lỏng không màu

7.16 (m, 2H, H-phenyl), 5.64 (td, J = 3.5 Hz,

11.5 Hz, 1H, H-8), 5.10 (dd, J = 13, 2.5 Hz,

1H, H-16), 5.04 (m, 1H, H-2), 4.54-4.52 (m, 1H, H-10), 4.34 (t, J = 7 Hz, 1H), 3.73

(s, 3H, OMe), 3.23 (t, J = 4 Hz, 2H, H-3), 2.98 (s, 3H, H-14), 2.96 (d, J = 7 Hz,

1H), 2.35-2.29 (m, 1H), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.09-2.06 (m, 1H), 1.44 (s, 9H, H-Boc),

1.03 (t, J = 7 Hz, 3H, H-13), 0.97 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-12), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-20), 0.83 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm: 174.3 (C-15), 171.7 (C-7), 170.2 (CO-Ac), 170.0 (C-1), 160.3 (C-4), 156.0 (CO-Boc),

149.3 (C-5), 135.9 (C1-phenyl), 129.3 (C-6), 128.5, 127.1, 124.0 (C4-phenyl), 79.4

(C-tertBoc), 69.5 (C-8), 69.1 (C-16), 55.1 (C-2), 53.1 (OMe), 52.3 (C-10), 50.5 (C-

14), 38.2 (C-3), 37.0 (C-17), 34.7 (C-11), 29.9 (C-Boc), 28.3 (C-Ac), 24.1 (C-9),

20.8 (C-18), 19.6, 18.9 (C-12), 15.9 (C-13), 13.7 (C-20), 11.1 (C-19)

1H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-6), 7.29-7.26 (m, 3H), 7.18-7.16 (m,

Hợp chất 92, chất lỏng không màu.

2H), 5.35 (td, J = 3.5 Hz, 11.5 Hz, 1H, H-8),

5.16-5.09 (dd, J = 13, 2.5 Hz, 1H, H-16), 5.04

(m, 1H), 4.54-4.52 (m, 1H, H-2), 4.34 (t, J = 7 Hz, 1H, H-10), 3.73 (s, 3H, OMe),

3.24 (t, J = 4 Hz, 2H, H-3), 3.05 (s, 3H, H-14), 2.96 (d, J = 7 Hz, 1H), 2.35-2.29 (m,

1H, H-17), 2.09-2.06 (m, 1H, H-11), 1.44 (s, 9H, H-Boc), 1.03 (t, J = 7 Hz, 3H),

0.97 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 7 Hz, 3H, H-20), 0.84 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19).

2.2.8. Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin

Quy trình phản ứng tổng hợp tetrapeptide 93, 93a

Muối trifluoroacetic 90c/90a (150 mg, 0.18 mmol) trong DMF (2 mL) đƣợc

thêm vào DIPEA (0.5 mL) và N-methylpipecolinic acid (27.2 mg, 0.19 mmol) đƣợc

thêm vào tiếp sau, hỗn hợp đƣợc khuấy 10 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU

(86.4 mg, 0.23 mmol) tiếp tục đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ

phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc,

dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Sản phẩm thô đƣợc

tinh chế trên sắc ký cột silica gel (nHexan/EtOAc, 1/1) thu đƣợc dẫn xuất ester

93/93a (81.5 mg), hiệu suất phản ứng đạt 55%.

Quy trình phản ứng thủy phân ester 93

Ester 93 (60 mg, 0.07 mmol) trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2 mL, 2/1) đƣợc thêm vào KOH (19.6 mg, 0.35 mmol). Phản ứng đƣợc khuấy ở 45 oC trong

48h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc

đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc,

dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm

thô trên cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH, 10/1) thu đƣợc axit 94 (36 mg), hiệu

suất phản ứng đạt 92%.

Quy trình phản ứng acetyl hóa acid 94

Axit 94 (30 mg, 0.04 mmol) trong dung môi DCM đƣợc thêm vào acetic

anhydride (4.9 mg, 0.05 mmol), lƣợng dƣ TEA (1 mL) và 5% mol DMAP. Phản

ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc và

chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp

suất giảm và tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột silica gel với hệ rửa giải

DCM/MeOH (20/1), thu đƣợc axit 95 (27 mg) có chứa nhóm acetyl trên mạch tuv,

với hiệu suất của phản ứng acetyl đạt 90%.

Hợp chất 93, chất lỏng không màu

27 -2.15 (c 0.11, MeOD), MS(ESI): [M+H]+ 824.5302 (Tính cho C46H74N5O6S: 824.5360). 1H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 8.01 (s, 1H, H-9), 7.26 (m, 2H, H-phenyl), 7.21-7.20 (m, 3H, H-phenyl), 5.17 (dd, J = 9.5 Hz, 1H, H-

[α]D

11), 4.70 (br, 1H, H-1‟‟), 4,65 (td, J = 10.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-1‟), 4.41-4.38 (m,

1H, H-19), 3.74-3.71 (m. 2H, H-5, H-13), 3.46-3.44 (m, 2H, H-4‟), 3.28 (s, 3H, H-

5‟), 3.20 (m, 1H, H-6), 3.01 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.90-2.87 (m,

1H, H-20), 2.59-2.55 (m, 1H, H-2‟‟), 2.35-2.30 (m, 4H), 2.05-1.99 (m, 4H), 1.91-

1.85 (m, 6H), 1.67-1.65 (m, 4H, H-3), 1.39-1.38 (br, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 1.20

(d, J = 7.5 Hz, 3H, H-10‟), 1.02-0.98 (m, 3H, H-9‟). 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H-7‟),

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 176.2 (C-18), 175.7 (C-10), 172.2 (C- 1), 160.3 (C-24), 150.1 (C-7), 149.8 (C-8), 137.6 (C1-phenyl), 129.7 (C-9), 128.3,

0.86-0.83 (overlap, 9H, H-15, 16, 23), 0.75 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

126.4, 123.0 (C4-phenyl), 74.25 (C-11), 69.5 (C-1‟‟), 68.7 (C-19), 66.9 (C-1‟), 59.8

(C-13), 55.3 (C-17), 52.3 (C-5‟), 48.6 (C-4‟), 47.1 (C-6), 41.0, 40.6, 38.6, 37.8,

36.7, 34.3, 31.4, 30.8, 29.6, 27.3, 26.1, 24.9, 23.2, 22.5, 22.0, 20.8 (C-10‟), 20.0 (C-

9‟), 18.0 (C-7‟), 16.7 (C-15), (C-16), 16.1 (C-3), 11.7 (C-23), 10.7 (C-22)

Hợp chất 93a, chất lỏng không màu

27 -2.96 (c 0.13, MeOD), 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.01 (s, 1H, H-9), 7.26 (m, 2H), 7.21-7.20 (m, 3H), 5.67 (dd, J = 9.5 Hz, 1H, H-11), 4.70

[α]D

(br, 1H, H-1”), 4,65 (td, J = 10.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-19), 4.41-4.38 (m, 1H, H-1‟),

3.74-3.71 (m. 2H, H-5, 13), 3.46-3.44 (m, 2H, H-4‟), 3.28 (s, 3H, H-5‟), 3.20 (m,

1H), 3.01 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.90-2.87 (m, 1H, H-6), 2.59-2.55

(m, 1H, H20), 2.35-2.30 (m, 4H), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.05-1.99 (m, 4H), 1.91-1.85

(m, 6H), 1.67-1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (br, 1H), 1.36-1.30 (m, 1H), 1.20 (d, J = 7.5

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 177.6 (C-18), 176.2 (C-10), 175.7 (CO- OAc), 172.2 (C-1), 160.3 (C-24), 150.1 (C-7), 149.8 (C-8), 137.6 (C1-phenyl),

Hz, 3H, H-7”), 1.02-0.98 (m, 6H, H-9”, 10”). 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 0.86-0.83 (overlap, 9H, H-23, 15, 16), 0.75 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

129.7 (C-9), 128.3, 126.4, 123.0 (C4-phenyl), 74.25 (C-11), 69.5 (C-1”), 68.7 (C-

1‟), 66.9 (C-19), 59.8 (C-5), 55.3 (C-13), 52.3 (C-17), 48.6 (C-5‟), 47.1 (C-4‟), 41.0

(C-6), 40.6 (C-20), 38.6 (C-2”), 37.8 (C-12), 36.7 (C-5”), 34.3 (C-14), 31.4 (C-8”),

30.8 (C-4), 29.6 (C-2‟), 27.3 (C-6”), 26.1 (C-21),25.8 (C-4”) 24.9 (C-3”), 23.2 (C-

3‟), 22.5 (CH3-Ac), 22.0(C-7”), 20.8 (C-9”), 20.0 (C-10”), 18.0 (C-16), 16.7 (C-15),

16.1 (C-3), 11.7 (C-23), 10.7 (C-22).

Hợp chất 94, chất rắn màu trắng

27 -10.52 (c 0.12, MeOD), HRMS-ESI: [M+H]+ 686.3903 (Tính cho C36H56N5O6S, 686.3951). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.04 (s, 1H, H-9), 7.25-7.24 (m, 4H), 7.20-7.17 (br, 1H), 5.17-5.15 (m, 1H, H-11), 4.74-4.68 (m, 2H,

[α]D

H-19, H-1‟), 4.42-4.35 (m, 2H, H-5) 3.73-3.71 (m, 1H, H-13), 3.60-3.5 (m, 2H, H-

5‟), 3.18 (t, 2H, H-6), 3.19 (s, 3H, H-17), 2.94 (m, 2H), 2.78-2.72 (m, 1H), 2.59-

2.57 (m, 1H), 2.55 (s, 3H, H-6‟), 2.30-2.25 (m, 2H), 1.95-1.93 (m, 2H), 1.91-1.88

(m, 2H), 1.84-1.82 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 4H), 1.17-1.5 (d, 3H, H-3), 1.07-1.04

(overlap, 3H, H-16), 0.99 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-23),

0.87 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

Hợp chất 95, chất rắn màu trắng

27 -11.26 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H]+:728.4051 (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.11 (s, 1H, H-9), 7.29-7.22 (m, 5H, H-phenyl), 5.70 (td, J = 10.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-11), 4.74

[α]D

(overlap, 2H, H-19, 1‟), 4.58-4.53 (m, 1H, H-5), 4.40 (br, 1H), 3.72-3.71 (m, 1H, H-

13), 3,.60-3.5 (m, 2H, H-5‟), 3.23-3.18 (m, 2H, H-6), 3.11 (s, 3H, H-17), 2.94 (m,

1H), 2.59-2.57 (m, 1H, H-20), 2.35 (s, 3H, H-6‟), 2.15 (s, 3H, OAc), 2.30-2.25 (m,

2H), 1.91-1.88 (m, 6H), 1.69-1.58 (m, 4H), 1.16 (d, 3H), 1.07-1.04 (overlap, 3H, H-

3), 0.99-0.97 (overlap, 6H, H-15,16), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-23), 0.80 (d, J = 7

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ ppm: 177.7 (C-1), 174.9 (C-18), 172.5 (C- 10), 171.7 (CO-OAc), 171.1 (C-7), 162.6 (C-24), 150.1 (C-8), 139.4 (C1-phenyl),

Hz, 3H, H-22).

130.5 (C-9), 129.5 (C2,6-phenyl), 127.4 (C3,5-phenyl), 125.1 (C4-phenyl), 75.6 (C-

11), 71.2 (C-1‟), 69.6 (C-19), 64.4 (C-13), 55.8 (C-5‟), 55.2 (C-5), 40.6 (C-6‟), 38.6

(C-17), 35.7 (C-6), 32.3 (C-2), 31.4 (C-20), 27.6 (C-14), 25.3 (C-12), 24.9 (C-2‟),

23.2 (C-21), 22.0 (CH3-Ac), 20.0 (C-4‟), 18.0 (C-3‟), 16.7 (C-3), 16.1 (C-16), 13.13

(C-15), 11.2 (C-23), 9.2 (C-22).

2.2.9. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin

2.2.9.1. Tổng hợp chất tương tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine

Hợp chất 96, chất lỏng không màu

27 -15.44 (c 0.09, MeOD). HRMS-ESI: [M+H]+ 866.5481 (Tính cho C48H76N5O7S: 866.5465). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 8.02 (s, 1H, H-9), 7.28-7.20 (m, 5H, phenyl), 7.14 (d, J = 6 Hz, 2H, NH), 5.66 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-

[α]D

11), 4.80-4.78 (m, 1H, H-1”), 4.67 (m, 1H, H- 1‟), 4.59 (m, 1H, H-19), 4.43-4.37

(m, 1H, H-5), 3.04 (s, 3H, H-17), 2.95-2.94 (m, 1H, H-13), 2.88-2.82 (m, 1H, H-6),

2.59-2.57 (m, 1H, H-6), 2.35-2.30 (m, 2H, H-5‟), 2.28 (s, 3H, H-6‟), 2.15 (s, 3H,

OAc), 2.10-1.93 (m, 4H), 1,87-1.75 (m, 4H), 1.69-1.55 (m, 6H, H-3), 1.48-1.32 (m,

2H), 1.18 (d, J = 7 Hz, 6H, H-9”,10”), 0.87 (overlap, 9H, H-15,16,7”), 0.83 (d, J =

6.5 Hz, 3H, H-22), 0.71 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ ppm: 176.1 (C-18), 175.7 (C-10), 173.6 (CO-OAc), 170.0 (C-1), 160.6 (C-24), 150.1 (C-7), 137.6 (C-8), 129.5 (C1-phenyl),

128.4 (C-9), 126.5, 123.5, 123.3 (C4-phenyl), 74.3 (C-11), 69.5 (C-1”), 69.4 (C-19)

53.1 (C-1‟), 48.8 (C-5), 47.0 (C-17), 46.9, 44.7 (C-13), 40.8 (C-6), 40.7 (C-6‟), 37.8

(C-2‟), 37.1, 36.9, 34.7 (C-5‟), 34.6, 34.3 (C-2”), 34.2, 31.4 (C-5”), 31.3, 29.9 (C-

2), 26.2, 24.9, 24.5 (C-3‟), 23.4 (CH3-Ac), 22.0 (C-7”), 20.8 (C-10”), 20.7 (C-9”),

20.0 (C-16), 19.6 (C-15), 18.0 (C-3), 16.1 (C-22), 10.9 (C-23).

2.2.9.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N-terminal

Tƣơng tự phản ứng tổng hợp tubulysin 95, các dẫn xuất 97, 98, 99, 100, 101

đƣợc tổng hợp từ tripeptide 90 hoặc 90b qua ba phản ứng liên tiếp.

Quy trình phản ứng tổng hợp các ester tetrapeptide.

Muối trifluoroacetic của 90/90b (1 eq) trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq

DIPEA, và 1,1 eq các acid (3-methylpicolinic acid/ isoquinoline -1-cacboxylic acid/

5-methyl pyrazine-2 carbocylic acid, N-allylpipecolinic acid ) đƣợc thêm vào tiếp

sau, hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU (1,2eq) tiếp tục

đƣợc thêm vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 14h. Kết

thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan

bằng Na2SO4, cất loại dung môi. Sản phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica

gel (hệ rửa giải nHexan/EtOAc, 1/1) thu đƣợc các tetrapeptide là dẫn xuất ester của

menthol thu đƣợc với hiệu suất đạt từ 50-55%.

Quy trình phản ứng thủy phân các dẫn xuất menthyl ester

Các menthyl ester ở trên trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1) đƣợc thêm vào 5 eq KOH. Phản ứng đƣợc khuấy ở 45 o C trong 48 h. Kết thúc phản ứng, dung

môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với

dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng

Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel

(DCM/MeOH) thu đƣợc các sản phẩm acid với hiệu suất đạt 80-85%.

Quy trình phản ứng acetyl hóa

Các acid nhận đƣợc từ phản ứng thủy phân menthyl trong dung môi DCM

đƣợc thêm vào 1,2 eq acetic anhydride, lƣợng dƣ TEA và 5% mol DMAP. Phản

ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc và

chiết với DCM, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp

suất giảm và tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột silica gel với hệ rửa giải

DCM/MeOH (20/1), thu đƣợc các acid có nhóm acetyl trên Tuv gồm 97, 98 với

hiệu suất của phản ứng acetyl đạt từ 90 - 95%.

Hợp chất 97, chất rắn màu vàng nhạt

27 -5.27 (c 0.15, MeOD). HRMS-ESI [M+H-H2O]+: 704.3488 (Tính cho C38H50N5O6S: 704.3482). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.57 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-5‟), 8.40 (dd, J = 4.5 Hz, 1 Hz, 1H, H-9), 7.88 (s, 1H, H-3‟), 7.56-7.54

[α]D

(m, 1H, H-4‟), 7,31-7.20 (m, 5H, H-phenyl), 5.74 (td, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-

11), 4.97-4.95 (m, 1H, H-19), 4.55-4.51 (m, 1H, H-5), 3.47-3.43 (dd, J = 11.5 Hz,

3.5 Hz, 1H, H-13), 3.22-3.19 (m, 2H, H-6), 3.07 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H,

H-20), 2.72-2.76 (m, 1H), 2.70 (s, 3H, H-6‟), 2.55 (m, 1H, H-2), 2.41-2.39 (m, 1H,

H-14), 2.25-2.30 (m, 1H, H-12), 2.18 (s, 3H, OAc), 1.95-1.93 (m, 1H, H-12), 1.78-

1.73 (m, 2H, H-4), 1.72-1.68 (m, 2H, H-21), 1.55-1.49 (m, 1H), 1.19 (d, J = 7 Hz,

3H, H-3), 1.15 (d, J = 7 Hz, 2H), 1.07 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23), 0.97 (d, J = 7 Hz,

3H, H-15), 0.94 (overlap, 3H, H-16), 0.76 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 177.6 (C-1), 173.4 (C-18), 170.2 (C- 10), 169.2 (CO-Ac), 169.1 (C-24), 165.6 (C-7), 163.4 (C-1‟), 149.4 (C-8), 147.2 (C-

5‟), 145.7 (C-2‟), 140.5 (C-3‟), 137.1 (C-4‟), 136.6 (C1-phenyl), 129.7, 128.8,

127.3, 126.9, 125.5 (C-9), 125.1 (C4-phenyl), 69.7 (C-11), 57.0 (C-19), 56.3 (C-

13), 55.7 (C-5), 53.7 (C-6), 39.5 (C-20), 39.0 (C-2), 37.5 (C-12), 36.6 (C-3), 34.3

(C-17), 31.9 (C-14), 29.7 (C-21), 24.1 (C-6‟), 20.8 (C-15,16), 16.2 (C-3), 13.8 (C-

23), 11.2 (C-22).

Hợp chất 98, chất rắn màu vàng nhạt

27 -26.75 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H]+: 758.3566 (Tính cho C41H52N5O7S: 758.3587). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-3‟), 8.48 (d, J = 5.5 Hz, 1H, H-9), 8.02 (s, 1H, H-

[α]D

8‟), 7.83 (d, J = 8 Hz, 1H, H-5‟), 7.78 (d, J = 8 Hz, 1H, H-7‟), 7.71 (t, J = 7 Hz, 1H,

H-6‟), 7.66 (t, J = 7 Hz, 1H, H-2‟), 7.29-7.27 (m, 3H, H-phenyl), 7.22-7.20 (m, 2H,

H-phenyl), 5.73 (dd, J = 11.5 Hz, 2.5 Hz, 1H, H-11), 5.10-5.05 (m, 1H, H-19), 4.59-

4.56 (m, 1H, H-5), 4.39-4.38 (br, 1H, H-13), 3.15 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H,

H-6), 2.92-2.83 (m, 1H, H-6), 2.63-2.58 (m, 2H, H-14,20), 2.35-2.34 (m, 1H, H-2),

2.19 (s, 3H, OAc), 2.05-1.97 (m, 2H, H-12), 1.82-1.73 (m, 2H, H-4), 1.68-1.62 (m,

2H, H-21), 1.19-1.17 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-3), 1.09 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-15), 1.04

(d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16), 0.87 (d, J = 7 H, 3H, H-23), 0.81 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 175.7 (C-1), 173.3 (C-18), 170.1 (C- 10), 169.9 (CO-Ac), 165.7 (C-7), 160.5 (C-24), 150.2 (C-1‟), 147.8 (C-9‟), 140.5

(C-8), 137.4 (C1-phenyl), 132.3 (C-3‟), 131.4 (C-8‟), 130.9 (C-7‟), 130.4 (C-6‟),

129.7 (C-4‟), 128.5 (C-5‟), 128.4 (C2,6-phenyl) , 128.3 (C3,5-phenyl), 127.1, 124.3

(C-9), 122.3 (C4-phenyl), 117.3 (C-2‟), 74.2 (C-11), 69.6 (C-19), 53.9 (C-5), 48.8

(C-13), 47.0 (C-6), 41.8 (C-3), 40.9 (C-20), 40.7 (C-12), 37.4 (C-17), 37.0 (C-14),

34.6 (C-21), 31.4 (CH3-Ac), 20.8 (C-16), 20.1 (C-15), 17.5 (C-3), 16.1 (C-23), 15.8

(C-22).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 9.11 (s, 1H, H-4‟), 8.42 (s, 1H, H-9),

Hợp chất 99, chất lỏng không màu

8.04 (s, 1H, H-2‟), 7.26-7.18 (m, 5H, H-phenyl), 5.42 (dd, J = 10 Hz, 4 Hz, 1H, H-

11), 5.08-5.04 (m, 1H, H-1”), 4.66-4.59 (m, 2H, H-5, 19), 4.38 (m, 1H, H-13), 3.16

(s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.88-2.84 (m, 1H, H-6), 2.66 (s, 3H, H-5‟),

2.62-2.59 (m, 1H, H-2), 2.44-2.39 (m, 1H, H-20), 2.33-2.32 (t, J = 7 Hz, 1H, H-14),

2.14-2.08 (m, 1H, H2”), 2.03-1.99 (m, 2H, H-4), 1.91-1.85 (m, 2H, H-21), 1.73-

1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (br, 1H, H-5”), 1.36-1.30 (m, 1H, H-8”), 1.19-1.17 (d, J =

7,5 Hz, 3H, H-3), 1.08 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23). 1.05 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 0.97

(t, J = 7 Hz, 3H, H-16), 0.90 (d, J = 7 Hz, 3H, H7”), 0.85 (d, J = 7 Hz, 3H, H-9”),

0.80 (d, J = 7 Hz, 3H, H-10”), 0.68 (d, J = 7 Hz. 3H, H-22).

Hợp chất 100, chất lỏng không màu.

27 -2.82 (c 0.11, MeOD); HRMS-ESI: [M+H]+ 861.4950 (Tính cho C47H69N6O7S: 861.4948). 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.11 (s, 1H, H-4‟), 8.60 (s, 1H, H-9), 8.10 (s, 1H, H-2‟), 7.28-7.26 (m, 4H, H-phenyl), 7.21-7.18 (m,

[α]D

1H, H4-phenyl), 5.78 (dd, J = 11 Hz, 3 Hz, 1H, H-11), 5.06 (t, J = 7 Hz, 1H, H-1”),

4.63 (td, J = 11 Hz, 4.5 Hz, 1H, H-19), 4.50 (brs, 1H, H-5), 4.41-4.36 (m, 1H, H-

13), 3.4-3.2 (m, 1H), 3.16 (s, 3H, H-17), 2.98-2.94 (m, 1H, H-6), 2.88-2.84 (m, 1H,

H-6), 2.66 (s, 3H, H-5‟), 2.62-2.59 (m, 1H, H-20), 2.44-2.39 (m, 1H, H-2), 2.33-

2.32 (m, 1H, H-14), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.14-2.08 (m, 1H, H-2”), 2.03-1.99 (m, 2H,

H-12), 1.91-1.85 (m, 2H, H-4), 1.73-1.65 (m, 4H, H-21, 6”), 1.39-1.38 (brd, 1H, H-

5”), 1.36-1.30 (m, 1H, H-8”), 1.19 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-3), 1.08 (d, 3H). 1.05 (d, J

= 7.0 Hz, 3H), 0.98-0.96 (t, 2H), 0,95 (t, J = 7 Hz, 2H), 0.90 (d, J = 6.5 Hz, 3H),

0,85 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-7”), 0,78 (d, J = 7 Hz, 3H, H-9”), 0,75 (d, J = 6.5 Hz,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 177.5 (C-1), 174.6 (C-18), 171.7 (C- 10), 171.5 (CO-Ac), 164.8 (C-24), 162.7 (C-7), 159.1 (C-3‟), 150.9 (C-2‟), 144.6

3H, H-10”).

(C-8), 143.6 (C-4‟), 142.8 (C-1‟), 139.4 (C1-phenyl), 130.5 (C-9), 129.3 (C3,5-

phenyl), 127.4 (C2,6-phenyl), 125.1 (C4-phenyl), 75.6 (C-11), 71.1 (C-1”), 55.4 (C-

19), 50.6 (C-13), 49.5 (C-5), 49.3 (C-2”), 42.5 (C-6), 41.8 (C-6”), 38.8 (C-4), 38.3

(C-20), 38.2 (C-12), 35.5 (C-17), 35.4 (C-2), 32.6 (C-14), 31.0 (C-5”), 27.3 (CH3-

Ac), 25.1 (C-3”,4”), 24.3 (C-8”), 22.4 (C-21), 21.6 (C-9”), 21.1 (C-10”), 20.8 (C-

7”), 20.4 (C-5‟), 19.9 (C-16), 18.5 (C-15), 16.6 (C-3), 16.4 (C-23), 11.4 (C-22).

Hợp chất 101, chất lỏng màu vàng nhạt

27 -10.69 (c 0.13, MeOD); MS-ESI [M+H]+: 892.5 (Tính cho C50H78N5O7S: 892.5622). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.00 (s, 1H, H-9), 7.22-7.20 (m, 4H, H-phenyl); 7.14 (d, J = 9 Hz 1H, H4-phenyl), 5.83 (br, 1H, H-

[α]D

7‟), 5.69 (d, 1H, H-11). 5.32 (br, 2H, H-8‟), 5.12 (br, 1H, H-1‟‟), 4.72 (br, 1H, H-

19), 4.67-4.62 (m, 1H, H-1‟), 4.40-4.34 (br q, 1H, H-5), 3.14-3.08 (m, 1H, H-13),

3.02 (s, 3H, H-17), 2.98-2.93 (m, 2H, H-6), 2.91-2.88 (m, 2H, H-5‟), 2.58 (m, 1H,

H-2), 2.31 (m, 2H, H-6‟), 2.16 (s, 3H, OAc), 2.03-1.99 (m, 2H, H-12), 1.91-1.85

(m, 2H, H-20, 2”), 1.73-1.65 (m, 4H), 1.39-1.38 (brd, 1H, H-14), 1.27 (t, J = 7 Hz,

6H), 1.18 (d, J = 7.5 Hz; 3H), 1.11-1.13 (m, 2H), 1,02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-10”),

0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-9”), 0.92-0.90 (m, 6H, H-14,16), 0.90 (d, 3H, H-7”),

0.86 (d, J = 7 Hz, 3H, H-3), 0.82 (t, 3H, H-23), 0.71 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

* Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin từ tripeptide 89.

Các phản ứng tổng hợp tetrapeptide từ tripeptide 89 đƣợc thực hiện trong

điều kiện tƣơng tự nhƣ phản ứng tổng hợp từ tripeptide 90, với tác nhân ghép nối

HATU trong dung môi DMF, phản ứng ở nhiệt độ phòng trong khoảng 12-14 h.

Quy trình phản ứng tổng hợp tetrapeptide 102, 105, 106

Muối trifluoroacetic của 89 (1 eq) trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq DIPEA,

và 1,1 eq các hợp chất axit (5-methyl pyrazine-2 carbocylic acid/N-

methylpipecolinic acid/N-allylpipecolinic acid) đƣợc thêm vào tiếp sau, hỗn hợp

đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng và chất HATU (1,2 eq) tiếp tục đƣợc thêm

vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản

ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4,

cất loại dung môi và tinh chế trên cột sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 1/1) thu

đƣợc các hợp chất 102, 105, 106 với hiệu suất từ 55-65%.

Quy trình phản ứng thủy phân tetrapeptide 102, 106

Các hợp chất ester 102, 106 trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1), đƣợc

thêm vào 10eq LiOH. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 16h. Kết

thúc phản ứng, dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm

nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4, và chiết với EtOAc, dịch chiết

đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Cất loại hết dung môi và tinh chế sản phẩm thô trên

cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH) thu đƣợc sản phẩm sạch 103, 107 với hiệu suất

từ 70-80%.

2.2.9.3. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu

C-terminal

27 +28.00 (c 0.12, MeOD); HRMS-ESI [M+H]+: 754.4220 (Tính cho

Hợp chất 102, chất lỏng không màu

[α]D

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.14 (s, 1H, H-9), 7.30-7.19 (m, 5H,

C40H60N5O7S: 754.4213).

H-phenyl), 6.77 (d, J = 9 Hz, H-4), 5.75 (dd, J = 11 Hz, 3 Hz, 1H, H-11), 5.13 (q, J

= 7 Hz, 1H, H-5), 4.78 (d, J = 7 Hz, 1H, H-19), 4.43 (m, 1H, H-13), 4.24 (q, J = 7.5

Hz, 1H, H-1‟), 4.21-4.16 (m, 2H, H-1‟‟), 3.14-3.11 (m, 2H, H-5‟), 3.07 (s, 3H, H-

17), 2.97-2.94 (dd, J = 11 Hz, 2.5 Hz, 2H, H-6), 2.61 (dd, J = 11 Hz, 3.5 Hz, 1H),

2.40 (td, J = 2.5 Hz, 11 Hz, 1H), 2.34 (m, 1H, H-20), 2.21 (s, 3H, H-6‟), 2.19 (s,

3H, OAc), 2.14-2.07 (m, 2H, H-12), 1.88 (m, 1H, H-14), 1.71 (s, 3H, H-3), 1.78-

1.75 (m, 3H, H-2‟‟), 1.68-1.63 (m, 2H, H-21), 1.31-1.16 (t, J = 7 Hz, 6H, H-

2‟,3‟,4‟), 1.05 (d, J = 7 Hz, 3H, H-16), 1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-15), 0.94 (d, J =

7.5 Hz, 3H, H-23), 0.84 (d, J =6.5 Hz, 3H, H-22).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm 175.1 (C-18), 173.2 (C-10), 171.9 (C-

24), 171.7 (CO-Ac), 169.2 (C-1), 162.4 (C-7), 150.6 (C-8), 140.9 (C-3), 140.8 (C-

4), 138.6 (C1-phenyl), 130.4 (C-9), 129.4 (C-2), 127.7 (C3,5-phenyl), 125.6 (C2,6-

phenyl), 125.4 (C4-phenyl), 71.2 (C-11), 70.5 (C-1‟), 69.1 (C-1”), 61.9 (C-19), 56.6

(C-13), 54.8 (C-5‟), 50.7 (C-5), 44.8 (C-6‟), 41.5 (C-20), 40.4 (C-17), 38.7 (C-12),

37.7 (C-14), 35.5 (C-21), 31.6 (C-2‟), 30.1 (C-4‟), 26.1 (C-3‟), 25.5 (CH3-Ac),

20.8 (C-15), 20.3 (C-16), 16.3 (C-2”), 14.5 (C-3), 12.8 (C-23), 11.1 (C-22).

Hợp chất 103, chất rắn màu trắng

27 +1.91 (c 0.09, MeOD); HRMS-ESI: [M+H]+ 684.3773 (Tính cho C36H54N5O6S: 684.3795), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.07 (d, J = 11 Hz, 1H, H-9), 7.27 -7.19 (m, 5H, H-phenyl), 6.61 (brs,1H, H-4), 5.13 (br, 1H, H-11),

[α]D

4.7-4.68 (m, 3H, H-1‟, H-5, H-19), 3.21-3.20 (m, 2H, H-5‟), 3.18 (s, 3H, H-17),

3.16-3.12 (m, 1H, H-6), 2.96-2.94 (dd, J = 7.5 Hz, 3.5 Hz, 1H, H-6), 2.37 (s, 3H, H-

6‟), 2.11-1.94 (br, 2H, H-12), 1.88 (m, 1H, H-14), 1.76 (s, 3H, H-3), 1.51-1.43 (m,

3H), 1.31-1.16 (br s, 3H), 1.14 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23), 1.09-0.99 (overlap, 6H, H-

15,16), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

* Tổng hợp dẫn xuất 104

Ester 88 (250 mg, 0.45 mmol) trong 6 mL hỗn hợp dung môi THF/H2O

(2/1), đƣợc thêm vào LiOH (108 mg, 4.5 mmol). Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ

phòng trong 14h. Kết thúc phản ứng, cất loại dung môi, phần rắn đƣợc thêm nƣớc,

HCl 5% đến pH ≈ 4 và chiết với EtOAc, dịch chiết rửa với NaHCO3 và làm khan

bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi nhận đƣợc sản phẩm acid trung gian (189.7 mg),

hiệu suất phản ứng đạt 85%. Sản phẩm acid trung gian ở trên (160 mg, 0.32 mmol)

trong DMF (3 mL) đƣợc thêm vào 4-(2-aminoethyl)benzensulfonamide (65.3 mg,

0.32 mmol) và DIPEA (1 mL), hỗn hợp đƣợc khuấy 15 phút ở nhiệt độ phòng.

HATU (144.4 mg, 0.38 mmol) đƣợc thêm tiếp vào. Phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt

độ phòng trong 14h. Kết thúc phản ứng, thêm nƣớc rửa ba lần và chiết với EtOAc,

dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cô đuổi dung môi dƣới áp suất giảm, sản

phẩm thô đƣợc tinh chế trên sắc ký cột silica gel (DCM/MeOH, 15/1), nhận đƣợc

dẫn xuất 104 (111.4 mg, 47 %), là chất lỏng màu vàng nhạt.

27 +3.65 (c 0.13, MeOD); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 8.15 (s, 1H, H-3), 7.85-7.83 (m, 2H, H-5”, H-7‟‟), 7.47 (dd, J= 3.5 Hz, 8.5 Hz, 2H, H-4”, H-

[α]D

8”), 5.83 (dd, J = 3.5 Hz, 11 Hz, 1H, H-5), 4.47-4.42 (m, 1H, H-13), 3.69 (t, 3H,

H1‟, H1”), 3.04 (t, 3H, H-7, H-2”), 2.91 (s, 3H, H-11), 2.76-2.75 (d, 1H, H-5‟),

2.39-2.34 (m, 1H, H-5‟), 2.27-2.21 (m, 1H, H-14), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H,

H-6‟), 1.85-1.80 (m, 1H, H-8), 1.40 (t, 2H, H-15), 1.34 (br t, 6H), 1.08-1.02 (m, 3

H, H-10), 0.99- (d, J = 7 Hz, 3 H, H-9), 0.92 (t, 3H, H-17), 0.87 (d, J = 6.5 Hz, 3H,

H-16).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 174.5 (C-12), 171.9 (C-4), 171.7

(CO-OAc), 163.2 (C-18), 161.5 (C-1), 150.8 (C-2), 145.2 (C-6”), 143.1 (C-3”),

130.5 (C-5‟,7”), 127.3 (C-4”,8”), 125.2 (C-3), 75.5 (C-5), 70.6 (C-1‟), 61.7 (C- 13),

57,4 (C-7), 54,9 (C-5‟), 41.4 (C- 6‟, C-1”), 36.3 (C-14), 35.6 (C-C-2”), 31.0 (C-11),

30.7 (C- 6), 29.6 (C-8), 21.9 (C-15, C-2‟), 20.9, 20.3, 20.1, 18.7 (C-9,10) 14.6 (C-

17), 11.5 (C-16)

2.2.9.4. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu

N- và C-terminal

Hợp chất 105, chất lỏng màu vàng nhạt.

27 -6.71 (c 0.14, MeOD); HRMS-ESI: [M+H]+ 749.3714 (Tính cho C39H53N6O7S: 749.3696), 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm: 9.23 (s, 1H, H-4‟), 8.37 (s, 1H, H-2‟), 8.28 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H, H-9), 7.30-7.22 (m, 5H, H-

[α]D

phenyl), 6.67 (d, J = 9.5 Hz, H-4), 5.69 (dd, J = 11.0, 3.0 Hz, 1H, H-11), 5.18 (qui,

J = 7 Hz, 1H, H-5), 5.04 (dd, J = 9.5, 6.5 Hz, 1H, H-19), 4.55 (t, J = 7 Hz, 1H),

4.21-4.16 (m, 2H, H-1‟‟), 3.12 (overlap, 1H), 3.08 (s, 3H, H-17), 2.96 (dd, J = 11.0,

3.5 Hz, 1H, H-6), 2.60 (s, 3H, H-5‟), 2.34 (td, J = 9.5, 2.5 Hz, 1H, H-20), 2.18 (s,

3H, OAc), 2.08-2.04 (m, 2H, H-12), 1.98-1.95 (m, 1H, H-14), 1.76 (s, 3H, H-3),

1.78-1.75 (m, 3H, H-2‟‟), 1.68-1.63 (m, 2H, H-21), 1,05 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15),

1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16), 0.94 (d, J = 7.5 Hz, 3H, H-23), 0,78 (d, J = 6.5 Hz,

3H, H-22).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm: 172.9 (C-18), 170.1 (C-10), 167.7

(CO-OAc), 165.7 (C-1), 163.0 (C-24), 160.0 (C-7), 157.1 (C-3‟), 149.7 (C-2‟),

143.2 (C-8), 142.6 (C-1‟), 138.9 (C-4‟), 136.6 (C1-phenyl), 130.5 (C-4), 129.6

(C3,5-phenyl), 128.5 (C2,6-phenyl), 126.8 (C-9), 123.7 (C4-phenyl), 69.4 (C-11),

68.7 (C-19), 60.8 (C-1”, C-13), 53.8 (C-5), 48.7 (C-6), 40.9 (C-20), 37.5 (C-12),

34.5 (C-17), 30.0 (CH3-Ac), 29.5 (C-14), 24.0 (C-5‟), 21.8 (C-21), 20.8 (C-15),

20.1 (C-16), 19.5 (C-23), 16.2 (C-2”), 14.2 (C-3), 12.7 (C-22).

Hợp chất 106, chất lỏng không màu

27 -5.95 (c 0.15, MeOD); HRMS-ESI: [M+H]+ 784.3753 (Tính cho C43H54N5O7S: 784.3744), 1H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 9.72 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-3‟), 8.50 (d, J = 5.5 Hz, 1H, H-5‟), 8.04 (s, 1H, H-9), 7.86-7.84 (d, J = 8 Hz,

[α]D

1H, H-8‟), 7.81 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 6.5 Hz, 1H, H-2‟), 7.65 (t, J = 6.5 Hz,

1H, H-6‟), 7.30-7.28 (m, 5H), 6.66 (dd, J = 9,5, 2.0 Hz, H-4), 5.70 (dd, J = 11.0,

2.5 Hz, 1H, H-11), 5.15 (qui, J = 7 Hz, 1H, H-5), 5.04 (dd, J = 9.5, 6.5 Hz, 1H, H-

19), 4.58 (t, J = 7 Hz, 1H, H-13), 4.16 (q, J = 7 Hz, 2H, H-1‟‟), 3.10 (t, J = 7 Hz,

1H), 3.08 (s, 3H, H-17), 2.96 (dd, J = 7.5, 10 Hz, 2H, H-6), 2.34 (td, J = 9.5, 3.5

Hz, 1H, H-20), 2.18 (s, 3H, OAc), 2.18-2.04 (m, 2H, H-12), 2.08-2.04 (m, 1H, H-

14), 1.76 (s, 3H, H-3), 1.78-1.75 (m, 3H, H-2‟‟), 1.68-1.63 (m, 2H, H-21), 1.05 (d, J

= 7 Hz, 3H, H-15), 1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-16), 0.95 (t, J = 7.5 Hz, 3H, H-23),

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ ppm: 173.3 (C-18), 170.2 (C-10), 170.1 (CO-OAc), 167.8 (C-1), 165.4 (C-24), 160.0 (C-7), 149.7 (C-1‟), 147.8 (C-9‟),

0.82 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-22).

140.2 (C-8), 139.0 (C-3‟), 137.5 (C1-phenyl), 136.6 (C-4), 130.5 (C-7‟), 130.4 (C-

8‟), 129.6 (C-6‟), 128.6 (C3,5-phenyl), 128.5 (C2,6-phenyl, C-5‟), 127.6, 127.0 (C-

2), 126.9 (C-4‟), 126.8 (C4-phenyl), 124.3 (C-9), 123.7 (C-2‟), 69.5 (C-11), 60.8

(C-19), 60.3 (C-1”,C-13), 54.0 (C-5), 48.7 (C-6), 40.9 (C-20), 37.4 (C-12), 34.6 (C-

17), 30.6 (CH3-Ac), 30.0 (C-14), 21.8 (C-21), 20.8 (C-15), 20.1 (C-16), 19.5 (C-

23), 16.2 (C-2”), 14.2 (C-3), 12.7 (C-22).

Hợp chất 107, chất rắn màu trắng

27 -19.13 (c 0.09, MeOD); HRMS-ESI: [M+Na]+ 736.3125 (Tính cho C39H47N5O6SNa: 736.3145). 1H- NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 9.04 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-3‟), 8.52 (d, J = 5.5 Hz, 1H, H-5‟), 8.05 (s, 1H, H-9), 7.99 (d, J = 8.5

[α]D

Hz, 1H, H-8‟), 7.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-2‟), 7.80 (t, J = 7.5 Hz, 1H, H-7‟), 7.66 (t,

J = 7.5 Hz, J = 8Hz, 1H, H-6‟), 7.28 (m, 2H, H-phenyl), 7.17 (t, 1H), 7.08-7.04 (m,

2H, H-phenyl), 6.53 (d, J = 9,5 Hz, H-4), 5.08 (d, J = 8 Hz, 1H, H-11), 4.71-4.66

(overlap, 1H, H-5), 4.62-5.59 (d, 1H, H-19), 4.16 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.08-3.06 (m,

1H, H-13), 2.95 (s, 3H, H-17), 2.66-2.64 (m, 1H, H-6), 2.52-2.49 (m, 1H, H-6),

2.40 (m, 1H, H-20), 2.31-2.25 (m, 2H, H-12), 2.08-2.04 (m, 1H, H-14), 1.73 (s, 3H,

H-3), 1.59-1.55 (m, 2H, H-21), 1.12 (d, J = 7 Hz, 3H, H-15), 1.04 (d, J = 6.5 Hz,

3H, H-16), 0.94 (d, J = 7 Hz, 3H, H-23), 0.88 (d, J = 7 Hz, 3H, H-22).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ ppm: 173.6 (C-18), 170.2 (C-10), 167.8 (C-1), 165.4 (C-24), 161.0 (C-7), 149.7 (C-1‟), 148.8 (C-9‟), 141.2 (C-8), 139.5 (C-

3‟), 138.5 (C1-phenyl), 136.6 (C-4), 131.5 (C-7‟), 130.4 (C-8‟), 129.6 (C-6‟), 128.6

(C3,5-phenyl), 128.5 (C2,6-phenyl, C-5‟), 127.6, 127.2 (C-2), 126.9 (C-4‟), 126.8

(C4-phenyl), 124.5 (C-9), 123.7 (C-2‟), 69.2 (C-11), 60.8 (C-19), 60.3 (C-1”,C-13),

54.0 (C-5), 48.7 (C-6), 40.9 (C-20), 37.4 (C-12), 34.6 (C-17), 30.0 (C-14), 21.3 (C-

21), 20.4 (C-15), 20.1 (C-16), 19.5 (C-23), 15.9 (C-2”), 14.8 (C-3), 12.2 (C-22).

Quy trình tổng hợp các dẫn xuất tubulysin từ tripeptide 91, 92

Các muối trifluoroacetic của 91 và 92 trong DMF đƣợc thêm vào 10 eq

DIPEA và 1.1 eq chất 5-methyl pyrazine-2 carboxylic acid. Hỗn hợp đƣợc khuấy 15

phút và chất HATU (1.2 eq) đƣợc thêm tiếp vào. Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt

độ phòng trong khoảng 14h. Kết thúc phản ứng, thêm EtOAc và rửa 3 lần bằng

nƣớc, dịch EtOAc đƣợc làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi và tinh chế trên

cột sắc ký silica gel (n-Hexan/EtOAc; 1/1) thu đƣợc các sản phẩm 108, 110 với hiệu

suất từ 60- 62%.

Hợp chất 108, chất lỏng không màu

27 -10.67 (c 0.10, MeOD); HRMS-ESI: [M+H]+ 695.3237 (Tính cho C35H47N6O7S: 695.3227). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 9.21 (s, 1H, H-4‟), 8.46 (s, 1H, H-2‟), 8.21 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H, H-6), 7.30-7.27 (m, 3H, H-

[α]D

phenyl), 7.18 (t, J = 7 Hz, 2H, H-phenyl), 5.66 (dd, J = 11.0 , 2.5 Hz, 1H,-H-8),

5.06-4.99 (m, 2H, H-2, H-16), 4.49 (br, 1H, H-10), 3.73 (s, 3H, MeO-), 3.24-3.22 (t,

J = 4 Hz, 3H, H-3, H-17), 3.05 (s, 3H, H-14), 2.67 (s, 3H, H-5‟), 2.35-2.29 (td, J =

9.5, 2.5 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.09-2.06 (m, 2H, H-9), 1.96-1.94 (m, 1H, H-

11), 1.79-1.77 (m, 1H), 1.67-1.62 (m, 2H, H-18), 1.03 (d, J = 7 Hz, 3H, H-12), 0.97

(d, J = 7 Hz, 3H, H-13), 0.91 (t, J = 7 Hz, 3H, H-20), 0.76 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 178.7 (C-15), 173.2 (C-1), 173.0 (C- 7), 171.7 (CO-OAc), 170.1 (C-21), 160.3 (C-4), 158,6 (C-5), 149.2 (C-3‟), 142.9

(C-2‟), 142.5 (C-4‟), 135.9 (C-1‟), 129.3 (C3,5-phenyl), 128.5 (C2,6-phenyl), 127.1

(C-6), 124.1 (C4-phenyl), 69.5 (C-8), 53.9 (C-16), 53.1 (C-2), 52.3 (C-10, MeO),

38.1 (C-3), 37.4 (C-17), 34.3 (C-14), 29.9 (CH3-Ac), 24.0 (C-11), 21.4 (C-18), 20.7

(C-5‟), 20.1 (C-13), 19.5 (C-12), 16.1 (C-20), 11.1 (C-19).

Ester 108 (50 mg, 0.07 mmol) trong hỗn hợp dung môi THF/H2O =2/1 (2

mL), đƣợc thêm vào LiOH ( 17.5 mg, 0.73 mmol). Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở

nhiệt độ phòng trong 12h. Kết thúc phản ứng, dung môi đƣợc quay cất dƣới áp suất

giảm. Cặn thu đƣợc đƣợc thêm nƣớc và axit hóa với dung dịch HCl 5% đến pH  4,

và chiết với EtOAc, dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sản phẩm thô đƣợc

tinh chế qua cột sắc ký silica gel (DCM/MeOH, 20/1) thu đƣợc sản phẩm 109 (39.7

mg ), hiệu suất phản ứng đạt 85%.

Hợp chất 109, chất rắn màu trắng

27 -12.05 (c 0.12, MeOD); MS(ESI): [M+Na]+: 661.2770 (Tính cho C32H42N6O6SNa: 661.2784). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ ppm: 9.08 (s, 1H, H- 4‟), 8.59 (s, 1H, H-2‟), 8.07 (s, 1H, H-6), 7.24-7.22 (m, 5H, H-phenyl), 5.03 (d, J =

[α]D

7.5 Hz, 1H, H-8), 4.66 (dd, J = 2 Hz, 9.5 Hz, 2H, H-2, H-16), 3.30-3.29 (m, 1H, H-

10), 3.23-3.20 (m, 2H, H-3), 3.15 (s, 3H, H-14), 2.65 (s, 3H, H-5‟), 2.24 (m, 1H, H-

17), 2.09-1.98 (m, 2H, H-9), 1.96-1.94 (m, 1H, H-11), 1.71-1.64 (m, 1H), 1.31-1.37

(m, 2H, H-18), 1.08 (d, J = 7 Hz, 3H, H-12), 0.97 (d, J = 7 Hz, 3H, H-13), 0.94 (t, J

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm: 176.5 (C-15), 173.1 (C-1), 171.2 (C-7), 170.4 (C-21), 160.6 (C-4), 158,2 (C-5), 149.2 (C-3‟), 143.4 (C-2‟), 142.7 (C-4‟),

= 7 Hz, 3H, H-20), 0.80 (d, J = 6.5 Hz, 3H, H-19).

135.9 (C-1‟), 129.6 (C3,5-phenyl), 128.8 (C2,6-phenyl), 127.1 (C-6), 124.1 (C4-

phenyl), 69.5 (C-8), 53.9 (C-16), 53.1 (C-2), 52.3 (C-10, MeO), 38.1 (C-3), 37.4 (C-

17), 34.3 (C-14), 24.1 (C-11), 21.4 (C-18), 20.3 (C-5‟), 20.1 (C-13), 19.6 (C-12),

15.7 (C-20), 12.2 (C-19).

Hợp chất 110, chất lỏng không màu

27 -5.82 (c 0.10, MeOD); MS(ESI): [M+Na]+: 675.2906 (Tính cho C33H44N6O6SNa 675.2941), 1H- NMR (500 MHz, CDCl3), δ ppm: 9.21 (s, 1H, H- 4‟), 8.42 (s, 1H, H-2‟), 8.06 (s, 1H, H-6); 7.29-7.21 (m, 4H, H-phenyl), 7.18 (t, 1

[α]D

H), 5.08 (d, J = 8 Hz, 1H, H-8), 5.01- 4.98 (m, 1H, H-2), 4.59 (dd, 1H, H-16), 3.73

(s, 3H, MeO), 3.24 (t, 3H, H-3, H-10), 3.12 (s, 3H, H-14), 2.66 (s, 3H, H-5‟), 2.10-

2.03 (m, 2H, H-11, H-17), 1.87-1.85 (m, 2H, H-9), 1.79-1.77 (m, 1H), 1.67-1.62 (m,

2H, H-18), 1.03 (t, 3H, H-12), 0.97 (d, J = 7 Hz, 3H, H-13), 0.93 (d, J = 7 Hz, 3H,

H-20), 0.82 (d, J = 7 Hz, 3H, H-19).

2.2.10. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tương tự tubulysin

Các sản phẩm tetrapeptide tổng hợp đƣợc đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc tế

bào ung thƣ trên các dòng tế bào ung thƣ gồm: tế bào ung thƣ vú- MCF7 (Human

breast carcinoma), tế bào ung thƣ phổi ở ngƣời-A549 (human lung

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời- HT29 (human colorectal

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ bạch cầu cấp ở ngƣời- HL60 (human acute

leukemia), tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời- SW480 (human colon carcinoma). Kết

quả hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thể hiện trên bảng 3.1

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐỊNH HƢỚNG TỔNG HỢP TUBULYSIN VÀ DẪN XUẤT

Các tubulysin chứa 4 nhóm amino acid khác nhau bao gồm N-methyl-D-

pipecolinic acid (Mep), isoleucine (Ile), tubuvaline (Tuv) [sự lai hóa của cặp amino

acid Valine và Cystein] và tubuphenylalanine (Tup) hoặc tubutyrosin (Tut) [sự kéo

dài mạch của phenylalanine hoặc tyrosin]. Ngoài ra, sự có mặt của nhóm N,O-acetal

tại liên kết amide với Tuv. Trong các amino acid này, chỉ có nhóm isoleucine (Ile)

là amino acid thiết yếu, ba nhóm amino acid Mep, Tuv và Tup là những amino acid

rất ít gặp trong tự nhiên. Trong đó, đặc biệt Tuv và Tup là các chất có chứa các

trung tâm bất đối trong phân tử. Riêng nhóm Tuv còn chứa thêm vòng thiazole. Do

đó, nghiên cứu tổng hợp Tuv và Tup yêu cầu qua nhiều bƣớc phản ứng và gặp

nhiều khó khăn trong việc tổng hợp dẫn xuất tubulysin. Vì vậy, các nghiên cứu

nhằm đơn giản hóa các dẫn xuất tubulysin mà vẫn duy trì hoạt tính ở nồng độ gây

độc tế bào tốt đang đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu triển khai thực hiện.

Dựa trên những nghiên cứu tƣơng quan hoạt tính-cấu trúc của tubulysin

(Hình 1.17) cho thấy, nhóm tubuvaline (Tuv) giữ vai trò quan trọng trong việc duy

trì hoạt tính gây đôc tế bào cao của lớp chất tubulysin, đặc biệt là vòng thiazole

trong nhóm Tuv. Các thay thế của nhóm N-methyl-D-pipecolinic acid (Mep) ở đầu

N-terminal của tubulysin; hay sự thay thế của nhóm Tup ở đầu C-terminal của

tubulysin vẫn thu đƣợc dẫn xuất có tác dụng gây độc tế bào với IC50 ở nồng độ

nanomolar. Đặc biệt, nhóm N,O-acetal rất không bền trong môi trƣờng có tính kiểm

hoặc axit, dễ dàng bị thủy phân bởi các enzyme. Những thay thế của nhóm N,O-

acetal bằng các nhóm alkyl: methyl, ethyl, benzyl có thể làm bền hóa liên kết

amide, cũng có thể giữ đƣợc nồng độ gây độc tế bào ở phạm vi nanomolar. Từ các

phân tích này, đề tài nghiên cứu tập trung thay thế nhóm Mep bằng các acid dị vòng

thơm. Nhóm N,O-acetal đƣợc thay thế bởi nhóm methyl; và vai trò của nhóm Tup ở

C-terminal đƣợc khảo sát với các nhóm phenyl có mạch nối dài, hoặc nhóm phenyl.

Để tổng hợp đƣợc các dẫn xuất tubulysin đề ra, các nhóm Tuv và Tup sẽ

đƣợc tổng hợp. Từ các sản phẩm thu đƣợc, sự gắn mạch peptide có thể đƣợc thực

hiện từ đầu C-terminal hoặc đầu N-terminal của mạch tetrapeptide, nhƣ trình bày

trong sơ đồ 3.1.

Sơ đồ 3.1. Định hƣớng tổng hợp tubulysin và các dẫn xuất

3.2. TỔNG HỢP TUBUPHENYLALANINE

Quy trình tổng hợp tubuphenylalanine acid (Tup) đã đƣợc nhiều nhóm

nghiên cứu thực hiện bằng các hƣớng tổng hợp khác nhau. Trong đó tổng hợp Tup

theo các công bố của Muller và Zanda [41,58,59] thu đƣợc hiệu suất và độ chọn lọc

lập thể cao nhất. Theo đó, quy trình tổng hợp bao gồm các bƣớc phản ứng dễ dàng

thực hiện với các tác nhân đơn giản, ở các điều kiện thƣờng. Trên cơ sở đó quy

trình tổng hơp Tup đƣợc tiến hành theo Muller và Zanda. Tuy nhiên, trong quá trình

tổng hợp Tup, một số điều kiện phản ứng trung gian đã đƣợc đơn giản hóa để thu

đƣợc các sản phẩm đạt đƣợc hiệu suất cao và có thể sử dụng trực tiếp cho các bƣớc

phản ứng tiếp theo mà không cần tinh chế trên cột sắc ký silica gel.

Các phản ứng tổng hơp tubuphenylalanine acid (Tup) 47a đƣợc bắt đầu từ L-

phenylalanine methyl ester hydrochloride (68), thông qua quy trình 7 bƣớc phản

ứng nhƣ đƣợc mô tả trong sơ đồ 3.2 và sơ đồ 3.4. Đầu tiên nhóm amino của chất 68

đƣợc bảo vệ bằng nhóm tert-butoxycarbonyl qua phản ứng với Boc2O trong dung

môi THF và NaHCO3 ở nhiệt độ phòng trong 16 h thu đƣợc sản phẩm 45 (94%). Sự

chuyển hóa ester 45 thành aldehyde 52 đƣợc tiến hành qua hai bƣớc phản ứng liên

tục, bằng phản ứng khử hóa với NaBH4 trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng

trong thời gian 20 h thu đƣợc hợp chất trung gian N-Boc-phenylalaninol (45a) mà

không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel, với hiệu suất 96%. Sự chuyển hóa

nhóm hydroxyl về aldehyde đƣợc tiến hành với tác nhân oxy hóa DMP (Dess–

Martin Periodinane) dƣới điều kiện hồi lƣu trong các dung môi DCM, EtOAc hoặc

dung môi DMSO ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa với tác nhân DMP

đều không có sự chuyển hóa hoàn toàn thành aldehyde, sản phẩm 52 thu đƣợc đạt

hiệu suất khoảng 74%. Bằng cách sử dụng tác nhân oxi hóa IBX (2-iodoxybenzoic

acid) trong dung môi DCM hoặc EtOAc dƣới điều kiện đun hồi lƣu [72-75], sản

phẩm aldehyde 52 đã thu đƣợc hiệu suất cao hơn. Kết quả cho thấy phản ứng sử

dụng IBX và đun hồi lƣu trong EtOAc cho hiệu suất cao nhất (97%) và sản phẩm có

thể dùng trực tiếp cho phản ứng bƣớc tiếp theo mà không cần tinh chế qua cột sắc

ký silica gel.

Sơ đồ 3.2. Tổng hợp ester 42

Từ sản phẩm aldehyde 52, alkene 42 dễ dàng thu đƣợc qua phản ứng ngƣng

tụ theo Horner-Wadsworth-Emmons giữa hợp chất 52 với

triethyl-2-phosphonopropionate và NaH ở nhiệt độ từ 0-25 oC trong thời gian 14h (0 oC 5 phút, nhiệt độ thƣờng 14h). Phản ứng tạo sản phẩm ester α,β không no 42

(75%) với cầu hình E ƣu tiên (tỷ lệ % đồng phân E/Z  77/23.) Cấu hình E của sản phẩm 42 đƣợc xác định dựa trên phân tích dữ liệu của phổ 1H-NMR và phổ hai

chiều NOESY, kết hợp so sánh với các phổ của chất đã đƣợc công bố.

Trên phổ 1H-NMR của chất 42 (Hình 3.1) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng của các proton. Trong đó nhóm tín hiệu của vòng phenyl ở 7.30-7.16 ppm,

tín hiệu doublet đặc trƣng của nhóm E-olefin (H-4, 1H) cộng hƣởng tại 6.51 ppm

với J = 9.0 Hz. Tín hiệu cộng hƣởng tại 4.64-4.59 ppm đƣợc gán cho 2 protton H-5.

Tín hiệu cộng hƣởng quartet tại 4.19-4.15 ppm là tín hiệu đặc trƣng của 2 proton

methylene nhóm ethyl ester (2H, J = 7 Hz, H-1‟) Tín hiệu singlet tại 1.70 ppm là tín

hiệu cộng hƣởng của nhóm methyl gắn với carbon không no (3H), tại 1.40 ppm là

tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của nhóm bảo vệ Boc (9H). Cấu hình E của olefin 42

phù hợp với các kết quả đã đƣợc công bố trƣớc đó [41,55,58,59]. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR chất 42 thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của 19 nguyên tử carbon.

Sơ đồ 3.3. Cơ chế tạo thành chất 42

Cơ chế hình thành hợp chất 42 đƣợc đề xuất qua sơ đồ 3.3. Triethyl-2-

phosphonopropionate dƣới tác dụng của NaH đƣợc chuyển hóa thành carbanion. Sự

có mặt của tác nhân electronphile (52) sẽ cộng hợp vào carbanion tạo thành hợp

chất trung gian oxaphosphetane IIa và IIb, trong đó IIa chiếm ƣu thế hơn. Sự mở

vòng của oxaphosphetane tạo thành các sản phẩm ester không no 42.

H-Boc

H-2”

H-Phenyl

H-1”

H-3

H-5

H-4

Hình 3.1. Phổ 1H-NMR hợp chất 42

Từ hợp chất 42, khi tiến hành phản ứng hydro hóa trực tiếp đã thu đƣợc hỗn

hợp đồng phân 42a/42b (với tỷ lệ 42a/42b: 50/50). Tuy nhiên, bằng các phƣơng

pháp sắc ký cột đã không thể phân lập đƣợc sản phẩm 42a.

Do sự khó khăn trong việc phân lập 42a ra khỏi hỗn hợp đồng phân 42a/42b,

ester không no 42 đƣợc chuyển thành acid 69 và đƣợc tạo ester với menthol để tạo

thành các đồng phân lập thể không đối quang để từ đó có thể tách đƣợc sản phẩm

mong muốn bằng phƣơng pháp sắc ký cột thông thƣờng (Sơ đồ 3.4). Do đó, ester 42

đƣợc xử lý với dung dịch 5% LiOH trong dung môi THF/H2O ở nhiệt độ phòng

trong thời gian 20h. Sau phản ứng, dung môi đƣợc cất loại và đƣợc axit hóa với 5%

HCl. Kết tủa trắng tạo thành đƣợc lọc và sấy thu đƣợc sản phẩm acid 69 với hiệu

suất 90%.

Phổ 1H-NMR chất 69 có các tín hiệu tƣơng tự phổ chất 42. Sự khác biệt là đã

không có các tín hiệu của nhóm ethoxy, đã mất tín hiệu quartet tại 4.17 ppm của

nhóm methyleneoxy ester (-CH2-OCO) và tín hiệu triplet tại 1.27 ppm của nhóm

methyl.

Sơ đồ 3.4. Phản ứng tổng hợp Tup 47a

Menthyl ester 46 đƣợc tạo thành qua phản ứng Steglich giữa 69 và menthol

trong dung môi DCM với tác nhân dehydrate hóa DCC (dicyclohexylcarbodiimide)

và xúc tác của DMAP (4-dimethylaminopyridine). Phản ứng đƣợc thực hiện ở điều

kiện nhiệt độ phòng, sản phẩm sạch đƣợc tinh chế trên cột sắc ký silica gel đạt hiệu

suất 83%.

Sản phẩm 46 đƣợc xác định nhờ các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR. Phổ 1H-NMR của chất 46 có các tín hiệu cộng

hƣởng tƣơng tự chất 69, ngoài ra xuất hiện các tín hiệu mới của nhóm menthyl tại

1,1 ppm (9H) và các tín hiệu ở 1.2-1.6 ppm của các nhóm methylene. Olefin 46

đƣợc hydro hóa ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp dung môi EtOAc/MeOH (1/1) trong

thời gian 48h. Sau khi tinh chế trên cột sắc ký silica gel (n-hexane/Et2O; 85/15) thu

đƣợc sản phẩm mong muốn 47a, với tỷ lệ 2 đồng phân lập thể 47a/47b = 4.5/1. Cấu

trúc của hợp chất 47a đƣợc khẳng định thông qua phân tích các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp so sánh phổ đã đƣợc công bố.

Phổ 1H-NMR chất 47a (Hình 3.2) xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng,

theo đó tại vùng trƣờng thấp là các tín hiệu cộng hƣởng của proton vòng phenyl ở

7.29-7.15 ppm (5H). Tín hiệu multiplet tại 4.69-4.63 ppm đƣợc gán cho proton H-

1‟, proton H-4 cộng hƣởng tai 3.87 ppm (br, 1H). Tín hiệu proton H-5 cộng hƣởng

doublet-doublet tại 2.78-2.74 ppm, tín hiệu cộng hƣởng tại 2.55 ppm (br, 1H) đƣợc

gán cho proton H-2, tín hiệu douplet tại 1.15 ppm (J = 7 Hz) đƣợc gán cho nhóm

methyl liên kết với C-2 (CH3-C2). Từ dữ liệu phổ của 47a tổng hợp đƣợc, so sánh

với dữ liệu phổ của chất đã đƣợc công bố trong các tài liệu [50,58,59,76] cho phép

H-phenyl

(a)

H-3

H-5

H-2‟

H-1‟ H-4

H-2

(b)

chúng tôi xác định hợp chất 47a tổng hợp đƣợc có cấu hình S tại C-2.

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR hợp chất 47a: a) Phổ sản phẩm đã công bố [50]; (b). Phổ sản phẩm đƣợc tổng hợp

Nhƣ vậy, bằng các phƣơng pháp hóa học chúng tôi đã tổng hợp thành công

ɤ- amino acid tubuphenylalanin (Tup), đây là một trong 2 amino acid quan trọng

trong cấu trúc tubulysin. So sánh với các tài liệu công bố, quy trình tổng hợp Tup

amino acid đã đƣợc tối ƣu hóa hơn về quy trình tổng hợp nhƣ điều kiện phản ứng và

hiệu suất các bƣớc phản ứng đã đƣợc cải thiện rõ rệt.

3.3. TỔNG HỢP TUBUVALINE

Nhóm amino acid tubuvaline (Tuv) chứa 2 trung tâm bất đối trong phân tử ở

các vị trí 1 và 3. Ngoài ra, sự có mặt của vòng thiazole trong phân tử gây ra nhiều

khó khăn cho việc tổng hợp Tuv đạt hiệu quả cao. Dựa trên các các tài liệu đã đƣợc

công bố, quy trình tổng hợp Tuv đƣợc định hƣớng nhƣ trình bày trong sơ đồ 3.5.

Theo định hƣớng phản ứng này, hợp chất trung gian quan trọng nhất ketone 74 theo

sơ đồ phản ứng đƣợc thực hiện qua phản ứng gắn mạch carbon-carbon giữa hợp

chất thiazole 14 và Weinreb amide 73 trong môi trƣờng kiềm mạnh nBuLi ở điều kiện nhiệt độ -78 oC. Weinreb amide 73 đƣợc tổng hợp từ Boc-Val-OH thông qua

phản ứng Arndt-Eistert, và hợp chất 2-bromothiazole 14 đƣợc tổng hợp từ thiourea

qua các bƣớc phản ứng Hantzsch và Sandmeyer. Từ ketone 74, qua các bƣớc phản

ứng khử hóa, acetyl hóa với Ac2O/TEA, loại bỏ nhóm bảo vệ TBS, oxi hóa nhóm

hydroxyl về carboxylic đã thu đƣợc hợp chất 79.

Sơ đồ 3.5. Sơ đồ tổng hợp ngƣợc Tuv 79

3.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14)

Để tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14)

chúng tôi lựa chọn thiourea làm tác nhân ban đầu theo phản ứng Hantzsch [77].

Phản ứng đƣợc tiến hành giữa thiourea với ethyl bromopyruvate dƣới điều kiện hồi

lƣu 4h trong dung môi ethanol thu đƣợc hợp chất thiazole 70 ở dạng tinh thể sau khi

xử lý phản ứng, với hiệu suất 75% (Sơ đồ 3.6).

Sơ đồ 3.6. Tổng hợp dẫn xuất thiazole 14

Sản phẩm 70 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 70 (Hình 3.3) xuất hiện ba vùng cộng hƣởng, tại 8.12 ppm

là tín hiệu cộng hƣởng của proton vòng thiazole, tín hiệu của hai proton nhóm

methylene trên ethyl ester cộng hƣởng quartet tại 4.45-4.40 ppm, tín hiệu nhóm

methyl cộng hƣởng triplet tại 1.42-1.39 ppm.

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR hợp chất 70

Cơ chế tạo thành sản phẩm 70 đƣợc mô tả nhƣ sơ đồ 3.7. Đầu tiên

carbocation từ ethyl bromopyruvate tấn công vào trung tâm anion tại liên kết C=S

của thioure tạo thành dẫn xuất imine trung gian. Quá trình đóng vòng thiazole đƣợc

diễn ra sau đó qua nhiều bƣớc trung gian với vai trò nhƣ là tác nhân nucleophile của anion Br-.

Sơ đồ 3.7. Cơ chế tạo thành chất 70 [77]

Sự chuyển hóa nhóm amino của 70 thành 2-bromothiazole 71 thông qua và phản ứng Sandmeyer [78,79], bằng cách xử lý với các tác nhân NaNO2, CuSO4 KBr trong môi trƣờng 30% H2SO4 ở 0 oC trong 1h; sau đó đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng và khuấy thêm 15 h. Kết tủa màu vàng đƣợc lọc và sấy khô thu đƣợc sản phẩm 71 với hiệu suất 70%. Cấu trúc 71 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ 1H-

NMR.

Từ sản phẩm ester 71 thu đƣợc, khi tiến hành cộng hợp với trực tiếp hợp chất

Weinreb amide73 trong môi trƣờng nBuLi đã không thu đƣợc sản phẩm 74a mong

muốn (Sơ đồ 3.8).

Sơ đồ 3.8. Phản ứng gắn mạch giữa Weinred amide và 2-bromothiazole

Do đó, ester 71 đã đƣợc khử hóa thành hợp chất hydroxyl trung gian và đƣợc

bảo vệ với TBSCl tạo thành dẫn chất 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)

methyl)thiazole 14.

Phản ứng khử hóa ethyl ester 71 thành hợp chất hydroxyl đƣợc thực hiện với

NaBH4 trong MeOH; hoặc NaBH4 và CaCl2 trong hỗn hợp dung môi EtOH/THF

(với tỷ lệ 2/1) trong 16 h ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, sử dụng tác nhân

NaBH4 trong hỗn hợp dung môi EtOH/THF và CaCl2 cho sản phẩm (2-

bromothiazol-4-yl)methanol (72) đạt hiệu suất cao nhất (95%) [80,81].

Phổ 1H-NMR chất 72 đã mất đi tín hiệu cộng hƣởng tại 1.42 ppm của ba

proton trên gốc ethyl ester, hai proton trên (-CH2-OH) cộng hƣởng ở vùng trƣờng

thấp hơn tại 4.66 ppm.

Từ sản phẩm 72 thu đƣợc, sự bảo vệ của nhóm hydroxyl với TBSCl có mặt

xúc tác imidazole/DMAP trong dung môi DCM ở nhiệt độ phòng [82-84] đã nhận

đƣơc sản phẩm 14 với hiệu suất 97%.

Hình 3.4. Phổ 1H-NMR hợp chất 14

Cấu trúc của hợp chất 14 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ 1H-NMR. Trên phổ 1H-NMR hợp chất 14 (Hình 3.4) có các tín hiệu công hƣởng tƣơng tự phổ chất

72, ngoài ra phổ chất 14 xuất hiện thêm các tín hiệu tại 0.82 ppm (9H) là tín hiệu

cộng hƣởng của nhóm tert-butyl và tín hiệu tại 0.0 ppm (6H) là tín hiệu của hai

nhóm methyl.

3.3.2. Tổng hợp N-methyltubuvaline-OMe (79)

Nhƣ định hƣớng trình bày trên sơ đồ 3.1, phản ứng tổng hợp Tuv là sự gắn

mạch giữa Weinreb amide 73 và dẫn xuất của 2-bromothiazole 14 [52]. Để tổng

hợp Weinreb amide 73, L-valine amino acid đƣợc sử dụng làm nguyên liệu đầu (Sơ

đồ 3.9). Hợp chất tert-butoxycarbonyl-L-valine đƣợc chèn thêm một nhóm

methylene thông qua phản ứng Arndt-Eistert. N-Boc-Val-OH trƣớc hết đƣợc phản

ứng với ethyl chloroformate trong THF ở 0oC trong 1h, sau đó xử lý với diazomethane trong ether. Hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 0oC trong 3h và ở nhiệt độ

phòng 12h thu đƣợc sản phẩm diazoketone 21.

Phản ứng của diazoketone với N,O-dimethylhydroxylamine trong THF và

TEA với xúc tác C6H5COOAg tạo thành sản phẩm Weinreb amide 22a, với tổng

hiệu suất đạt 54 %.

Sơ đồ 3.9. Tổng hợp Weinreb amide 73

Cơ chế phản ứng chuyển hóa N-Boc-Val-OH thành hợp chất 22a đƣợc mô tả

nhƣ trong sơ đồ 3.10 [85]. Đầu tiên chất N-Boc-Val-OH dƣới tác dụng của ethyl

chloroformate tạo thành dẫn xuất acid anhydride trung gian. Hợp chất anhydride

này tiếp tục cộng hợp với diazomethane để tạo ra sản phẩm bền α-diazoketone (21).

Sản phẩm diazoketone 21 dƣới tác dụng của ion bạc (I) đã chuyển thành hợp chất

ketene 21a và đƣợc cộng hợp với nucleophile N,O-dimethylhydroxylamine để

chuyển thành Weinreb amide 22a sau giai đoạn tautomer hóa.

Sơ đồ 3.10. Cơ chế tạo thành hợp Weinreb amide 22a

Cấu trúc 22a đƣợc khẳng định thông qua phân tích phổ 1H-NMR. Trên phổ 1H-NMR hợp chất 22a (Hình 3.5) thể hiện đầy đủ các tín hiệu proton. Tín hiệu

singlet tại 3.69 ppm đặc trƣng cho proton methoxy (CH3O, 3H), tín hiệu singlet

cộng hƣởng tại 3.21 ppm đƣợc gán cho nhóm methyl liên kết với N (CH3-N, 3H),

tín hiệu của nhóm bảo vệ Boc đặc trƣng tại 1.42 ppm. Hai nhóm methyl trên mạch

H-Boc

H-3, H-8

H-5,6

H-7

H-3 H-4

H-2

nhánh của valine công hƣởng tại 0.93-0.90 ppm (6H)

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR Weinreb amide 22a

Phản ứng N-methyl hóa của chất 22a đƣợc xử lý với NaH và MeI trong 24 h thu đƣợc 73 với hiệu suất đạt 90% [79,86]. Trên phổ 1H-NMR chất 73 có các tín hiệu tƣơng tự phổ 1H- NMR của chất 22a, ngoài ra xuất hiện thêm tín hiệu singlet

của nhóm methyl tại 3.19 ppm chứng tỏ nhóm Boc-N đƣợc gắn thêm nhóm methyl

tạo thành sản phẩm mong muốn 73.

Phản ứng gắn mạch carbon-carbon giữa Weinreb amide 73 và dẫn xuất 2-

bromothiazole 14 tạo thành sản phẩm 74 (Sơ đồ 3.11) là phản ứng quan trọng nhất

trong quy trình tổng hợp dẫn xuất tubuvaline. Phản ứng đƣợc tiến hành dƣới các

điều kiện yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ cũng nhƣ độ khan. Phản ứng gắn mạch

ban đầu đƣợc khảo sát theo các điều kiện của phản ứng Grignard, sử dụng Mg hoạt

hóa trong dung môi ether hoặc THF ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau.

Tuy nhiên, các thay đổi về điều kiện phản ứng, sự thay đổi về tỷ lệ giữa các tác

nhân tham gia đều không thu đƣợc sản phẩm 74 mong muốn.

Do đó, các điều kiện dùng trong phản ứng gắn mạch đƣợc thay đổi, bằng

khảo sát với tác nhân nBuLi. Hợp chất thiazole 14 trƣớc hết đƣợc xử lý với nBuLi ở -78 oC trong 1h, sau đó Weinreb amide 73 đƣợc thêm nhỏ giọt dần vào. Phản ứng

đƣợc khuấy ở -78 oC thêm 1h sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng 12 h. Ketone 74 thu

đƣợc ở dạng chất lỏng màu vàng nhạt đạt hiệu suất 55%.

Sơ đồ 3.11. Phản ứng tổng hợp ketone 74

Sản phẩm 74 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR. Phổ 1H-NMR chất 74 (Hình 3.6) xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng của các proton. Tín hiệu tại 7.53 ppm đƣợc gán cho tín hiệu cộng hƣởng

proton H-3‟của vòng thiazole, tín hiệu nhóm methyl liên kết với nitơ trên Tuv (H-7)

tại 2.99 ppm (3H), tín hiệu của nhóm bảo vệ Boc tại 1.46 ppm, tín hiệu nhóm bảo

H-tBu

H-Boc

H-7

H-4‟

H-3

H-3‟

vệ TBS tƣơng ứng tại 1,00 ppm (9H) và 0,0 ppm (6H).

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR hợp chất 74

Cơ chế tạo thành sản phẩm 74 đƣợc mô tả ngắn gọn qua sơ đồ 3.12 [87,88].

Hợp chất 14 dƣới tác dụng của nBuLi đã loại bỏ nguyên tử brom và đƣợc thế bằng

nguyên tử lithium tạo ra sản phẩm trung gian nhƣ là tác nhân nucleophile mạnh.

Với sự có mặt của Weinreb amide 73 (tác nhân electronphile), đã cộng hợp tạo ra

liên tiếp các phức hoạt động, cuối cùng nhận đƣợc dẫn xuất thiazole 74.

Sơ đồ 3.12. Cơ chế tạo thành hợp chất 74

Phản ứng khử hóa ketone 74 thành hợp chất hydroxyl 15a đƣợc khảo sát với

các tác nhân khử khác nhau nhƣ: sử dụng NaBH4 trong hỗn hợp dung môi

MeOH/THF; lọc tác nhân LiAlH4 trong THF hoặc tác nhân khử chọn

BH3.Me2S/CBS [53,54]. Kết quả cho thấy, sử dụng tác nhân LiAlH4 trong THF có

mặt 10% mol CoCl2 thu đƣợc các sản phẩm đồng phân lập thể (R,S) tại nhóm OH

của vị trí carbon α với tỷ lệ 1,5:1, với tác nhân NaBH4 tỷ lệ sản phẩm 2 đồng phân

lập thể là 1:1, trong khi đó sử dụng 1 đƣơng lƣợng BH3.Me2S và 10% mol xúc tác

(S)-(−)-2-methyl-CBS-oxazaborolidine (CBS: Corey–Bakshi–Shibata) trong dung

môi THF thu đƣợc chất 15a với độ chọn lọc lập thể lên đến 85% và hiệu suất

chuyển hóa đạt 90% (Sơ đồ 3.13) [53,54,58,59].

Phổ 1H-NMR chất 15a (Hình 3.7b) có các vùng tín hiệu cộng hƣởng tƣơng

Sơ đồ 3.13. Phản ứng tổng hợp Tuv 15a

tự phổ chất 74, ngoài ra xuất hiện tín hiệu mới tại 4.93 ppm, tín hiệu này đƣợc quy cho proton tại vị trí C-1 (CH-OH; 1H). Phổ chất 1H-NMR 15a cho thấy các vùng tín

hiệu cộng hƣởng trùng khớp với phổ chất đã công bố [49] (Hình 3.7a). Từ dữ liệu

phổ 1H-NMR, 13C-NMR, giá trị độ quay cực của chất 15a tổng hợp đƣợc, đồng thời

so sánh với các kết quả đã đƣợc công bố trong các tài liệu [49,50,76], cho phép

(a)

H-7

H-4‟

H-3‟

H-1

(b)

H-3

H-2

chúng tôi xác định cấu hình R tại C-1 của alcohol 15a

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR hợp chất 15a: (a) Phổ sản phẩm đã công bố [49];

(b). Phổ sản phẩm tổng hợp đƣợc

Hydroxyl 15a đƣợc bảo vệ với nhóm acetyl bằng phản ứng với acetic

anhydride trong TEA và xúc tác DMAP ở nhiệt độ phòng sau 14 h thu đƣợc sản

phẩm 75 với hiệu suất 95% (Sơ đồ 3.14). Các dung môi dùng cho phản ứng acetyl

hóa nhƣ dichlomethan, acetonitrile hay tetrahydrofuran đƣợc sử dụng. Kết quả cho

thấy, phản ứng với dung môi DCM sản phẩm 75 thu đƣợc sạch, không cần tinh chế trên cột sắc ký silica gel và đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng tiếp theo. Phổ 1H- NMR chất 75 có các tín hiệu tƣơng tự phổ 1H-NMR chất 15a và xuất hiện mới tín

hiệu singlet tại 2.19 ppm, tín hiệu này đƣợc quy cho proton của nhóm acetyl (OAc),

tín hiệu proton H-1 dịch chuyển về phía trƣờng thấp ở 5.93 ppm, kết quả này có thể

do nhóm OAc làm giảm mật độ điện tích trên do đó làm giảm vùng cộng hƣởng của

proton H-1.

Tiếp theo, nhóm bảo vệ tert-butyl-dimethylsilan (TBS) đƣợc loại bỏ bằng

phản ứng với tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) trong dung môi

dichloromethane tạo thành hydroxyl 76. Phản ứng chuyển hóa 76 thành acid 78

đƣợc tiến hành bằng xử lý ban đầu với NaOCl sau đó đƣợc thực hiện dƣới các điều

kiện của phản ứng Pinnick, sử dụng tác nhân NaOCl2/NaH2PO4 [52,54,89] trong

dung môi DCM. Tuy nhiên, sản phẩm thu đƣợc đạt hiệu suất thấp và phải tinh chế

sản phẩm trên cột sắc ký silica gel. Bằng cách thay đổi các điều kiện của phản ứng

oxi hóa, hydroxyl 76 đƣợc đun hồi lƣu với tác nhân IBX trong dung môi ethyl

acetate tạo thành aldehyde 77, sau đó 77 đƣợc xử lý với oxone trong dung môi

DMF ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 12 h [90-92]. Sản phẩm acid 78 thu

đƣợc đạt hiệu suất 95% mà không cần tinh chế trên cột silica gel.

Sơ đồ 3.14. Phản ứng tổng hợp chất 79

Sản phẩm acid 78 đƣợc khẳng định nhờ các phƣơng pháp phổ 1H-NMR, 13C- NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 78 (Hình 3.8) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng proton. Tại vùng trƣờng thấp ở 8.09 ppm là tín hiệu cộng hƣởng của proton

vòng thiazole (H-3), tín hiệu proton H-5 tại 5.99-5.89 ppm. Tín hiệu singlet của

nhóm methyl liên kết với nitơ xuất hiện tại 2.74 ppm (CH3-N, 3H), các proton nhóm

bảo vệ Boc cộng hƣởng tại 1.44 ppm, và hai nhóm methyl trên valine (H9, H10)

cộng hƣởng tại 0.96-0.88 ppm.

Ngoài ra trên phổ 13C-NMR thể hiện đầy đủ các tín hiệu của 18 nguyên tử

carbon trong đó 3 tín hiệu của carbon nhóm carbonyl và ba tín hiệu của carbon vòng

thiazole xuất hiện ở vùng trƣờng thấp. Sản phẩm axit 78 tổng hợp đƣợc có phổ

tƣơng đồng với phổ chất đã đƣợc công bố trƣớc đó [50,76].

Boc

OAc

H-11

H-9,10

H-3

H-8

H-5

H-7

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR hợp chất 78

Phản ứng ester hóa 78 ban đầu đƣợc xử lý với thionyl chloride trong

methanol khan. Tuy nhiên sản phẩm tạo thành với hiệu suất rất thấp. Sản phẩm ester

thu đƣợc (83) ngoài việc đã loại bỏ nhóm bảo vệ Boc, nhóm acetyl (Ac) đồng thời

H-9,10

H-11

H-3

OMe

H-8

H-7

H-5

H-6

cũng đã bị thủy phân trong điều kiện phản ứng trên.

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR hợp chất 83

Do đó, hợp chất 78 đƣợc xử lý với diazomethane trong dung môi diethyl ether ở 0 oC trong thời gian 3 h và giữ thêm ở nhiệt độ phòng 12 h thu đƣợc methyl

ester 79 với hiệu suất 96%.

Nhƣ vậy, hai ɤ amino acid tubuvaline và tubuphenylalanine đã đƣợc tổng

hợp thành công. Đây là 2 amino acid quan trọng nhất trong quy trình tổng hợp

tubulysin và dẫn xuất. Các sản phẩm amino acid thu đƣợc sẽ đƣợc tiến hành ghép

mạch amide với các amino acid khác để tạo ra các dẫn xuất tubulysin khác nhau.

3.4. LOẠI BỎ NHÓM BẢO VỆ BOC CỦA TUV VÀ TUP

Các phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc đối với các amino acid đƣợc tiến

hành bằng cách xử lý với trifluoroacetic acid (TFA) để tạo thành sản phẩm muối với

TFA hoặc đƣợc trung hòa với kiềm để thu đƣợc sản phẩm là amine tự do

[50,54,76]. Quá trình loại bỏ nhóm bảo vệ Boc bằng TFA sẽ giải phóng ra cation

tert-butyl, cation này có thể có ảnh hƣởng đến một số nhóm chức trong phân tử

peptide vì vậy tác nhân triisopropylsilane (TIPS) đƣợc thêm vào nhằm loại bỏ

cation này [93].

Các sản phẩm 79, 47a, 42 đƣợc xử lý với lƣợng dƣ TFA trong dung môi

DCM với sự có mặt của triisopropylsilane (TIPS) và nƣớc theo tỷ lệ thể tích TFA/TIPS/H2O = 95/2,5/2,5. Phản ứng thực hiện ở 0oC trong 2h, nhận đƣợc các

Sơ đồ 3.15. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của hợp chất 42, 47a, 79

muối trifluoroacetic 80, 81, 82 với hiệu suất cao (95%)

Các sản phẩm của muối 80, 81, 82 đƣợc khẳng định bằng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Trên phổ 1H-NMR chất 81 (Hình 3.10) có các tính

hiệu cộng hƣởng tƣơng tự chất 47a, nhƣng mất tín đi hiệu cộng hƣởng tại 1.4 ppm

H-phenyl

H-1‟

H-4

của nhóm bảo vệ Boc

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR hợp chất 81

3.5. TỔNG HƠP DIPEPTIDE

Từ các sản phẩm Tuv và Tup cũng nhƣ các dẫn xuất trung gian của chúng đã

đƣợc tổng hợp, phƣơng hƣớng tổng hợp toàn phần các dẫn xuất của tubulysin đƣợc

thực hiện qua từng bƣớc gắn mạch amide để tạo thành các dipeptide, tripeptide và

tubulysin [50,52,54,66,76]. Từ đánh giá tƣơng quan hoạt tính - cấu trúc và định

hƣớng nghiên cứu của luận án, dipeptide Ile-Tuv (isoleucine-tubuvaline) có vai trò

quan trọng nhất, do đó đƣợc giữ nguyên trong việc thay đổi cấu trúc tubulysin nhằm

tìm kiếm cấu trúc mới. Phƣơng pháp tổng hợp đƣợc bắt đầu bằng phản ứng gắn

mạch giữa dẫn xuất Tuv (78) và amine 81 (Tup-menthyl) sử dụng tác nhân HBTU

thu đƣợc sản phẩm dipeptide 81a với hiệu suất 73% (Sơ đồ 3.16). Tuy nhiên, phản

ứng loại bỏ nhóm Boc của 81a, sau đó phản ứng tiếp với Boc-Ile-OH hoặc Fmoc-

Ile-OH đã không thu đƣợc sản phẩm tripeptide 90 mong muốn.

Những thay đổi về sử dụng các nhân phản ứng cũng nhƣ điều kiện nhiệt độ,

đều không thu đƣợc sản phẩm tripeptide. Điều này có thể do sự ngăn cản không

gian của mạch nhánh isobutyl, sự cồng kềnh của nhóm Tup đầu C, đặc biệt là sự

methyl hóa của các amino acid bậc 2, dẫn tới phản ứng amide hóa giữa 81a và Ile-

OH không thể xảy ra.

Do sự khó khăn theo hƣớng tổng hợp từ đầu C (C-terminal), phản ứng tạo

Sơ đồ 3.16. Phản ứng tổng hợp tripeptide từ dipeptide 78

dipeptide Tuv-Tup, rồi phản ứng với nhóm isoleucine, dẫn xuất Tuv 79 đƣợc loại

bỏ nhóm Boc thành muối 80 và phản ứng amide hóa với Boc-Ile-OH.

Phản ứng tổng hợp dipeptide đƣợc khảo sát với các tác nhân HATU, HBTU,

PyBOP, BOPCl [54,94,95]. Kết quả cho thấy sử dụng HATU với dung môi DMF

và diisopropylethylamine, phản ứng tạo thành 84 cho hiệu suất cao nhất so với các

tác nhân khác (Sơ đồ 3.17).

Sơ đồ 3.17. Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86

Sản phẩm 84 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C. Trên phổ 1H-NMR chất 84 (Hình 3.11) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

Boc

OAc

OMe

H-3

H-11

H-13 H-7

H-14 H-8

H-5

hƣởng.

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR hợp chất 84

Tín hiệu đặc trƣng của các proton vòng thiazole ở 8.13 ppm (H-3), tín hiệu

triplet của H-5 ở 5.76 ppm, tín hiệu cộng hƣởng tại 3.94 ppm đặc trƣng cho ba

proton methoxy (OMe, 3H), tín hiệu singlet proton CH3-N (trên Tuv) ở 2.98 ppm,

tín hiệu singlet proton của nhóm acetyl ở 2.19 ppm (OAc). Tín hiệu singlet cƣờng

độ mạnh của nhóm bảo vệ Boc ở 1.44 ppm, các tín hiệu doublet của các nhóm

methyl trên mạch nhánh của isoleucine và valine.

Ester 84 tạo thành đƣợc loại bỏ nhóm methyl thu đƣợc acid 85 bằng phản

ứng với LiOH 5% trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1) ở nhiệt độ phòng trong

12h [27]. Trong quá trình này nhóm bảo vệ acetyl cũng dễ dàng bị thủy phân và sản

phẩm 85 thu đƣợc với hiệu suất 90%. Sản phẩm 85 đƣợc khẳng định qua phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C. Phổ 1H-NMR chất 85 (Hình 3.12) có các tín hiệu cộng

hƣởng tƣơng tự phổ chất 84, ngoài ra phổ chất 85 đã mất tín hiệu singlet cộng

hƣởng tại tại 3.73 ppm là tín hiệu đặc trƣng của ba proton methoxy (OMe, 3H), và

Boc

H-11

H-3

H-5

H-13 H-7

mất tín hiệu singlet tại 2.19 ppm tín hiệu đặc trƣng proton nhóm acetyl (OAc).

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR hợp chất 85

Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR của hợp chất 85 có đầy đủ các các tín hiệu

tƣơng tự nhƣ của hợp chất 84 nhƣng mất đi tín hiệu cộng hƣởng của 2 nguyên tử

carbon của nhóm acetyl và nguyên tử carbon của nhóm methoxy.

Để tránh tạo thành sản phẩm phụ cho các phản ứng tiếp theo, nhóm hydroxyl

trong sản phẩm 85 đƣợc acetyl hóa với acetic anhydride trong dung môi DCM và

bazơ TEA và xúc tác DMAP thu đƣợc sản phẩm acetyl hóa 86.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của chất 86 có các tín hiệu cộng hƣởng

tƣơng tự phổ chất 85, ngoài ra trên phổ chất 86 xuất hiện thêm tín hiệu cộng hƣởng

singlet tại 2.19 ppm của 3 proton nhóm acetyl (OAc).

3.6. TỔNG HỢP TRIPEPTIDE

Nhằm đa dạng hóa cấu trúc để tìm kiếm các tubulysin mới có hoạt tính sinh

học lý thú, chúng tôi tiến thành tổng hợp 5 tripeptide có cấu trúc khác nhau bằng

cách thay đổi các amino acid đầu C

3.6.1. Tổng hợp tripeptide 88

Dipeptide 84 đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ bằng phản bằng TFA trong sự có

mặt của TIPS/H2O thu đƣợc muối trifluoroacetic. Phản ứng giữa muối

trifluoroacetic với N-methyl-D-pipecolinic acid (Mep) trong dung môi DMF, dƣới

tác dụng của tác nhân ghép mạch HATU (1.2 eq) và DIPEA (10 eq) ở nhiệt độ

phòng trong 14h (Sơ đồ 3.18), thu đƣợc sản phẩm 88 với hiệu suất đạt 55% sau khi

tinh chế trên cột silica gel.

Sơ đồ 3.18. Phản ứng tổng hợp tripeptide 88

Sản phẩm 88 đƣợc khẳng định nhờ các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR hợp chất 88 (Hình 3.13) có các tín

hiệu cộng hƣởng tƣơng tự phổ chất 84, ngoài ra xuất hiện thêm các tín hiệu singlet

tại 2.25 ppm là tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của ba proton gắn với nguyên tử nitơ

trên vòng pipecolinic và các tín hiệu ở vùng trƣờng cao 1.83-1.55 ppm đặc trƣng

của các nhóm methylene no trên pipecolinic.

Phổ 13C-NMR thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của 27 nguyên tử

OMe

OAc

H-11

H-3

H-6‟

H-7 H-5‟

H-1‟

H-5

H-13

cacbon với các vùng công hƣởng đặc trƣng của cacbon nhóm chức amide, ester

Hình 3.13. Phổ 1H-NMR hợp chất 88

3.6.2. Tổng hợp tripeptide 89

Với mục đích nhằm đánh giá rõ thêm vai trò của nhóm Tup, olefin 42 đƣợc

sử dụng thay thế cho nhóm Tup. Do đó, theo hƣớng tổng hợp các tripeptide từ đầu

C, hợp chất 89 đƣợc tổng hợp bằng phản ứng acyl hóa giữa dipeptide 86 với hợp

chất 82 (1 eq) trong dung môi DMF, dƣới tác dụng của tác nhân HATU (1.2 eq) và

DIPEA (Sơ đồ 3.19).

Sau 14 h khuấy ở nhiệt độ phòng, sản phẩm sạch thu đƣợc bằng cách tinh

chế trên cột sắc ký silica gel nhận đƣợc chất 89 với hiệu suất 60%.

Sơ đồ 3.19. Phản ứng tổng hợp tripeptide 89

Sản phẩm 89 đƣợc khẳng định bằng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân nhƣ 1H-, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 89 (Hình 3.14) ở vùng trƣờng

thấp thể hiện tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của proton vòng thiazole ở 8.05 ppm

singlet (1H, H-9), các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của proton vòng phenyl ở 7.29

-7.21 ppm (5H). Tín hiệu doublet đặc trƣng của proton E-olefin (H-4) cộng hƣởng

tại 6.67 ppm, J = 9 Hz. Tín hiệu doublet-doublet đặc trƣng tại 5.65-5.63 ppm của

proton H-11 (1H). Tín hiệu multiplet tại 5,06 ppm đƣợc gán cho proton H-19 (1H)

và H-5 (1H), tín hiệu tại 4.46 ppm đƣợc gán cho proton H-13

Tín hiệu singlet của CH3-N tại 3.01 ppm (3H, H-17). Tín hiệu singlet cộng

hƣởng singlet tại 2.16 ppm của 3 proton nhóm acetyl (OAc). Tín hiệu multiplet tại

4.22-4.15 ppm của proton methylene ester (2H, H-1‟). Tín hiệu cộng hƣởng singlet

của ba proton tại 1.78 ppm đặc trƣng của nhóm methyl liên kết với E-olefin (3H, H-

3). Tín hiệu singlet tại 1.41 ppm của nhóm bảo vệ Boc (9H). Nhóm các tín hiệu

douplet từ 1.04-0.84 ppm của 4 nhóm methyl trên isoleucin và valin.

Ngoài ra trên phổ 13C- NMR thể hiện tín hiệu cộng hƣởng của 38 nguyên tử

carbon, với các vùng cộng hƣởng đặc trƣng của nhóm carbonyl amide, vòng

thiazole và vòng phenyl.

Boc

OAc

H-2

H-phenyl

H-17 H-6

H-9

H-1‟

H-19 H-5

H-4

H-13

H-11

Hình 3.14. Phổ 1H-NMR hợp chất 89

Tripeptide 89 sau đó đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ Boc, phản ứng đƣợc thực

hiện trong dung môi DCM dƣới tác dụng của lƣợng dƣ TFA trong sự có mặt của TIPS và nƣớc, ở nhiệt độ 0 oC trong 2 giờ, thu đƣợc muối dạng trifluoroacetic 89a

3.6.3. Tổng hợp tripeptide 90, 90b

Để tổng hợp các dẫn xuất mà sự thay thế của nhóm Mep ở N-terminal của

tetrapeptide bằng các acid khác, các tripeptide 90 và 90b đƣợc tổng hợp từ phản

ứng ngƣng tụ giữa các hợp chất 85/86 với hợp chất 81 trong dung môi DMF, dƣới

tác dụng của HATU và DIPEA ở nhiệt độ phòng trong 14 h (Sơ đồ 3.20). Sản phẩm

tripeptide 90, 90b thu đƣợc với hiệu suất phản ứng đạt 60-63%.

Sơ đồ 3.20. Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b

Sản phẩm 90, 90b đƣợc khẳng định qua phân tích các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H, 13C. Phổ 1H-NMR chất 90 (Hình 3.15) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng. Ở vùng trƣờng thấp là các tín hiệu đặc trƣng của vòng thiazole ở 8.01 ppm

singlet (1H, H-9), các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của proton vòng phenyl ở 7.29

-7.21 ppm.

Ở vùng trƣờng cao, phổ chất 90 không xuất hiện tín hiệu doublet của proton

E-olefin tại 6.67 ppm và tín hiệu multiplet tại 4.22-4.15 ppm của proton nhóm

methylene ester nhƣ phổ chất 89, thay vào đó phổ chất 90 xuất hiện tín hiệu quartet

tại 5.01 ppm đƣợc gán cho một proton liên kết ester trên vòng menthyl (H-1‟), các

tín hiệu multiplet của các nhóm methylene no của nhóm menthyl tại 1.2-1.6 ppm và

các tín hiệu nhóm methyl no tại 0.9-1.0 ppm. Phổ chất 90b tƣơng tự phổ chất 90, ngoài ra trên phổ 1H -NMR chất 90b không có tín hiệu singlet đặc trƣng của ba

Boc

OAc

H-17 H-6 H-20

H-phenyl

H-9

H-19,5,13

H-11 H-1‟

proton nhóm aceyl (OAc) tại 2.19 ppm

Hình 3.15. Phổ 1H-NMR hợp chất 90

Ngoài ra phổ 13C-NMR chất 90 (Hình 3.16) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng của 46 nguyên tử carbon. Trong đó, các vùng cộng hƣởng đặc trƣng của 2

C-phenyl

CO-OAc C-1

C-1‟

C-5

CO-Boc

C-9

C-11

C-19

C6-phenyl

C-18 C-10

C-7 C-8

carbon nhóm ester, 3 carbon nhóm amide, carbon dị vòng thiazole và vòng phenyl.

Hình 3.16. Phổ 13C-NMR hợp chất 90

Tripeptide 90, 90b đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ Boc trong dung môi DCM với

lƣợng dƣ TFA có mặt TIPS và nƣớc thu đƣợc muối trifluoroacetic tƣơng ứng là tác

nhân cho phản ứng tổng hợp dẫn xuất tubulysin.

3.6.4. Tổng hợp các tripeptide 91, 92

Tƣơng tự, từ dipeptide 85 và 86 các tripeptide 91 và 92 đã đƣợc tổng hợp

bằng phản ứng với phenylalanine methyl ester hydrochloride trong dung môi DMF,

ở nhiệt độ phòng trong thời gian 14h (Sơ đồ 3.21). Các sản phẩm đƣợc tinh chế trên

cột sắc ký silica gel (n-Hexan/EtOAc; 1/1) thu đƣợc sản phẩm sạch tƣơng ứng 91 và

92 với hiệu suất 62- 64%.

Sơ đồ 3.21. Phản ứng tổng hợp các tripeptide 91, 92

Các sản phẩm 91, 92 đƣợc khẳng định nhờ các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hiện đại nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 91 (Hình

3.17) ở vùng trƣờng thấp thể hiện tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của singlet proton

vòng thiazole ở 8.05 ppm (1H, H-5), các tín hiệu cộng hƣởng của proton vòng

phenyl ở 7.30 -7.16 ppm (5H). Tín hiệu multiplet tại 5.67-5.62 ppm đặc trƣng của

proton H-8 (1H).

Ở vùng trƣờng cao, tín hiệu cộng hƣởng tại 3.73 ppm đặc trƣng của ba

proton methoxy (OMe-3H). Tín hiệu singlet tại 2.98 ppm là đặc trƣng của của ba

proton nhóm N-methyl trên Tuv (H-14). Tín hiệu singlet tại 2.19 ppm đặc trƣng của

ba proton nhóm acetyl (OAc). Tín hiệu singlet tại 1.42 ppm các proton nhóm Boc

(9H). Bốn nhóm tín hiệu douplet tại 1.03-0.83 ppm tƣơng ứng với 4 nhóm methyl trên mạch nhánh isoleucine và valin. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR thể hiện tín hiệu

cộng hƣởng của 34 nguyên tử carbon, với các vùng của nguyên tử carbon nhóm

Boc

OMe

OAc

H-11 H-14

H-10

H-6 H-phenyl

H-3 H-17

H-2 H-16

H-8

H-10

carbonyl, nhóm amide, vòng thiazole và vòng phenyl

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR hợp chất 91

Tripeptide 91, 92 đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ Boc, phản ứng đƣợc thực hiện trong dung môi DCM với lƣợng dƣ TFA có mặt TIPS và nƣớc ở 0 oC trong 2h, thu

đƣợc muối trifluoroacetic tƣơng ứng là các tác nhân cho phản ứng tổng hợp dẫn

xuất tubulysin.

3.7. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

N-Methyltubulysin U (95) đƣợc tổng hợp qua 4 phản ứng (Sơ đồ 3.22).

Tripeptide 90b, 90 đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ Boc trong TFA tiếp sau là phản ứng

amide hóa với N-methylpipecolinic acid trong dung môi DMF và HATU có mặt

DIPEA thu đƣợc các tetrapeptide 93 và 93a. Sản phẩm ester 93 sau đó đƣợc thủy

phân nhóm menthyl để tạo ra các dẫn xuất tubulysin. Để có cơ sở cho phản ứng

thủy phân các dẫn xuất ester chứa nhóm menthyl, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

các điều kiện phản ứng thủy phân trên dẫn xuất 93, với tác nhân LiOH và KOH

trong hỗn hợp dung môi THF/H2O. Kết quả cho thấy nhóm menthyl chỉ bị thủy phân dƣới tác dụng của bazơ mạnh KOH ở nhiệt độ 45-50 oC trong thời gian từ 48

giờ, sản phẩm 94 (N-Methyltubulysin V) thu đƣợc với hiệu suất 92 %. Cấu trúc của

94 đƣợc xác định dựa trên phân tích phổ HRMS, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và so

sánh với phổ các chất đã đƣợc công bố [11,48]. Tetrapeptide 94 tiếp tục đƣợc acetyl

hóa nhóm OH tự do bằng phản ứng với acetic anhydride trong DCM, TEA và 1%

mol DMAP thu đƣợc sản phẩm N-Methyltubulysin U (95) với hiệu suất phản ứng

đạt 90%.

Sơ đồ 3.22. Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 93, 93a, 94, 95

Phổ khối lƣợng HRMS-ESI chất 95 (Hình 3.18) xuất hiện ion giả phân tử m/z = 728.4051 [M+H]+, (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057), kết quả này phù hợp với CTPT C38H57N5O7S.

[M+H]+

Hình 3.18. Phổ HRMS hợp chất 95

Trên phổ 1H-NMR chất 95 (Hình 3.19) thể hiện đầy đủ các tín hiệu của

OAc

H-17

H-6‟

H-phenyl

H-1‟ H-19, H-5 H-13

H-9

H-11

các proton tƣơng ứng.

Hình 3.19. Phổ 1H-NMR hợp chất 95

Ở vùng trƣờng thấp tín hiệu proton của vòng thiazole cộng hƣởng singlet

tại 8,10 ppm (H-9), các tín hiệu proton của vòng phenyl ở 7.26 -7.17 ppm (5H).

Tín hiệu cộng hƣởng doubtlet-doublet tại 5.72 ppm đặc trƣng của proton H-11

liên kết OAc. Các tín hiệu multiplet tại 4.64-4.57 ppm quy cho proton H-19 và

H-1‟, tín hiệu multiplet tại 4.38-4.33 ppm đƣợc quy cho proton H-5, tín hiệu

quartet tại 4.33-4.29 ppm tƣơng ứng với proton H-13. Tín hiệu singlet của proton

nhóm CH3-N trên Tuv tại 3.10 ppm (H-17), và CH3-N trên vòng pipecolinic (H-

6‟) tại 2.40 ppm. Ngoài ra, tín hiệu singlet đặc trƣng của nhóm CH3-acetyl tại 2,15 ppm. Phổ 1H-NMR chất 95 có các tín hiệu tƣơng đồng với phổ các chất đã

đƣợc công bố trƣớc đó [11,48,49].

Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR chất 95 (Hình 3.20) thể hiện đầy đủ tín hiệu

của 38 nguyên tử carbon với các vùng tín hiệu đặc trƣng của carbon nhóm acid,

C-5‟ C-5

C3,5,2,6- phenyl

C-9 C4-phenyl

C-1 C-18 C-10 CO-Ac C-7

C1- phenyl

C-1‟ C-19 C-13 C-11

C-24

C-8

amide và vòng thơm.

Hình 3.20. Phổ 13C-NMR hợp chất 95

Trong nỗ lực khảo sát và đánh giá hiệu suất của phản ứng amide hóa tạo

dẫn xuất tubulysin, tripeptide 88 đƣợc thủy phân loại bỏ nhóm methyl ester tạo

thành sản phẩm acid trung gian và đƣợc acyl hóa với hợp chất 81 qua quy trình

hai bƣớc phản ứng (Sơ đồ 3.23).

Kết quả cho thấy việc amide hóa giữa tripeptide 88 với chất 81 tạo sản

phẩm 93 có hiệu suất thấp hơn, đồng thời phản ứng ghép nối tạo ra nhiều sản

Sơ đồ 3.23. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 93 từ tripeptide 88

phẩm phụ hơn so với quy trình thực hiện nhƣ mô tả trong sơ đồ 3.22.

3.8. TỔNG HỢP CÁC CHẤT TƢƠNG TỰ TUBULYSIN

Việc thay đổi amino acid ở đầu N-terminal hoặc ở đầu C-terminal của

tubulysin bằng các amino acid khác nhau đã đƣợc nghiên cứu [53,54,66]. Các kết

qủa cho thấy rằng các thay đổi đối với các vị trí này có thể làm thay đổi hoạt tính

của tubulysin. Để khảo sát thêm về vai trò của amino acid ở đầu N-terminal

chúng tôi tiến hành thay thế amino acid ở đầu N-terminal bằng các dị vòng có

chứa nitơ với cặp điện tử chƣa sử dụng, các cấu trúc này có thể tƣơng tác tốt với

đích tác dụng [96] và hy vọng rằng có thể tạo ra lớp chất mới có hoạt tính lý thú.

Bên cạnh đó, cấu trúc của amino acid ở đầu C-terminal đƣợc đánh giá là không

thay đổi nhiều. Vì vậy, chúng tôi tiến hành tổng hợp các tubulysin mới với sự

thay đổi N-Methylpipecolinic acid bằng các axit dị vòng thơm khác nhau, đồng

thời thay đổi một số cấu trúc trên amino acid Tup nhằm tìm kiếm các tubulysin

mới có hoạt tính đáng chú ý.

3.8.1. Tổng hợp chất tƣơng tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine

Trong một hƣớng tìm kiếm và đánh giá hoạt tính của các cấu trúc tƣơng

đồng với tubulysin, chúng tôi thực hiện việc thay thế isoleucine bằng leucine (Sơ đồ

3.24). Phản ứng đƣợc thực hiện từ tripeptide 87 qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ

Boc trong TFA và hai phản ứng ghép nối liên tiếp với N-methylpipecolinic và muối

trifluoroacetic 81, sản phẩm ester tạo thành đƣợc acetyl hóa nhóm OH tự do thu

đƣợc 96 với hiệu suất chung đạt 45%.

100

Sơ đồ 3.24. Phản ứng tổng hợp hợp chất 96

Sản phẩm 96 đƣợc xác định qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-, 13C-NMR. Phổ 1H-NMR chất 96 (Hình 3.21) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của các

H-phenyl

OAc H-6‟ H-17 H-13 H-5‟ H-6

H-9

H-11

H-1” H-1‟ H-19 H-5

proton tƣơng ứng.

Hình 3.21. Phổ 1H-NMR hợp chất 96

101

Ở vùng trƣờng thấp tín hiệu proton singlet của vòng thiazole tại 8.10 ppm

(H-9), các tín hiệu proton của vòng phenyl tƣơng ứng tại 7.26-7.17 ppm (5H). Tín

hiệu doubtlet-doublet tại 5.65 ppm đặc trƣng của proton H-11.

Tín hiệu cộng hƣởng triplet tại 4.79 ppm đƣợc quy cho proton H-1”, proton

H-19 cộng hƣởng tại 4.66 ppm, proton H-1‟ tại 4.53-4.37 ppm, proton H-5 cộng

hƣởng multiplet tại 4.38-4.33 ppm. Tín hiệu singlet đặc trƣng của ba proton nhóm

methyl liên kết với nitơ H-17 tại 3.03 ppm, nhóm methyl (N-CH3) trên vòng

pipecolinic (H-6‟) tại 2.25ppm, tín hiệu singlet đặc trƣng ba proton nhóm CH3-

acetyl tại 2.17 ppm, hai proton H-5‟ cộng hƣởng multiplet tại 2.95-2.94 ppm. Hai

nhóm methyl trên leucine cộng hƣởng doublet tại 1.18 ppm (J = 7 Hz, 6H).

Ngoài ra, phổ 13C-NMR chất 96 thể hiện đầy đủ tín hiệu của 38 nguyên tử

carbon với các vùng tín hiệu đặc trƣng của carbon nhóm acid, amide, ester.

3.8.2. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu

N-terminal

Từ thành công trong việc tổng hợp N-Methyltubulysin U (95), chúng tôi tiếp

tục tổng hợp các dẫn xuất khác từ nguyên liệu đầu là tripeptide 90, với sự thay thế

của Mep amino acid bằng các acid dị vòng khác nhằm khảo sát thêm về vai trò của

Mep amino acid đối với hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tubulysin.

Các hợp chất 97, 98 đƣợc tổng hợp từ tripeptide 90 qua 4 phản ứng liên tiếp

(Sơ đồ 3.25). Các phản ứng đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp N-

Methyltubulysin U (95). Tripeptide 90 đƣợc loại bỏ nhóm bảo vệ Boc và đƣợc

amide hóa lần lƣợt với 3-methylpicolinic acid và isoquinoline-1-carboxylic acid

trong dung môi DMF với tác nhân HATU trong sự có mặt của DIPEA nhận đƣợc

các tetrapeptide là ester của menthol. Các sản phẩm ester đƣợc thủy phân trong môi trƣờng kiểm mạnh KOH ở 45oC trong 48h để loại bỏ nhóm menthyl, sau đó nhóm

hydroxyl tự do tạo thành trong phản ứng thủy phân đƣợc bảo vệ bởi nhóm acetyl

bằng phản ứng acetyl hóa với acetic anhydride trong DCM/TEA có mặt xúc tác

DMAP. Sau khi xử lý và tinh chế trên sắc ký cột silica gel đã thu đƣợc các

tetrapeptide sạch 97 và 98.

Sản phẩm 97, 98 đƣợc khẳng định thông qua phân tích phổ HRMS, 1H-, 13C-

NMR.

102

Sơ đồ 3.25. Phản ứng tổng hợp hợp chất 97 và 98

Phổ 1H-NMR chất 97 (Hình 3.22) và 98 có các tín hiệu cộng hƣởng tƣơng tự

phổ chất 95 (N-Methyltubulysin U), ngoài ra trên phổ chất 97, 98 xuất hiện thêm

các tín hiệu proton của các dị vòng picolinic hoặc isoquinoline ở vùng trƣờng thấp,

đồng thời mất đi tín hiệu đặc trƣng của 3 proton nhóm methyl liên kết nitơ ở 2.21

OAc

H-17

H-phenyl

H-9

H-4‟ H-3‟

H-5‟ H-9

H-11

H-13 H-5 H-19

ppm và các tín hiệu của proton methylene no của vòng pipecolinic ở 1.2-1.7 ppm.

Hình 3.22. Phổ 1H-NMR hợp chất 97

103

Để tạo sự đa dạng trong cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học ảnh hƣởng

bỡi các nhóm chức, các hợp chất 99, 100, 101 là ester của menthol tạo thành trong

phản ứng ghép mạch tripeptide 90 hoặc 90b với 5-methylpyrazine-1-carboxylic và

Sơ đồ 3.26. Phản ứng tổng hợp hợp chất 99

N- allylpipecolinic acid (Sơ đồ 3.26, 3.27).

Sơ đồ 3.27. Phản ứng tổng hợp hợp chất 100 và 101

Cấu trúc 99, 100, 101 đƣợc khẳng định dựa vào phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 100 (Hình 3.23) thể hiện đầy đủ

các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của các proton dị vòng, proton vòng thiazole và

nhóm phenyl. Các tín hiệu cộng hƣởng trong vùng trƣờng thấp có tín hiệu proton

của vòng pyrazine tại 9.11 ppm (singlet) đƣợc quy cho proton H-4‟, tín hiệu proton

H-2‟ singlet tại 8.59 ppm. Tín hiệu proton của vòng thiazole cộng hƣởng tại 8.10

ppm (H-9).

104

OAc

H-5‟

H-17

H-phenyl

H-9

H-4‟

H-2‟

H-1”

H-11

H-19 H-5 H-13

Hình 3.23. Phổ 1H-NMR hợp chất 100

Các tín hiệu proton của vòng phenyl cộng hƣởng tại 7.27-7.18 ppm. Các tín

hiệu cộng hƣởng doubtlet-doublet tại 5.77-5.75 ppm đặc trƣng của proton H-11 liên

kết OAc, proton H-1‟‟ (quartet) cộng hƣởng tại 5.08-5.05 ppm. Các tín hiệu H-19

(doubtlet), H-5 (multriplet) cộng hƣởng tại 4.68-4.59 ppm, H-13 cộng hƣởng tại

4.38 ppm. Tín hiệu singlet đặc trƣng của ba proton N-CH3 trên Tuv tại 3.14 ppm.

Tín hiệu singlet của ba proton H-5‟ cộng hƣởng tại 2.66 ppm. Tín hiệu singlet đặc

trƣng ba proton nhóm CH3-acetyl tại 2.19 ppm.

Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR, phổ DEPT90 chất 100 (Hình 3.24) thể hiện đầy

đủ các tín hiệu cộng hƣởng 47 nguyên tử carbon. Trong đó, ở vùng trƣờng thấp thể

hiện các tín hiệu cộng hƣởng của carbon nhóm amid, carbon nhóm carbonyl, cabon

vòng pyrazin, vòng thiazole và vòng phenyl. Tín hiệu đặc trƣng của 3 carbon nhóm

amid tại 174.6 ppm (C-18), 164.8 ppm (C-24), 162.7 ppm (C-7). Tín hiệu đặc trƣng

của carbon ester cộng hƣởng tại 177.5 ppm (C-1), carbon nhóm acetyl tại 171.5

ppm (OAc). Tín hiệu cộng hƣởng của carbon vòng pyrazin tại 159.1 ppm (C-3‟),

150.9 ppm (C-2‟), 143.6 ppm (C-4‟), 142.8 ppm (C-1‟). Các tín hiệu vòng thiazole

105

tại 171.7 ppm (C-10), 144.6 ppm (C-8), 125.1 ppm (C-9). Tín hiệu vòng phenyl

C-9 C-phenyl

C-11, C-1” C-19

C-8 C-4‟ C-2‟

C-18 C-10 C-OAc C-1

C-24 C-7 C-1‟

C-3‟

cộng hƣởng ở 139.4-127.4 ppm.

Hình 3.24. Phổ 13C-NMR hợp chất 100

Nhƣ vậy, từ tripeptide 90 bằng việc thay đổi các amino acid ở đầu N-

terminal, chúng tôi đã tổng hợp thành công 05 tetrapeptide là các chất tƣơng tự

tubulysin gồm các hợp chất 97, 98, 99, 100, 101. Cấu trúc của các tetrapeptide đã

đƣợc khẳng định qua phân tích phổ khối lƣợng phân giải cao HRMS –ESI và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR.

3.8.3. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu

C-terminal

Các tetrapeptide 102, 103 đƣợc tổng hợp từ tripeptide 89, qua phản ứng loại

bỏ nhóm bảo vệ Boc và phản ứng ghép nối với N-methylpipecolinic acid, ester 102

nhận đƣợc với hiệu suất đạt 60%. Ester 102 tiếp tục đƣợc xử lý với LiOH trong hỗn

hợp dung môi THF/H2O thu đƣợc acid 103 với hiệu suất phản ứng 92% (Sơ đồ

3.28). Sản phẩm ester 102 và acid 103 đƣợc xác định qua phân tích các phổ HRMS -ESI, 1H-, 13C-NMR.

106

Sơ đồ 3.28. Phản ứng tổng hợp hợp chất 102 và 103

Trên phổ 1H-NMR chất 102 (Hình 3.25) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng. Tại vùng trƣờng thấp thể hiện các tín hiệu cộng hƣởng của proton vòng

thiazole đặc trƣng tại 8.15 ppm (1H, H-9), các tín hiệu tại 7.30-7.19 ppm đặc trƣng

H-6‟ OAc

H-17

H- phenyl

H-9

H-1” H-19 H-1‟ H-13

H-4

H-5 H-11

cho cộng hƣởng của proton vòng phenyl (5H).

Hình 3.25. Phổ 1H-NMR hợp chất 102

107

Tín hiệu doublet đặc trƣng của proton E-olefin (H-4) cộng hƣởng tại 6.77

ppm, J = 9.5 Hz. Tín hiệu cộng hƣởng doublet-doublet đặc trƣng tại 5.75-5.71 ppm

(1H, J = 11 Hz) của proton H-11, proton H-1‟ cộng hƣởng multiplet tại 5.16-5.11

ppm, proton H-19 cộng hƣởng douplet tại 4.78 ppm, proton H-5 cộng hƣởng (br) tại

4.44-4.43 ppm, tín hiệu cộng hƣởng tại 4.24-4.23 ppm đƣợc gán cho proton H-13.

Các tín hiệu cộng hƣởng multiplet tại 4.21-4.17 ppm đặc trƣng của hai proton nhóm

methylene -CH2-OCO- (2H, H-1‟‟). Tín hiệu singlet của ba proton tại 3.08 ppm là

tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của nhóm N-methyl trên Tuv (H-17). Tín hiệu singlet

tại 2.21 ppm đặc trƣng của 3 proton liên kết nitơ trên vòng pipecolinic (H-6‟). Ba

proton cộng hƣởng tại 2.17 ppm singlet là đặc trƣng của nhóm OAc. Tín hiệu cộng

hƣởng tại 1.72 ppm singlet đặc trƣng của ba proton nhóm CH3 liên kết với E-olefin

(H-3).

Trong một hƣớng tổng hợp khác, hợp chất 104 đƣợc tổng hợp từ tripeptide

88 qua 3 phản ứng liên tiếp (Sơ đồ 3.29), đầu tiên chất 88 đƣợc xử lý với LiOH

trong hỗn hợp dung môi THF/H2O, axit tạo thành tiếp tục đƣợc ghép mạch amid với

4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng

trong 14h, sản phẩm tetrapeptide tạo thành tiếp tục đƣợc acetyl hóa với acetic

anhydride nhận đƣợc hợp chất 104 với hiệu suất chung đạt 43 % sau khi tinh chế

trên sắc ký cột silica gel.

Sơ đồ 3.29. Phản ứng tổng hợp hợp chất 104

Sản phẩm 104 đƣợc khẳng định qua phân tích phổ MS, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR. Phổ 1H-NMR chất 104 (Hình 3.26) ở vùng trƣờng

cao có các tín hiệu cộng hƣởng tƣơng tự phổ chất 88, ngoài ra ở vùng trƣờng thấp

đã xuất hiện các tín hiệu của vòng phenyl liên kết sulfonamide ở 7.84 ppm (qui, H-

5”, H-7‟‟) và 7.46 ppm (dd, H-4”, H-8”).

108

H-6‟ OAc

H-11

H-3

H-5” H-7”

H-4” H-8”

H-5

H-7 H-1” H-13 H-1‟

Hình 3.26. Phổ 1H-NMR hợp chất 104

3.8.4. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N-

và C-terminal

4.8.4.1. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin từ tripeptide 89

Từ tripeptide 89 nhằm tìm kiếm các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học lý thú

đồng thời làm rõ thêm vai trò của các nhóm thế đối với hoạt tính của lớp chất

tubulysin này. Chúng tôi tiến hành ghép nối với các amino acid khác nhau nhƣ 5-

methylpyrazin -2-carboxylic acid, N-allylpipecolinic acid, isoquinoline-1-

carboxylic acid.

Muối trifluoroacetic của 89 đƣợc phản ứng với 5-methylpyrazin-1-

carboxylic và isoquinoline -1-carboxylic acid trong dung môi DMF với tác nhân

ghép mạch amid HATU, trong sự có mặt của bazơ DIPEA (Sơ đồ 3.30). Phản ứng

đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12 h. Sản phẩm đƣợc tinh chế trên cột sắc ký

silica gel với hệ dung môi nHexan/EtOAc (1/1) nhận đƣợc các ester 105, 106 với

hiệu suất đạt từ 55-65%.

109

Sơ đồ 3.30. Phản ứng tổng hợp hợp chất 105 và 106

Các sản phẩm 105, 106 đƣợc khẳng định thông qua việc phân tích các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ESI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT-135. Trên phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 105 (Hình 3.27) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng

hƣởng. Tại vùng trƣờng thấp thể hiện các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của các

proton vòng pyrazin, tại 9.29 ppm singlet đƣợc quy cho tín hiệu của proton H-4‟

(1H), tại 8.37 ppm singlet là tín hiệu của proton H-2‟ (1H). Tín hiệu cộng hƣởng

của proton vòng thiazole đặc trƣng tại 8.03 ppm (1H, H-9), các tín hiệu tại 7.30-

-OAc

H-5‟

H-17 H-6

H-phenyl H-9

H-2‟

H-4‟

H-5 H-1” H-19 H-13

H-11

H-4

7.22 ppm đặc trƣng cho cộng hƣởng của proton vòng phenyl (5H).

Hình 3.27. Phổ 1H-NMR hợp chất 105

110

Tín hiệu doublet đặc trƣng của proton E-olefin (H-4) cộng hƣởng tại 6.66

ppm, J = 9.5 Hz. Tín hiệu cộng hƣởng doublet-doublet đặc trƣng tại 5.69-5.67 ppm

(1H, J = 11 Hz) của proton H-11, proton H-5 cộng hƣởng quartet tại 5.18-5.14

ppm, proton H-19 có tín hiệu douplet-douplet tại 5.04-5.01 ppm, tín hiệu singlet của

H-5‟tại 2.60 ppm. Tín hiệu multiplet tại 4.21-4.16 ppm đặc trƣng của hai proton

nhóm -CH2-OCO- (2H, H-1‟‟). Tín hiệu singlet của ba proton tại 3.08 ppm đặc

trƣng cho nhóm N-methyl trên Tuv (H-17). Ba proton singlet tại 2.18 ppm là đặc

trƣng của nhóm OAc. Tín hiệu singlet tại 1.76 ppm đặc trƣng cho nhóm CH3 liên

kết với E-olefin (H-3). Các nhóm các tín hiệu douplet tại 1.04-0.84 ppm là tín hiệu

cộng hƣởng đặc trƣng của 4 nhóm methyl trên mạch nhánh của isoleucine và valine. Ngoài ra, trên phổ 13C- NMR của hợp chất 105 (Hình 3.28) thể hiện tín hiệu

cộng hƣởng của 39 nguyên tử carbon, với các vùng cộng hƣởng đặc trƣng của

nguyên tử carbon nhóm carbonyl, nhóm amide, vòng thiazole và vòng phenyl.

Hình 3.28. Phổ 13C-NMR hợp chất 105

Tín hiệu cộng hƣởng của nhóm carbonyl amide đặc trƣng tại 172.9 ppm (C-

18), 160.0 ppm (C-24), 157.1 ppm (C-7). Tín hiệu cộng hƣởng tại 167.7 ppm là đặc

trƣng của nhóm carbonyl acetyl, tại 163.0 ppm là đặc trƣng của nhóm ester. Tín

hiệu cộng hƣởng của carbon vòng thiazole tại 170.1 ppm (C-10), 142.6 ppm (C-8),

111

123.7 (C-9). Các tín hiệu của vòng pyrazin tại 149.7 ppm (C-3‟), 143.2 ppm (C-2‟),

138,9 ppm (C-4‟), 136,6 ppm (C-1‟). Tín hiệu đặc trƣng của carbon vòng phenyl

cộng hƣởng tại 130.5-126 ppm (6C), tính hiệu đặc trƣng của carbon không no C-2

cộng hƣởng tại 128.5 ppm.

Ở vùng trƣờng cao, phổ 1H-NMR hợp chất 106 (Hình 3.29) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng tƣơng tự phổ 1H-NMR chất 89. Trong khi đó, ở vùng

trƣờng thấp đã xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng của các proton vòng isoquinoline ở

H-17

H-phenyl

H-9

OAc

H-6

H-8‟ H-2‟ H-7‟ H-6‟

H-1”

H-5‟

H-5 H-19

H-4

H-3‟

H-11

H-13

9.57-7.66 ppm.

Hình 3.29. Phổ 1H-NMR hợp chất 106

Để đánh giá vai trò các nhóm chức đối với hoạt tính của các dẫn xuất, chúng

tôi tiến hành thủy phân các dẫn xuất ester nhằm tạo ra các acid có nhóm OH tự do

trên Tuv. Ester 106 đƣợc xử lý với 10 đƣơng lƣợng LiOH trong hỗn hợp dung môi

THF/H2O, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h, nhận đƣợc acid

107 với hiệu suất đạt 93% (Sơ đồ 3.31).

Sơ đồ 3.31. Phản ứng tổng hợp acid 107

112

Sản phẩm tetrapeptide 107 đƣợc xác định nhờ các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân MS(ESI), 1H-NMR, 13C-NMR. Phổ 1H-NMR chất 107 (Hình

3.30) xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng tƣơng tự nhƣ phổ chất

105. Ngoài ra trên phổ chất 107 đã mất đi các tín hiệu singlet đặc trƣng của ba

proton nhóm acetyl ở 2.19 ppm và tín hiệu multiplet của 2 proton nhóm ethoxy tại

4.21-4.16 ppm (2H). Đồng thời tín hiệu của proton H-11 dịch chuyển về vùng

H-11

H-phenyl H-9 H:6‟-8‟ H-5‟ H-3‟

H-4

trƣờng cao hơn ở 5.12-5.09 ppm.

Hình 3.30. Phổ 1H-NMR hợp chất 107

4.8.4.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin từ tripeptide 91

Từ thành công trong việc tổng hợp các tetrapeptide xuất phát từ tripeptide 89

và 90, các chất tƣơng tự tubulysin khác đã đƣợc nghiên cứu và tổng hợp bắt đầu từ

tripeptide 91 với các điều kiện phản ứng tƣơng tự. Muối trifluoroacetic của 91 đƣợc

phản ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1eq) trong dung môi DMF, với sự

có mặt của tác nhân HATU và DIPEA (Sơ đồ 3.32). Phản ứng đƣợc thƣc hiện ở

nhiệt độ phòng trong khoảng 12h, tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel

nhận đƣợc sản phẩm sạch 108 với hiệu suất đạt 61%

113

Sơ đồ 3.32. Phản ứng tổng hợp hợp chất 108

Cấu trúc 108 đƣợc chứng minh bằng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 108 (Hình 3.31) thể hiện đầy

đủ các tín hiệu cộng hƣởng. Ở vùng trƣờng thấp thể hiện tín hiệu cộng hƣởng đặc

trƣng của proton vòng pyrazin tại 9.21 ppm (1H, s, H-4‟), tín hiệu singlet tại 8.46

ppm tƣơng ứng với proton H-2‟. Tín hiệu singlet proton vòng thiazole tại 8.06 ppm

(1H, H-6), các tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng của proton vòng phenyl ở 7.30 -7.16

ppm (5H). Tín hiệu doublet-doublet-doublet đặc trƣng tại 5.68-5.66 ppm của proton

H-8 (1H). Tín hiệu công hƣởng của 2 proton H-2 và H-16 tại 5.06-4.99 ppm (2H,

OMe

OAc

H-14

H-5‟

H-4‟

H-phenyl H-6 H-2‟

H-2 H-16 H-8

H-10

m).

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR hợp chất 108

114

Ở vùng trƣờng cao, tín hiệu tại 3.73 ppm tƣơng ứng với nhóm methoxy

(OMe, 3H). Tín hiệu singlet tại 3.05 ppm đặc trƣng cho nhóm N-methyl trên Tuv.

Tín hiệu của 2 proton tại C-3 cộng hƣởng tại 3.24-3.22 ppm (dd). Tín hiệu singlet

cộng hƣởng tại 2.67 ppm là tín hiệu của ba proton gắn với vòng pyrazin (3H, H5‟).

Tín hiệu singlet proton tại 2.19 ppm đặc trƣng của nhóm acetyl (OAc). Bốn nhóm

tín hiệu douplet tại 1.05-0.97 ppm tƣơng ứng với 4 nhóm methyl trên mạch nhánh

của isoleucine và valin.

Ngoài ra trên phổ 13C-NMR chất 108 thể hiện tín hiệu cộng hƣởng của 35

nguyên tử carbon, với các vùng cộng hƣởng đặc trƣng của nhóm carbonyl, các

nhóm amide, vòng pyrazin, vòng thiazole và phenyl.

Ester 108 tiếp tục đƣợc thủy phân với LiOH trong hỗn hợp dung môi

THF/H2O (Sơ đồ 3.33). Phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24h thu

Sơ đồ 3.33. Phản ứng tổng hợp hợp chất 109

Sản phẩm 109 đƣợc khẳng định bằng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Trên phổ 1H-NMR chất 109 (Hình 3.32) xuất hiện các tín hiệu cộng

đƣợc sản phẩm tetrapeptide 109 với hiệu suất 90%.

hƣởng tƣơng tự phổ chất 108, ngoài ra phổ chất 109 đã mất các tín hiệu singlet

proton của nhóm methoxy (CH3O-) tại 3.74 ppm và tín hiệu singlet đặc trƣng của

nhóm acetyl (OAc) tại 2.19 ppm.

Ngoài ra, phổ 13C-NMR chất 109 thể hiện đầy đủ tín hiệu cộng hƣởng của

32 nguyên tử carbon với các vùng tín hiệu đặc trƣng của vòng pyrazin, thiazole

và phenyl.

115

H-5‟

H-14

H-phenyl

H-6 H-4‟ H-2‟

H-8

H-2 H-16 H-10

F

Hình 3.32. Phổ 1H-NMR hợp chất 109

Trong một hƣớng tổng hợp khác, muối trifluoroacetic của 92 đƣợc phản

ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1 eq) (Sơ đồ 3.34). Sản phẩm

tetrapeptide 110 thu đƣợc với hiệu suất 64 % sau khi đƣợc tinh chế trên cột sắc

ký silica gel.

Sơ đồ 3.34. Phản ứng tổng hợp hợp chất 110

Sản phẩm 110 đƣợc xác nhận qua phân tích phổ ESI-MS, phổ 1H-NMR và

so sánh với phổ chất 108. Phổ khối lƣợng ESI-MS chất 110 (Hình 3.33) xuất hiện ion giả phân tử m/z = 675.2906 [M+Na]+, tính cho C33H44N6O6SNa 675.2941, giá trị khối lƣợng này phù hợp với CTPT C33H44N6O6S. Phổ 1H-NMR chất 110 (Hình 3.34) thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng tƣơng tự nhƣ phổ

116

chất 108. Ngoài ra phổ chất 110 không còn xuất hiện các tín hiệu singlet là tín

hiệu của proton nhóm acetyl cộng hƣởng tại 2.19 ppm. Kết quả này phù hợp với

cấu trúc của 110 với nhóm OH tự do trên Tuv chƣa bị acetyl hóa.

H-phenyl

H-5‟

H-14 OMe

H-6 H-2‟

H-4‟

H-8

H-2 H-16 H-10

Hình 3.33. Phổ MS hợp chất 110

Hình 3.34. Phổ 1H-NMR hợp chất 110

117

Nhƣ vậy, từ tripeptide 89 bằng việc thay đổi các axit carboxylic ở đầu N-

terminal, chúng tôi đã tổng hợp thành công 03 chất tƣơng tự tubulysin mới gồm các

hợp chất 105, 106, 107. Từ tripeptide 91, 92 chúng tôi đã tổng hợp đƣợc 03 chất

tƣơng tự tubulysin mới gồm các hợp chất 108, 109, 110. Cấu trúc của các

tetrapeptide đã đƣợc khẳng thông qua phân tích các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

hiện đại và phổ khối lƣợng phân giải cao.

3.9. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT VÀ CHẤT

TƢƠNG TỰ TUBULYSIN

Các tetrapeptide tổng hợp đƣợc (Hình 3.35) đƣợc thử nghiệm hoạt tính gây

độc tế bào trên các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời gồm: tế bào ung thƣ vú- MCF7

(Human breast carcinoma), tế bào ung thƣ phổi ở ngƣời-A549 (human lung

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời- HT29 (human colorectal

adenocarcinoma), tế bào ung thƣ bạch cầu cấp ở ngƣời- HL60 (human acute

leukemia), tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời- SW480 (human colon carcinoma), với

chất đối chứng là ellipticine. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào đƣợc trình bày

trong bảng 3.1.

118

Hình 3.35. Các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin tổng hợp đƣợc

119

Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin

STT Hợp chất

SW480 0.91±0.10 1.99±0.14

HL-60 0.43±0.04 1.47±0.11

1 2

93a 94

HT29 1.45±0.17 4.38±0.53

A549 1.46±0.16 4.61±0.41

IC50 (µM) MCF-7 3.26±0.42 4.83±0.39

95 0.56±0.06

0.42±0.04

0.68±0.07

0.25±0.03 n.d

0.14±0.016 n.d

96 4.76±0.28

6.82±0.90

9.88±0.91

32.37±4.44 44.75±3.65 34.53±4.10 33.28±2.91 26.54±1.76

97

15.12±1.39 17.91±1.72 13.34±1.13 13.13±1.58 10.57±1.17

98

n.d n.d

7 8

>50 >50

99 100

n.d

24.38±1.65 25.87±1.27 29.84±2.89

101

102 0.27±0.03

0.30±0.04

0.23±0.03

0.11±0.015 0.08±0.009

103 2.60±0.32

3.33±0.38

4.49±0.47

2.32±0.30

1.21±0.13

>50

n.d

12 13 14

>50 28.57±2.94 39.14±3.73 27.13±1.74 19.37±1.80 15.98±1.03 >50

>50

104 105 106

n.d

15 16

>50 >50

107 108

n.d n.d

109 7.57±0.76

9.38±0.47

12.46±1.07

n.d

42.91±4.10 29.20±2.22 29.45±2.30

18 19

110 Ellipticine

0.32±0.03

0.36±0.04

0.35±0.04

0.31±0.02

0.33±0.03

* n.d: Không xác định

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, các dẫn xuất tubulysin

tổng hợp đƣợc thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên dòng tế bào ung thƣ

bạch cầu (HL-60). Từ bảng kết qủa cũng cho thấy rằng, khi nhóm Mep đƣợc thay

thế bởi các dị vòng nhƣ 3-methylpicolinic acid, 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid

và 2-quinolinecarboxylic acid đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu hơn so với

hợp chất có gắn nhóm Mep từ 20-50 lần; hoặc không thể hiện đƣợc độc tế bào (IC50

> 50 M). Ví dụ có thể thấy giữa chất 100 và 93a, sự khác nhau ở nhóm Mep và 5-

methyl-2-pyrazinecarboxylic acid khác biệt tới 34 lần; hay giữa chất 97 và 95, hoạt

tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ HT29 giảm trên 50 lần khi nhóm Mep

đƣợc thay thế bằng 3-methylpicolinic acid. So sánh hoạt tính giữa các hợp chất gắn

acid dị vòng cho thấy, các hợp chất gắn 2-quinolinecarboxylic acid có hoạt tính

mạnh hơn so với các hợp chất đƣợc gắn 3-methylpicolinic acid, 5-methyl-2-

pyrazinecarboxylic acid (chất 98 so với chất 97; 99). Kết quả này cho thấy các

amino acid đƣợc methyl-N hóa ở vị trí α (tạo thành các amine bậc 3) so với nhóm

120

carboxylic có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt tính gây độc tế bào của lớp

chất tubulysin.

Kết quả độc tế bào của 3 chất 93a, 94 và 95 trên 5 dòng tế bào ung thƣ cho

thấy vai trò quan trọng của nhóm OAc trên mạch tubuvaline. Khi không có nhóm

acetyl, hoạt tính gây độc của 94 trên các dòng tế bào ung thƣ HT29, A549, MCF7,

SW480 và HL-60 tƣơng ứng là IC50: 4.38, 4.61 4.83, 1.99 và 1.47 M, yếu hơn so

với dẫn xuất đƣợc acetyl hóa 95 từ 7 đến 11 lần (IC50 của 95 trên các dòng tế bào

ung thƣ HT29, A549, MCF7, SW480 và HL-60 tƣơng ứng 0.56, 0.42, 0.68, 0.25 và

0.14 M).

Đặc biệt, sự thay thế của nhóm Tup ở đầu C-terminal bằng hợp chất không

no (hợp chất 102 và 103) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với các dẫn

xuất tubulysin chứa nhóm Tup. Điều này đƣợc thể hiện khi so sánh kết quả gây độc

tế bào với 93a, 94 và 95. So với chất 94, chất 103 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

không khác nhiều trên các dòng SW480 và MCF7. Tuy nhiên, trên dòng HT29,

A549 và HL60, hợp chất 103 (giá trị IC50 lần lƣợt là 2.60, 3.33 và 1.21 M) có hoạt

tính mạnh hơn so với 94 (giá trị IC50 lần lƣợt là 4.38, 4.61 và 1.47 M). Tƣơng tự,

sản phẩm ester 102 thể hiện hoạt tính mạnh hơn nhiều so với dẫn xuất ester 93a.

Một điều ngạc nhiên là hợp chất 102 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 5 dòng tế

bào ung thƣ thử nghiệm mạnh hơn so với hợp chất N-Methyltubulysin U (95). Kết

quả này gợi ý cho việc nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất tubulysin mà ở đầu C-

terminal có thể thay thế bằng nhóm thế đơn giản, từ đó có thể đơn giản hóa quy

trình tổng hợp tubulysin.

Ngoài ra, những sự thay thế của nhóm phenylalanine ở đầu C-terminal và

nhóm 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid ở đầu N-terminal cho kết quả gây độc tế

bào trung bình và yếu.

121

KẾT LUẬN

1. Luận án đã áp dụng các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại nhƣ: ngƣng tụ

Horner-Wadsworth-Emmons, phản ứng Arndt-Eistert, Sandmeyer, phản ứng

tổng hợp Weinreb amit, các phản ứng Dondoni, Hantzsch, Steglich, trong tổng

hợp hai ɤ-amino acid của tubulysin là tubuvalin và tubuphenylalanin.

2. Luận án đã tổng hợp thành công 04 dipeptide và 06 tripeptide (gồm các hợp

chất từ 84-92) và 19 tetrapeptide (có 17 chất mới) là các dẫn xuất và chất tƣơng

tự tubulysin, bao gồm:

+ 04 dẫn xuất tubulysin, gồm các hợp chất 93, 93a, 94, 95 ( 2 chất mới 93

và 93a)

+ 01 chất tƣơng tự tubulysin mới (96) với thay thế isoleucine bằng leucine

+ 05 chất tƣơng tự tubulysin mới với thay thế amino acid ở đầu N-

terminal, gồm các hợp chất 97, 98, 99, 100, 101.

+ 03 chất tƣơng tự tubulysin mới với thay thế amino acid ở đầu C-

terminal, gồm các hợp chất 102, 103, 104.

+ 06 chất tƣơng tự tubulysin mới với thay thế amino acid ở đầu N- và C-

terminal, gồm các hợp chất 105, 106, 107, 108, 109, 110.

3. Các sản phẩm trung gian và các tetrapeptide đƣợc khẳng định dựa trên việc

phân tích các phổ 1D-, 2D-NMR, HR-ESI-MS.

4. Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của 18 tetrapeptide là các dẫn xuất và chất

tƣơng tự tubulysin tổng hợp đƣợc trên 5 dòng tế bào ung thƣ ngƣời (HT29, A549,

MCF-7, HL60, SW480). Kết quả cho thấy sự thay thế của Mep bởi acid dị vòng tạo

các sản phẩm tetrapeptide không có hoạt tính hoặc hoạt tính gây độc tế bào yếu.

Các sản phẩm có gắn Mep ở đầu N-terminal và giữ nguyên hoặc thay thế nhóm Tup

bằng hợp chất không no có hoạt tính gây độc tế bào khá tốt trên 5 dòng tế bào ung

thƣ thử nghiệm.

122

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Luận án đã lựa chọn đƣợc các điều kiện đơn giản, dễ dàng thực hiện và cho

hiệu suất cao hơn trong tổng hợp hai ɤ-amino acid của tubulysin là tubuvalin và

tubuphenylalanin cũng nhƣ các dẫn xuất tubulysin.

2. Luận án đã thiết kế và tổng hợp thành công 10 chất trung gian mới của

tubulysin ( gồm 04 dipeptide và 06 tripeptide) và 17 tetrapeptide mới là các dẫn

xuất và chất tƣơng tự tubulysin.

3. Luận án đã xác định đƣợc hoạt tính gây độc tế bào của 16 tetrapeptide mới trên 5

dòng tế bào ung thƣ ngƣời là HT29, A549, MCF-7, HL60 và SW480, trong đó 3

tetrapeptide mới 93a, 102 và 103 có hoạt tính gây độc tế bào đáng chú ý. Đặc biệt

chất tƣơng tự tubulysin 102 có hoạt tính gây độc tế bào (IC50 = 0.27- 0.08 µM)

mạnh hơn các dẫn xuất N-Methyltubulysin V (94) và N- Methyltubulysin U (95)

trên các dòng tế bào thử nghiệm.

123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Hai Le Van , Loc Tran Van, Anh Tran Tuan, Thao Tran Thi Phuong, Sung Tran Van, Chien Tran Van. Biological Activity of Tubulysin Analogues. Tetrahedron,

2020. (Bản thảo đã gửi đăng)

2. Hai Le Van, Loc Tran Van, Anh Tran Tuan, Thao Tran Thi Phuong, Sung Tran

Van, Chien Tran Van. Total synthesis and cytotoxicity evaluation of tubulysin

analogues containing nitrogen heterocyclic acids. Natural Product Research, 2020.

(Bản thảo đã gửi đăng)

3. Lê Văn Hải, Trần Tuấn Anh, Trần Văn Lộc, Trần Văn Chiến. Tổng hợp một số

dẫn xuất của tubuphenylalanine acid (tup). Tạp chí Hóa học, 2019, 57(4e3,4), 31-

34.

4. Lê Văn Hải, Trần Tuấn Anh, Trần Văn Lộc, Trần Văn Chiến. Tổng hợp chọn lọc

lập thể tubuphenylalanine axit (Tup) của tubulysin. Tạp chí Hóa học, 2017, 55(3),

384-387.

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO

and Biosynthetic Diversity in Marine Myxobacteria. Mar. Drugs, 2018, 16, 314.

[1]. K. Gemperlein, N. Zaburannyi, R. Garcia , J.J. La Clair and R. Müller, Metabolic

Microorganisms, 2018, 6(3), 84.

[2]. K. I. Mohr, Diversity of Myxobacteria - We Only See the Tip of the Iceberg,

bioactivities and modes-of-action. Natural Product Rep., 2010, 27, 1276 -1295.

[3]. K. J. Weissmana and R. Müller, Myxobacterial secondary metabolites:

Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019, J. Nat. Prod.,

[4]. David J. Newman and Gordon M. Cragg, Natural Products as Sources of New

2020, 83(3), 770-803.

producers of novel natural products with various biological activities-past and

future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium. Journal of

Biotechnology, 2003, 106, 233-253.

[5]. K. Gerth, S. Pradella, O. Perlova, S. Beyer, R. Müller. Myxobacteria: proficient

management of taxane-resistant metastatic breast cancer. Cancer Manag Res.,

[6]. M. V. Cobham and D. Donovan. Ixabepilone: a new treatment option for the

2009, 1, 69-77.

Cancer , 2004, 4, 253-265.

[7]. M. A. Jordan, L.Wilson, Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat. Rev.

Review Anticancer Ther., 2002, 2, 695-708.

[8]. H.Prinz., Recent advances in the field of tubulin polymerization inhibitors. Expert

cytostatic peptides

from myxobacteria acting on microtubule-Production,

isolation, physico-chemical and biological properties. J. Anti., 2000,53, 879-885.

[9]. F. Sasse, H. Steinmetz, J. Heil, G. Höfle, and H. Reichenbach, Tubulysins, new

Isolation, Crystal and Solution Structure Determination, and Biosynthesis of

Tubulysins- Powerful Inhibitors of Tubulin Polymerization from Myxobacteria.

Angew. Chem., Int. Ed., 2004, 43, 4888-4892.

[10]. H. Steinmetz, N. Glaser, E. Herdtweck, F. Sasse, H. Reichenbach and G. Höfle,

and L. A. Wessjohann, Total Synthesis of Tubulysin U and V. Angew. Chem. Int.

Ed., 2006, 45, 7235-7239.

[11]. A. Domling, B. Beck, U. Eichelberger, S. Sakamuri, S. Menon, Q. Chen, Y. Lu,

125

Semisynthesis and degradation of the tubulin inhibitors epothilone and tubulysin.

Pure Appl. Chem., 2003, 75, 167-178.

[12]. G. Höfle, N. Glaser, T. Leibold, U. Karama, F. Sasse, and H. Steinmetz,

Mechanism of Action of Tubulysin, an Antimitotic Peptide from Myxobacteria.

ChemBioChem, 2006, 7, 678-683.

[13]. M. W. Khalil, F. Sasse, H. Lunsdorf, Y. A. Elnakady, and H. Reichenbach,

myxobacteria. Nat. Prod. Rep., 2014, 31, 953-972.

[14]. T. F. Schaberle, F. Lohr, A. Schmitz and G. M. Konig, Antibiotics from

Marine-derived myxobacteria of the suborder Nannocystineae: An underexplored

source of structurally intriguing and biologically active metabolites. Beilstein J.

Org. Chem., 2016, 12, 969-984.

[15]. A. D. Céspedes, P. Hufendiek, M Crüsemann, T. F. Schäberle and G. M. König,

the 30 Years from 1981 to 2010. J. Nat. Prod., 2012, 75 (3), 311-335.

[16]. D. J. Newman and G. M. Cragg, Natural Products As Sources of New Drugs over

in 2013. The Journal of Antibiotics, 2013, 66, 571-591.

[17]. M. S. Butler, M. A. Blaskovich, M. A. Cooper, Antibiotics in the clinical pipeline

Goetz, E. Lazarides and C. M. Woods., Epothilones, a New Class of Microtubule-

stabilizing Agents with a Taxol-like Mechanism of Action. Cancer research, 1995,

55, 2325-2333.

[18]. D. M. Bollag, P. A. McQueney, J. Zhu, O. Hensens, L. Koupal, J. Liesch, M.

Epothilone A and B-Novel 16-Membered Macrolides with Cytotoxic Activity:

Isolation, Crystal Structure, and Conformation in Solution. Angeii. Chrm. Ini.

Ed. EngI., 1996, 35 (13/14), 1567-1569.

[19]. G. Hofle, N. Bedorf, H. Steinmetz, D. Schomburg, K. Gerth, and H. Reichenbach,

Highly Cytotoxic Metabolites

from

the Sorangicin-Producing Bacterium

Sorangium cellulosum, Strain So ce12. Liebigs Ann. Chem., 1994, 759-773.

[20]. R. Jansen, H. Irschik, H. Reichenbach, V. Wray, and G. Hofle, Disorazoles,

Efficient Inhibitor of Eukaryotic Organisms Isolated from Myxobacteria. J.

Antibiotics, 1995, 48 (1), 31 -35.

[21]. H. Irschik, R. Jansen, K. Gerth, G. Hofle and H. Reichenbach, Disorazol A, an

new anti-cancer macrodiolides. Nat. Pro. Rep., 2009, 26, 585-601.

[22]. C. D. Hopkins and P. Wipf, Isolation, biology and chemistry of the disorazoles:

126

Saunders, B and J. S. Lazo et al, Microtubule binding and disruption and

induction of premature senescence by disorazole C1. J. Pharm. Exp. Ther., 2009,

328, 715-722.

[23]. M. B. Tierno, C. A. Kitchens, B. Petrik, T. H. Graham, P. Wipf, F. L. Xu, W. S.

Cytotoxic Macrolactones from Archangium gephyra (Myxobacteria). Antibiotics,

[24]. F. Sasse, H. Steinmetza, G. Hofle and H. Reichenbach, Archazolids, New

2003, 6(56), 520-525.

New Inhibitor of Eukaryotic Organisms Isolated from Myxobacteriat. J.

antibiotics, 1995, 48(9), 962-966.

[25]. H. Irschik, R. Jansen, K. Gerth, G. Hofle, and H. Reichenbach, Chivosazol A, a

Tubulysin Antibody-Drug Conjugates: A Case Study in Addressing ADC

Metabolism. ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7, 977-982.

[26]. L. N. Tumey, C. A. Leverett, and C. Subramanyam et al., Optimization of

Conjugate to Enable Activity Against Multidrug-Resistant Tumors. ACS Med.

Chem. Lett., 2017, 8 (10), 1037-1041.

[27]. L. R. Staben, T. H. Pillow, et al, Stabilizing a Tubulysin Antibody-Drug

Cytostatic and Antifungal Cyclodepsipeptides from Chondromyces crocatus

(Myxobacte.): Isolation and Structure Elucidation. Liehigs Ann., 1996, 285-290.

[28]. R. Jansen, B. Kunze, H. Reichenbach, and G. Hofle, Chondramides A-D, New

and P. Crews, Bengamides Revisited: New Structures and Antitumor Studies. J.

Org. Chem., 2001, 66, 1733-1741.

[29]. Z. Thale, F. R. Kinder, K. W. Bair, A. M. Czuchta, R. W. Versace, S. Wattanasin,

K. Tenney, F. A. Valeriote, L. F. Bjeldanes, P. Crews, Myxobacteria versus

sponge-derived alkaloids: The bengamide family identified as potent immune

modulating agents by scrutiny of LC–MS/ELSD libraries. Bioorg. Med. Chem.,

[30]. T. A. Johnson, J. Sohn, Y. M. Vaske, K. N. White, T. L. Cohen, H. C. Vervoort,

2012, 20, 4348-4355.

Jahn, A. Bauer, G. Penarier, L. Debussche, M. Brçnstrup, Discovery, Structure

Elucidation, and Biological Characterization of Nannocystin A, a Macrocyclic

Myxobacterial Metabolite with Potent Antiproliferative Properties. Angew.

Chem. Int. Ed., 2015, 54, 10145-10148.

[31]. H. Hoffmann, H. Kogler, W. Heyse, H. Matter, M. Caspers, D. Schummer, C. K.

127

Prusov, Isolation, Biological Activity Evaluation, Structure Elucidation, and

Total Synthesis of Eliamid: A Novel Complex I Inhibitor. Chem. Eur. J., 2012, 18

(36), 11362-11370.

[32]. G. Hofle, K. Gerth, H. Reichenbach, B. Kunze, F. Sasse, E. Forche, and E. V.

New Antifungal Compoundfrom Sorangium cellulosum

(Myxobacteria)

Production, Physico-chemical and Biological Properties. J. antibiotics, 1995,

48(9), 973-976.

[33]. G. Gerth, D. Schummer, H. Irschik, G. Höfle and H. Reichenbach, Ratjadon: A

based on mechanisms of action, clinical activity, and resistance. Molecular

Cancer Therapeutics, 2009, 8(8), 2086-2095.

[34]. E. A. Perez, Microtubule inhibitors: Differentiating tubulin-inhibiting agents

Microtubules and Tubulin. Curr. Med. Chem. Anti-Can. Agents, 2002, 2, 1-17.

[35]. M. A.Jordan, Mechanism of Action of Antitumor Drugs that Interact with

Cancer, 2004, 4, 253-265.

[36]. L.Wilson M. A. Jordan, Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat. Rev.

[37]. J. E. Waechter, D. S. Martin, S. K. Bardal, Applied Pharmaco.. Elsevier: 2011.

[38]. K. N. Bhalla, Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene,

2003, 22 (56) 9075-9086.

That Interact with the Colchicine Binding Site. Pharm Res., 2012, 29, 2943-2971.

[39]. Y. Lu, J. Chen, M. Xiao, W. Li, D. D. Miller, An Overview of Tubulin Inhibitors

Steinmetz, Isolation, Crystal and Solution Structure Determination, and

Biosynthesis of Tubulysins- Powerful Inhibitors of Tubulin Polymerization from

Myxobacteria. Angew. Chem., Int. Ed., 2004, 43, 4888-4892;

(b). A. Sandmann, F. Sasse, and R. Muller. Identification and Analysis of the

Core Biosynthetic Machinery of Tubulysin, a Potent Cytotoxin with Potential

Anticancer Activity. Chemistry & Biology, 2004, 11, 1071-1079

[40]. (a). N. Glaser, E. Herdtweck, F. Sasse, H. Reichenbach and G. Höfle. H.

Weissman, U. Kazmaier, and R. Muller, Pretubulysin, a Potent and Chemically

Accessible Tubulysin Precursor from Angiococcus disciformis. Angew. Chem.

Int. Ed., 2009, 48, 4422-4425.

[41]. A. Ullrich, Y. Chai, D. Pistorius, Y. A. Elnakady, J. E. Herrmann, K.J.

128

Discovery of 23 Natural Tubulysins from Angiococcus disciformis An d48 and

Cystobacter SBCb004. Chemistry & Biology, 2010, 17, 296-309.

[42]. Yi Chai, D. Pistorius, A. Ullrich,K. J. Weissman,U. Kazmaier, and R. Muller,

Dömling and S. Agarwal, Biological evaluation of tubulysin A: a potential

anticancer and antiangiogenic natural product. Biochem. J., 2006, 396, 235-242.

[43]. G. Kaur, M. Hollingshead, S. Holbeck, V. Schauer-Vukăsinovíc, R. Camalier, A.

Evaluation of Pretubulysin and Derivatives. Eur. J. Org. Chem., 2009, 36, 6367-

6378.

[44]. A. Ullrich, J. Herrman, R. Muller and U. Kazmaier, Synthesis and Biological

Kazmaier, A. M. Vollmar and R. Muller, Pretubulysin: from hypothetical

biosynthetic intermediate to potential lead in tumor therapy. PLoS One, 2012, 7,

1-12.

[45]. J. Herrmann, Y. A. Elnakady, R. M. Wiedmann, A. Ullrich, M. Rohde, U.

Abhari, E. Wagner, U. Kazmaier, S. Fulda and A. M. Vollmar, Pretubulysin: a

new option for the treatment of metastatic cancer. Cell Death Dis.,2014, 5, e1001.

[46]. S. Braig, R. M. Wiedmann, J. Liebl, M. Singer, R. Kubisch, L. Schreiner, B. A.

Hermann, O. Scherer, R. Muller, O. Werz, U. Kazmaier and A. M. Vollmar,

Simplified pretubulysin derivatives and their biological effects on cancer cells. J.

Nat. Prod., 2014, 77, 536-542.

[47]. R. Kubisch, M. von Gamm, S. Braig, A. Ullrich, J. L. Burkhart, L. Colling, J.

Total Synthesis and Biological Evaluation of Tubulysin U, Tubulysin V, and Their

Analogues. J. Med. Chem., 2009, 52, 238-240.

[48]. R. Balasubramanian, B. Raghavan, A. Begaye, D. L. Sackett, and R. A. Fecik,

[49]. P. Wipf, Z. Wang, Total Synthesis of N14-Desacetoxytubulysin H. Org. Lett.,

2007, 9(8), 1605-1607.

Camarco, A. Vogt, B. W. Day, D. Mende, and P. Wipf, Total Synthesis and

Biological Evaluation of Tubulysin Analogues. J. Org. Chem., 2016, 81(21),

10302-10320.

[50]. R. Colombo, Z. Wang, J. Han, R. Balachandran, H. N. Daghestani, D. P.

D. Toader., The Development and Scale-Up of an Antibody Drug Conjugate

Tubulysin Payload. Org. Process Res. Dev., 2017, 21, 1602-1609.

[51]. J. S. Parker, M. McCormick, D. W. Anderson, B.A. Maltman, L. Gingipalli, and

129

Cytotoxic Simplified Tubulysin Analogues. J. Med. Chem., 2008, 51, 1530-1533.

[52]. B. Raghavan, R. Balasubramanian, J. C. Steele, D. L. Sackett and R. A. Fecik,

Munneke, and J. Gavrilyuk, Improved Total Synthesis of Tubulysins and Design,

Synthesis, and Biological Evaluation of New Tubulysins with Highly Potent

Cytotoxicities against Cancer Cells as Potential Payloads for Antibody-Drug

Conjugates. J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 3690-3711.

[53]. K. C. Nicolaou, R. D. Erande, J. Yin, D. Vourloumis, M. Aujay, J. Sandoval, S.

Sandoval, J. Gavrilyuk, and D. Vourloumis, Total Synthesis and Biological

Evaluation of Natural and Designed Tubulysins. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138

(5), 1698-1708.

the Tubuvaline-

[54]. K. C. Nicolaou, J. Yin, D. Mandal, R. D. Erande, P. Klahn, M. Jin, M. Aujay, J.

Tubuphenylalanine (Tuv-Tup) Fragment of Tubulysin. Org. Lett., 2004, 6(22),

4057-4060.

[55]. P. Wipf, T. Takada, and M. J. Rishel, Synthesis of

Scale Synthesis of Tubuvaline-Tubuphenylalanine Fragment. J. Org. Chem. 2009,

74, 9531-9534.

[56]. S. Chandrasekhar, B. Mahipal, and Mitta Kavitha, Toward Tubulysin: Gram-

Wessjohann, First Total Synthesis of Tubulysin B. Org. Lett.,2009,11, 5567-5569.

[57]. O. Pando, S. Dörner, R. Preusentanz, A. Denkert, A. Porzel, W. Richter and L.

Dall'Angelo, M. Frigerio, I. Usai, A. Testa, N. Zaffaroni, M. Zanda, Synthesis and

Superpotent Anticancer Activity of Tubulysins Carrying Non-hydrolysable N-

Substituents on Tubuvaline. Chem. Eur. J., 2017, 23, 5842-5850.

[58]. M. Sani, P. Lazzari, M. Folini, M. Spiga, V. Zuco, M. D. Cesare, I. Manca, S.

Sani and M. Zanda, Synthesis and structure-activity relationship studies of novel

tubulysin U analogues - effect on cytotoxicity of structural variations in the

tubuvaline fragment. Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 2273-2287.

[59]. S. P. Shankar, M. Jagodzinska, L. Malpezzi, P. Lazzari, I. Manca, I. R. Greig, M.

Tamura, Synthesis and biological evaluation of tubulysin D analogs related to

stereoisomers of tubuvaline. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2011, 21, 431-434.

[60]. T. Shibue, I. Okamoto, N. Morita, H. Morita, Y. Hirasawa, T. Hosoya and O.

Tamura, Total Syntheses of Tubulysins. Chem. Eur. J., 2010, 16, 11678-11688.

[61]. T. Shibue, T. Hirai, I. Okamoto, N. Morita, H. Masu, I. Azumaya, and O.

130

Biological Properties of Highly Potent Tubulysin D Analogues. Chem.-Eur. J.,

[62]. A. W. Patterson, H. M. Peltier, F. Sasse and J. A. Ellman, Design, Synthesis, and

2007, 13, 9534-9541.

and P. Wipf. Z. Wang, Structure–activity and High‐content Imaging Analyses of

Novel Tubulysins. Chem. Biol. Drug Des., 2007, 70, 75-86.

[63]. P. A. McPherson, B. S. Raccor, R. Balachandran, G. Zhu, B. W. Day, A. Vogt

The Multiple Multicomponent Approach to Natural Product Mimics: Tubugis, N-

Substituted Anticancer Peptides with Picomolar Activity. J. Am. Chem. Soc.,

[64]. O. Pando, S. Stark, A. Denkert, A. Porzel, R. Preusentanz and L. A. Wessjohann,

2011, 133, 7692-7695.

Chen, Design, synthesis, and biological activities of triazole tubulysin V

analogue. Tetrahedron Letters, 2013, 54, 2986–2988.

[65]. X. D. Yang, C. M. Dong, J. Chen, Y. H. Ding, Q. Liu, B. Han, Q. Zhang, Y.

Harper, S. Thota, M. Su, J. Ma, V. Bedian, and A. Kamal, Structure-Cytotoxicity

Relationships of Analogues of N14-Desacetoxytubulysin H. J. Med. Chem., 2016,

59, 10781-10787.

[66]. D. Toader, F. Wang, L. Gingipalli, M. Vasbinder, M. Roth, S. Mao, M. Block, J.

Patterson, M. E. Fox, F. C. Szoka, J. M. J. Frechet and J. A. Ellman,

Chemotherapeutic Evaluation of a Synthetic Tubulysin Analogue–Dendrimer

Conjugate in C26 Tumor Bearing Mice. ChemMedChem., 2011, 6, 49-53.

[67]. W. C. Floyd III, G. K. Datta, S. Imamura, H. M. KielerFerguson, K. Jerger, A. W.

Synthesis and cytotoxicity evaluation of diastereoisomers and N-terminal

analogues of tubulysin-U. Tetrahedron Lett., 2013, 54, 6137–6141.

[68]. P. S. Shankar, S. Bigotti, P. Lazzari, I. Manca, M. Spiga, M. Sani and M. Zanda,

Chen, Total Synthesis of Tubulysin U and Its C‐4 Epimer. Chem. Asian J., 2013,

8, 1213-1222.

[69]. X. D Yang, C. M. Dong, J. Chen, Y. H. Ding, Q. Liu, X. Y. Ma, Q. Zhang, Y.

Bioorg,

Tubulysin

analogs

incorporating

desmethyl

and

dimethyl

tubuphenylalanine derivatives. Med.Chem. Lett., 2008, 18, 2996-2999.

[70]. R. Balasubramanian, B. Raghavan, J. C. Steele, D. L. Sackett and R. A. Fecik,

131

Warren, H. Bokesch, S. Kenney, MR. Boyd. New colorimetric cytotoxic assay for

anticancer-drug screening. Journal of the National Cancer Institute. 1990,

82(13):1107-1112

[71]. P. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. Vistica, JT.

generation ionic liquids as green solvents for the oxidation of alcohols with

hypervalent iodine reagents. Tetrahedron, 2004, 60, 2131-2135.

[72]. J. S. Yadav, B. V. S. Reddy, A. K. Basak and A. V. Narsaiah, Recyclable 2nd

Water. J. Org. Chem., 1994, 59, 7549 - 7552.

[73]. S. D. Meyer, S. L. Schreiber, Acceleration of the Dess-Martin Oxidation by

Primary Alcohols and Aldehydes To Form Carboxylic Acids. Angew. Chem. Int.

Ed., 2002, 41(21) , 4059-4061.

[74]. R. Mazitschek, Marcel M¸ lbaier, and A. Giannis, IBX-Mediated Oxidation of

to β-Diketones Using o-Iodoxybenzoic Acid. J. Org. Chem., 2011, 76, 9852-9855.

[75]. S. L. Bartlett and C. M. Beaudry, High-Yielding Oxidation of β-Hydroxyketones

and V. Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46(19), 3526-3529.

[76]. M. Sani, G. Fossati, F. Huguenot, and M. Zanda, Total Synthesis of Tubulysins U

(Se) atoms. Progress in Heterocyclic Chemistry, 2009, 20, 220-252.

[77]. Y.J. Wu, B. V. Yang, Chapter 5.5: Five-membered ring systems: with N and S

Chemistry-Elsevier, 2014, 417-451.

[78]. R. J. Ouellette, J. D. Rawn, Electrophilic Aromatic Substitution. Organic

Methyl-⍺- amino Acids. Chem. Rev., 2004, 104, 5823-5846.

[79]. R. T. C. Brownlee, and A. B. Hughes L. Aurelio, Synthetic Preparation of N-

Diisopropylamine Catalyzed Mild and Chemoselective Reduction of Carboxylic

Esters with Sodium Borohydride. Synthesis, 2009, 4, 0660-0664.

[80]. A. R. Jagdale, A. S. Paraskar, A. Sudalai, Cobalt (II) Chloride Hexahydrate –

Aldrichimica, 1998, 31 (1), 19-26.

[81]. S. Narasimhan and R. Balakumar, Synthetic Applications of Zinc Borohydride.

method to key unit of tubulysin V through one-pot diastereoselective Mannich

process of N,O-acetal with ketone. Tetrahedron, 2019, 75, 260e-268.

[82]. X. M. Wang, Y. W. Liu, Q. E. Wang, Z. Zhou, C. M. Si, B. G. Wei, A divergent

132

Coupling of Functionalized Iodides and Hydrazones: A Synthetic Entry to the

Tubulysin γ-Amino Acids. Org. Lett., 2004, 6(19), 3249-3252.

[83]. G. K. Friestad, J.C. Marie, and A. M. Deveau, Stereoselective Mn-Mediated

access to tubuphenylalanine and tubuvaline: improved Mn-mediated radical

additions and assembly of a tubulysin tetrapeptide analog. The Journal of

Antibiotics, 2016, 69, 294-298.

[84]. K. Banerjee, J.C. Marié, U. Mali and L. Yao. G. K. Friestad, Stereoselective

2193-2256.

[85]. W. Kirmse, 100 Years of the Wolff Rearrangement. Eur. J. Org. Chem., 2002,

Methylation of Boc- Protected Amino Acids. J. Org. Chem., 2009, 74, 8425-8427.

[86]. A. V. Malkov, K. Vrankov, M. Cerny, and P. Kocovsky, On the Selective N-

(Trimethylsily1)thiazoles and Reactions with Carbonyl Compounds. Selectivity

Aspects and Synthetic Utility. J. Org. Chem., 1988, 53, 1748-1761.

[87]. A. Dondoni, G. Fantin, M. Fogagnolo, A. Medici, and P. Pedrini, Synthesis of

Reaction of 2-(Trimethylsilyl)thiazole with Aldehydes Support for the 2-Ylide

Mechanism. J. Org. Chem., 1993, 58, 3196-3200.

[88]. A. Dondoni, A. W. Douglas, and I. Shinkai, Spirodioxolane Intermediates in the

Selective Reagent for the Oxidation of Aldehydes to Carboxylic Acids. J. Prakt.

Chem., 2000, 342 (6), 605-608.

[89]. A. Raach and O. Reiser, Sodium Chlorite-Hydrogen Peroxide -A Mild and

Aldehydes to Acids and Esters with Oxone. Org. Lett., 2003, 5(7), 1031-1034.

[90]. B. R. Travis, M. Sivakumar, G. O. Hollist, and B. Borhan, Facile Oxidation of

Using Oxone. Journal of Chemical Education, 2007, 84(5), 852-854.

[91]. R. Gandhari, P. P. Maddukuri, and T. K. Vinod, Oxidation of Aromatic Aldehydes

Acetone, Tetrahedron, 1998, 54, 401-410.

[92]. K. S. Webb and S. J. Ruszkay , Oxidation of Aldehydes with Oxone in Aqueous

Scavengers For The Trifluoroacetic Acid Deblocking Of Protecting Group In

Peptide Synthesis. Tetrahedron Letters, 1989, 30(21), 2739-2742.

[93]. D. A. Pearson, M. Blanchette, M. L. Baker, C. A. Guindon, Trianlkylsilanes As

coupling. Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852.

[94]. C. A. G. N. Montalbetti, and Virginie Falque, Amide bond formation and peptide

133

reagents in organic synthesis. Tetrahedron, 2004, 60, 2447-2467.

[95]. So-Yeop Han, and Young-Ah Kim, Recent development of peptide coupling

Relationships of Glutamine Mimics Incorporated into Phosphopeptides Targeted

to the SH2 Domain of Signal Transducer and Activator of Transcription 3.

Journal of Medicinal Chemistry. 2009, 52, 6126-6141.

[96]. K. M. Pijus, R. Zhiyong, C. Xiaomin, X. Chiyi, S.Mc.M. John, Structure-Affinity

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................

Các dòng tế bào ung thƣ

Hình 1.7. Vi ống trong quá trình phân bào [37]

1A

1D

1A

1D

1PA

1D 56 57 58 59

60

61 62 1A

63a 63b 63c 63d 64a 64b 64c 64d HTI-286

1D 65a 65b 65c

1D 66a 66b 66c 66d

1U 1V 67a 67b 67c

F

Trong một hƣớng tổng hợp khác, muối trifluoroacetic của 92 đƣợc phản

STT Hợp chất

SW480 0.91±0.10 1.99±0.14

HL-60 0.43±0.04 1.47±0.11

93a 94

HT29 1.45±0.17 4.38±0.53

A549 1.46±0.16 4.61±0.41

IC50 (µM) MCF-7 3.26±0.42 4.83±0.39

95

0.56±0.06

0.42±0.04

0.68±0.07

0.25±0.03 n.d

0.14±0.016 n.d

96

4.76±0.28

6.82±0.90

9.88±0.91

97

98

99 100

101

102

0.27±0.03

0.30±0.04

0.23±0.03

0.11±0.015 0.08±0.009

103

2.60±0.32

3.33±0.38

4.49±0.47

2.32±0.30

1.21±0.13

104 105 106

107 108

109

7.57±0.76

9.38±0.47

12.46±1.07

110 Ellipticine

0.32±0.03

0.36±0.04

0.35±0.04

0.31±0.02

0.33±0.03

2020, 83(3), 770-803.

2009, 1, 69-77.

2003, 6(56), 520-525.

2012, 20, 4348-4355.

2003, 22 (56) 9075-9086.

2007, 9(8), 1605-1607.

2007, 13, 9534-9541.

2011, 133, 7692-7695.

Có thể bạn quan tâm

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Cơ sở lý luận và thực tiễn kiểm sát việc giải quyết các vụ án kinh doanh, thương mại về tranh chấp hợp đồng tín dụng theo thủ tục giám đốc thẩm của Viện kiểm sát nhân dân ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Cơ sở lý luận và thực tiễn kiểm sát việc giải quyết các vụ án kinh doanh, thương mại về tranh chấp hợp đồng tín dụng theo thủ tục giám đốc thẩm của Viện kiểm sát nhân dân ở Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Chất lượng công chức quản lý nhà nước về kinh tế cấp huyện ở thành phố Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Chất lượng công chức quản lý nhà nước về kinh tế cấp huyện ở thành phố Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Xây dựng đội ngũ giảng viên trẻ theo tư tưởng Hồ Chí Minh ở các trường sĩ quan quân đội hiện nay