Luận án tiến sĩ: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:133

Thêm vào BST

Báo xấu

119
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu là: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ Chuyên ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 62 64 01 02 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân 2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam HÀ NỘI, 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Tác giả luận án Huỳnh Văn Chƣơng i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy cô PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Chƣơng ii
MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu đồ xi Danh mục đồ thị xi Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 3 1.3 Phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà 4 2.1.1 Căn bệnh cầu trùng 4 2.1.2 Đặc điểm dịch tễ 13 2.1.3 Sinh bệnh học 14 2.1.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng 15 2.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà 16 2.1.6 Điều trị bệnh cầu trùng gà 18 2.1.7 Miễn dịch chống cầu trùng ở gà 18 2.1.8 Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà 20 2.2 Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.2.1 Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.2.2 Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện gene trong E. coli 21 iii
2.3 Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái 24 2.3.1 Trọng lƣợng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin) 24 2.3.2 Cấu trúc của IgY 24 2.3.3 Độ bền của IgY 25 2.3.4 Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY 26 2.3.5 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà 27 2.3.6 Những ứng dụng của IgY 28 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 31 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 31 3.3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu 31 3.4 Nội dung nghiên cứu 33 3.4.1 Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà 33 3.4.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli 33 3.4.3 Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4.4 Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 33 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.5.1 Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng 34 3.5.2 Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 34 3.5.3 Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà 35 3.5.4 Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 35 3.5.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10. 37 3.5.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E 39 3.5.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 40 iv
3.5.8 Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 41 3.5.9 Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế phẩm 42 3.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể ở gà mắc cầu trùng 44 4.1.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa Thiên Huế 44 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi 44 4.1.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.1.4 Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 47 4.1.5 Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng 50 4.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 54 4.2.1 Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng 55 4.2.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi) 56 4.2.3 Kết quả nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng (35 - 42 ngày tuổi) 58 4.3 Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 59 4.3.1 Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà 59 4.3.2 Xác định loài cầu trùng bằng phƣơng pháp PCR 59 4.3.3 Kết quả tách chiết ARN tổng số 60 4.3.4 Kết quả thực hiện PCR 61 4.3.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 62 4.4 Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E 63 4.4.1 Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng 63 4.4.2 Phân tích trình tự gene 3-1E 64 4.4.3 Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO 66 4.4.4 Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+ 68 4.5 Tối ƣu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 70 v
4.5.1 Kết quả sinh trƣởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 70 4.5.2 Kết quả về khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng 71 4.5.3 Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ƣu 72 4.5.4 Kết quả tốc độ lắc tối ƣu lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli chủng BL21 (DE3) 73 4.5.5 Kết quả về môi trƣờng biểu hiện tối ƣu 74 4.5.6 Nồng độ tối ƣu của chất cảm ứng IPTG 74 4.5.7 Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ƣu 75 4.5.8 Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu 76 4.5.9 Mật độ tế bào tối ƣu 77 4.6 Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng và xác định tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 78 4.6.1 Tách chiết, tinh sạch và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 78 4.6.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 78 4.7 Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 79 4.7.1 Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà 79 4.7.2 Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà 80 4.7.3 Định lƣợng kháng thể IgY 81 4.7.4 Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ 82 4.7.5 Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm 83 4.7.6 Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm 86 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 5.1 Kết luận 89 5.2 Kiến nghị 89 Danh mục các công trình đã công bố 91 Tài liệu tham khảo 92 Phụ lục 106 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Bp Base pair Cặp ba zơ BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid A xít Deoxyribonucleic ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu IgY Yolk Immunoglobulin Kháng thể long đỏ trứng IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton Kilo dalton NC Negative control Đối chứng âm OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RIA Radioimmunoassay Phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ RT – PCR Reverse transcription polymerase chain Phản ứng chuỗi trùng hợp reaction phiên mã ngƣợc SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Điện di trên gel polyacrylamide gel electrophoresis WSF Water soluble fraction Phần hòa tan trong nƣớc vii
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú Vang 44 4.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà 45 4.3 Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.4 Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng 48 4.5 Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể các cơ quan gà bệnh 50 4.6 Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng 55 4.7 Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng 57 4.8 Hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng 58 4.9 Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà 60 4.10 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các môi trƣờng khác nhau 70 4.11 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau 73 4.12 Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau 73 4.13 Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong long đỏ trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất 80 4.14 So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 84 4.15 So sánh tỷ lệ chết ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 85 4.16 So sánh sinh trƣởng của gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 85 4.17 Lƣợng Oocyst trong phân gà trƣớc và sau điều trị 86 4.18 Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau điều trị 86 4.19 Ảnh hƣởng của kháng thể kháng sinh lên sinh trƣởng của gà 87 viii
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 So sánh cấu trúc phân tử của IgY gà và IgG thỏ 25 4.1 Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt 47 4.2 Gà chết khi bị mắc bệnh cầu trùng 47 4.3 Manh tràng căng phồng đỏ sẫm bên trong có máu 49 4.4 Manh tràng bên trong xuất huyết màu đỏ sẫm 50 4.5 Oocyst cầu trùng, 20x 52 4.6 Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tƣơi, HE 10x 52 4.8 Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x 53 4.7 Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE. 40x 53 4.9 Megatozit và Schizont 2 (liệt tử) trong ruột gà, HE. 40x 54 4.10 Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu trùng, HE. 40x. 54 4.11 Oocyst thu đƣợc bằng phƣơng pháp phù nổi 59 4.12 Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số loài Eimeria 59 4.13 Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng formaldehyde để biến tính. 61 4.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1 62 4.15 Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel1% 62 4.16 Ảnh nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc 63 4.17 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong chủng E. coli TOP10 trên agarose gel1% 64 4.18 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose gel 1% 64 4.19 Mức độ tƣơng đồng giữa gene 3-1E đƣợc phân lập với gene 3-1Eđã đƣợc công bố (AF13613) 65 ix
4.20 Mức độ tƣơng đồng của trình tự amino a xít của kháng nguyên 3- 1E đã phân lập và kháng nguyên 3-1E đã đƣợc công bố (AAD39362) 65 4.21 Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene 3-1E 67 4.22 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ chủng E. coli BL21 (DE3) 67 4.23 Biểu hiện của protein 3-1E trong E. coli BL21 tái tổ hợp trên gel SDS-PAGE 15%. 68 4.24 Ảnh tinh sạch và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ 69 4.25 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 72 4.26 Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 74 4.27 Kết quả biểu hiện kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ở các nồng độ IPTG khác nhau 75 4.28 Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng của IPTG lên sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 76 4.29 Ảnh hƣởng của nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên 3-E 76 4.30 Ảnh hƣởng của mật độ tế bào trƣớc khi bổ sung chất cảm ứng 77 4.31 Lƣợng kháng nguyên 3-1E thu đƣợc sau khi tinh sạch bằng gel ProBondTM Nickel-Chelating Resin 78 4.32 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E 79 4.33 Ảnh điện di định lƣợng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12% 82 4.34 Bột lòng đỏ trứng sau khi đông khô 83 4.35 Ảnh kết quả ELISA một số mẫu kháng thể IgY3-1E 83 4.36 Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm 84 x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT Tên biểu đồ Trang 4.1. Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với các tá chất khác nhau 81 DANH MỤC ĐỒ THỊ STT Tên đồ thị Trang 4.1. Kết quả ELISA khảo sát lƣợng kháng thể kháng 3-1E 80 xi
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chƣơng Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi; Mã số: 62 64 01 02 Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà. Phƣơng pháp nghiên cứu Luận án sử dụng các phƣơng pháp: Các biểu hiện lâm sàng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thƣờng quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phƣơng pháp phù nổi và kiểm tra trên kính hiển vi. Tất cả những gà chết do cầu trùng đƣợc mổ khám thu mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm đƣợc cố định trong dung dịch formon 10 , tiêu bản vi thể đƣợc làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng Haematoxylin- Eosin. Một số chỉ tiêu huyết học đƣợc xác định bằng máy tự động Cell Dyn 3700. ARN tổng số của cầu trùng gà đƣợc phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation System (Promega)” tổng hợp sợi ADN bổ sung từ khuôn ARN đƣợc thực hiện bằng Kit “First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) ” và đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’). Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector pGEM-T Easy (Promega), gene 3-1E đƣợc cắt từ vector pGEM-T Easy/3-1E và tinh sạch bằng Kit “Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System (Promega)”, sau đó gắn vào vector biểu hiện pET200 D-TOPO, phản ứng gắn đƣợc thực hiện ở 4°C qua đêm. Mức độ biểu hiện của protein 3-1E đƣợc xác định bằng SDS-PAGE (15% w/v), sau đó gel đƣợc nhuộm với Coomassie Blue R-250. Protein 3-1E đƣợc tinh sạch bằng Kit “ProBondTM Puriication System (Invitrogen, USA)”, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả chính và kết luận Gà mắc bệnh cầu trùng biểu hiện các triệu chứng chủ yếu nhƣ: ủ rũ, ít vận động, xii
tiêu chảy, phân có màng nhầy, có bọt và lẫn máu. Biến đổi bệnh lý chủ yếu tập trung ở ruột non và manh tràng xuất huyết, manh tràng căng phồng lên và lớp niêm mạc bị bào mòn. Các tổn thƣơng vi thể nhƣ sung huyết, xuất huyết nặng, thoái hóa, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tại manh tràng, ngoài ra cũng có các tổn thƣơng bệnh lý tại hồi tràng và trực tràng. Trên tiêu bản vi thể quan sát đƣợc các giai đoạn phát triển khác nhau của cầu trùng ở tế bào biểu mô ruột. Gà mắc bệnh cầu trùng dẫn đến các chỉ tiêu hệ hồng cầu giảm, số lƣợng bạch cầu tăng, công thức bạch cầu cũng thay đổi, số lƣợng bạch cầu trung tính và ái toan tăng, trong khi số lƣợng tế bào lympho giảm. Protein tổng số, lƣợng Albumin và tỷ lệ A G đều giảm. Phân lập đoạn mã hóa gene 3-1E từ Oocyst cầu trùng thu đƣợc đoạn gene có chiều dài là 513 bp, mã hóa chuỗi polypeptide chứa 170 amino a xít, tƣơng đồng 99 so với gene3-1E đƣợc công bố trên GeneBank (mã số: AF113613). Phân tích điện di SDS cho thấy protein dung hợp 3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa. Môi trƣờng nuôi cấy LB cho khả năng sinh trƣởng tốt nhất với tỷ lệ tiếp giống 2 (OD600 = 0,8), lắc 200 vòng phút ở 37ºC sau 11 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của protein dung hợp 6xHis-3-1E lại cho kết quả tốt nhất trên môi trƣờng YJ trong cùng một điều kiện tối ƣu (nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM, nuôi lắc ở 200 vòng phút, nhiệt độ cảm ứng 20ºC trong thời gian 10 giờ). Sắc ký lọc gel 6xHis cho thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa. Bằng phƣơng pháp đông khô đã thu đƣợc 6-7g bột lòng đỏ từ mỗi quả trứng, sau khi hoàn nguyên với PBS theo tỷ lệ 1:9 (w w), chế phẩm có hiệu giá kháng thể đặc hiệu đạt 1 280.000. Sử dụng bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng 3-1E tái tổ hợp cho kết quả tốt trong phòng và điều trị bệnh cầu trùng do Eimeria acervulina, Eimeria tenella, Eimeria maxima ở gà, nhƣ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng ở gà. xiii
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Huynh Van Chuong Thesis title: Research on pathological characteristics of chicken infected with coccidia and development of bioproduct for prevention and treatment of coccidiosis in chicken Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62 64 01 02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Survey on some mainly pathological characteristics of chicken infected with coccidiosis in Thua Thien Hue provine and produce a bioproduct containing specific IgY antibodies against 3-1E antigen of chicken coccidia used in for prevention, treatment efficacy of coccidiosis in chicken. Materials and Methods The clinical parameters were determined by conventional method, Oocyst isolation by flotation method. All died chickens caused by coccidiosis were slaughtered to collect the samples for determination of both macroscopic and microscopic pathological changes. Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and stained with Haematoxylin- Eosin stain. The change of several hematological parameters were determined by automated Cell Dyn 3700 sytem. Total RNA of coccidia was isolated by SV Total RNA Isolation System Protocol (Promega). First strand cDNA from RNA templates was made First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) and was then used as template in PCR amplification with the specific primers (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’). PCR products (3-1E gene) were ligated into pGEM-T Easy vector (Promega), The 3-1E gene was cut from pGEM-T Easy/3-1E vector, and purified by Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System Kit (Promega),they were then ligated into pET200/D-TOPO expression vector, The ligation mix was incubated at 4°C overnight. Expression levels of 3-1E protein were determined by sodium dodecyl sulfate-15% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 15% w/v). The gel slice was then stained with Coomassie Blue R-250. The 3-1E protein was purified by ProBondTM Purification System kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer’s instructions. Main findings and conclusions Chickens infected with coccidia consist of mainly clinical signs such as: droop, xiv
inactiveness, watery diarrhea with mucus, bloody or creamy exudate feces. The main macroscopic lesions of infected chickens showed hemorrhagic and huge necrosis in intestine and caecum, distended caecum and eroded mucosal layer. The microscopic lesions consisted of severe hemorrhage, necrosis, degeneration of epithelial cells, inflammatory infiltrations in caecum, on the other side, pathogenic characteristics could also be observed in ileum and rectum. The different stages of coccidia were also observed in the epithelial cells. Erythro-system parameters decreased, leukocytes number increased and its formula was changed, number of neutrophils and eosinophils increased, in case of lymphocytes decreased. The protein total of serum, its formula and A/G ratio were decreased. We cloned and expressed a gene coding 3-1E antigen from Eimeria isolated from Thua Thien Hue province, Vietnam. The open reading frame of 3-1E gene has 513 bp in length, encoding a polypeptide chain with 170 amino acid residuces. Homology search showed that our 3-1E gene is 99% similarity with 3-1E gene of Genebank (accession number: AF113613). SDS electrophoresis showed that expression of the 3-1E gene in E. coli BL21 (DE3) produced a fusion protein with molecule of ~26 kDa. Improvement of the recombinant antigen expression level in E. coli strain BL 21 Star TM (DE3) encoding gene 3-1E of Eimeria was conducted. The result showed that LB medium has given the best growth of E. coli BL 21 (DE3) in comparison with other media in the same 2% initial seed inoculum size (OD600 = 0.8), shaking 200 rpm at 37oC for 11hrs. However, the highest level of fusion protein (6xHis-3-1E) was obtained from YJ medium in the same optimum culture condition (0.8 mM IPGT-Isopropyl β-D- 1-thiogalactopyranoside for 10hrs at 20oC). Molecular weight of purified 6xHis-3-1E protein from 6xHis affinity chromatography was about 26 kDa. By using lyophilized method, 6-7g of powder from 1 egg, after reverting with PBS (1: 9, w/w) the solution presented specific antibody titer reaching 1/128.000. Using egg yolk powder containing antibodies against recombinant 3-1E antigen showed good results in prevention and treatment of coccidiosis that caused by E. acervulina, E. tenella, E. maxima in chicken, such as: reducing morbidity, mortality, Oocyst shedding as well as increasing recovery rate and growth performance. xv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002). Trên toàn thế giới hàng năm ƣớc tính thiệt hại trên 2 tỷ USD (Williams, 1998). Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao ở gà con (30 - 100 ), làm tăng số gà còi cọc, giảm tốc độ tăng trƣởng cho toàn đàn, giảm sản lƣợng trứng ở gà đẻ từ 20 - 40%, giảm chất lƣợng thịt và tăng tiêu tốn thức ăn (Edgar, 1955; Tyzzer, 1932). Bệnh gây ra bởi ký sinh trùng đơn bào (Protozoa), thuộc phân lớp Coccidia, họ Eimeriidae và chi Eimeria (Finlay et al., 1993; Lillehoj and Lillehoj, 2000). Gà ở tất cả các lứa tuổi đều có thể nhiễm cầu trùng, trong đó thƣờng gặp nhất là gà ở giai đoạn 2- 3 tuần tuổi (Lillehoj and Lillehoj, 2000; Lillehoj et al., 2004). Hiện nay có nhiều loài Eimeria gây bệnh trên gà, trong đó có 7 loài gây bệnh chủ yếu: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. brunetti, E. praecox và E. mitis (Shirley, 1986). Mỗi một loài Eimeria khác nhau có vị trí gây bệnh khác nhau trong đƣờng tiêu hóa (Nguyễn Hữu Hƣng, 2010; Fanatico, 2006). Cho đến nay, để phòng trị bệnh cầu trùng ngƣời chăn nuôi chủ yếu dùng kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nƣớc uống. Tuy nhiên, phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới đòi hỏi chi phí cao (Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dƣ trong sản phẩm gia cầm làm ảnh hƣởng đến ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, tạo ra các chế phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp bách của thực tiễn. Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có khung đọc mở dài 513 bp, mã hóa đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lƣợng phân tử là 18.523 kDa, tồn tại ở giai đoạn Sporozoite và Merozoite của một số loài nhƣ E. acervulina, E.tenella, E. maxima. Đã có những nghiên cứu sử dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp làm vắc xin chống lại E. acervulina, E. tenella và E. maxima (Lillehoj et al., 2000). Tiêm chủng bằng vắc xin ADN dựa trên gene 3-1E cũng gây đƣợc đáp ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011). 1
Áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo đƣợc kháng thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng. Đây là lợi thế của phƣơng pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phƣơng pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống. Công nghệ chế tạo kháng thể truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở ngƣời và động vật thƣờng sử dụng các gia súc lớn nhƣ ngựa, cừu. Tuy nhiên, công nghệ này có nhƣợc điểm là kích thƣớc động vật lớn, đòi hỏi lƣợng kháng nguyên để gây miễn dịch phải nhiều, để có kháng thể phải lấy máu động vật tách huyết thanh hoặc huyết tƣơng rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp, việc lấy máu động vật không đƣợc thƣờng xuyên dẫn đến sản lƣợng kháng thể thu đƣợc từ mỗi cá thể động vật không nhiều (Hoàng Ngọc Hiển và Nguyễn Văn Việt, 1998; Lê Thu Hồng, 2004). Loài gà có khả năng sinh kháng thể tƣơng tự nhƣ động vật có vú. Trong số các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể đƣợc chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng. Gà mái ở độ tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng đƣợc thực hiện hàng ngày với lƣợng kháng thể thu đƣợc từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thƣớc của gà mẹ. Kỹ thuật tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tƣơng đối đơn giản, từ đó công nghệ chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng đỏ trứng do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lƣợng lớn kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng nhƣ cho ngƣời (Dias da Silva and Tambourgi, 2010; Schade et al., 2005). Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và hiệu quả của nó trong phòng và trị bệnh nhiều bệnh truyền nhiễm đã đƣợc chứng minh. Mặt khác, kháng thể lòng đỏ có giá thành thấp, dễ bảo quản, có độ an toàn và tính đặc hiệu cao, đặc biệt là chỉ tác động lên mầm bệnh, không ảnh hƣởng đến vi sinh vật có lợi trong cơ thể, không gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của thực phẩm. Bên cạnh đó việc dùng kháng thể trong phòng và điều trị bệnh là một giải pháp đƣợc lựa chọn hàng đầu trong định hƣớng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh ở vật nuôi. 2
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đƣợc các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà đƣợc nuôi tại Phú Vang- Thừa Thiên Huế. Sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể kháng cầu trùng gà. Xác định đƣợc hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Về thời gian: Các nghiên cứu đƣợc thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công nghệ sinh học- Đại học Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Kết quả luận án cho thấy triệu chứng lâm sàng, tổn thƣơng đại thể, vi thể và thay đổi các chỉ tiêu huyết học của gà Tre mắc bệnh cầu trùng tại thừa Thiên Huế. Đồng thời, xuất phát từ lợi thế của công nghệ sản xuất globulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại bệnh cầu trùng gà. Đề tài đƣợc tiến hành để tạo ra một chế phẩm sinh học có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà. Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và gây miễn dịch cho gà mái đẻ. Sau đó thu trứng có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. Thành công trong nghiên cứu này là đã chế tạo đƣợc bột lòng đỏ trứng có chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà và sử dụng trong phòng và điều trị bệnh cho kết quả tốt nhƣ: Làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng của gà. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đây là một công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm. 3