Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:194

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrioparahaemolyticus nhằm kiểm soát dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. Để hiểu rõ hơn về đề tài, mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết luận án!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 NĂM 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THẾ XUÂN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN Bacillus sp. ĐỐI KHÁNG VỚI Vibrio parahaemolyticus TRONG NUÔI TÔM CÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 62620301 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. VŨ NGỌC ÚT TS. PHẠM ANH TUẤN NĂM 2020
i
TÓM TẮT Được ghi nhận lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 2009, bệnh Hoại tử gan tụy cấp ở tôm (AHPND) đã lan rộng ra nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới, trong đó có Việt Nam và trở thành mối nguy hại hàng đầu đối với nuôi tôm công nghiệp tại các quốc gia này. Tác nhân gây AHPND là một số chủng Vibrio parahaemolyticus mang plasmid mã hóa cho độc tố nhị thể PirA/PirB gây hoại tử gan tụy cấp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm phân lập, ứng dụng các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có tính đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus để phòng chống AHPND trong nuôi tôm công nghiệp. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu kể trên, từ các ao tôm công nghiệp không mắc bệnh và nghi mắc AHPND tại ba tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau, 149 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus sp. và 51 chủng vi khuẩn Vibrio sp. đã được phân lập từ tuyến tiêu hóa tôm, bùn và nước. Bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện các gen toxR, tdh, trh, pirA và pirB và các quan sát mô bệnh học khi cảm nhiễm trên tôm, 12 chủng V. parahaemolyticus đã được xác định, trong đó chủng BĐB1.4v, dương tính với cả hai gen pirA và pirB, chính là tác nhân gây AHPND. Bên cạnh đó, phương pháp phân loại MLST (Multilocus Sequence Typing) đã được sử dụng để phân loại một tập hợp gồm 26 chủng Bacillus sp. Kết quả phân tích cho thấy có bốn loài Bacillus chính là B. subtilis (11 chủng), B. velezensis (8 chủng), B. siamensis (5 chủng) và B. licheniformis (2 chủng). Tiếp đó, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đã được sử dụng để phân lập hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có hoạt tính đối kháng cao với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng BĐB1.4v gây AHPND. Ngoài khả năng tiết enzyme protease, amylase và cellulase mạnh, hai chủng này còn có thể thích ứng với các điều kiện rất rộng về nhiệt độ, pH và độ mặn. Mật độ ức chế tối thiểu của hai chủng Bacillus này đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND là 106 cfu/mL. Khi thử nghiệm trên mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô 100 lít, chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 giúp phòng chống hiệu quả AHPND với tỷ lệ sống của tôm sau 36 giờ cảm nhiễm V. parahaemolyticus BĐB1.4v lần lượt là 85,56% và 76,67%. Ở quy mô 1000 lít trong khoảng thời gian theo dõi đến 35 ngày sau cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh, chủng B. subtilis BRB2.1 không những cho phép bảo vệ tôm khỏi AHPND mà còn cải thiện tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn so với mẫu đối chứng không cảm nhiễm. Khả năng đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 rất có thể liên quan đến sự có mặt của gen mã hóa subtilosin A, vốn là một loại bacteriocin phổ rộng. Do tính an toàn của B. subtilis đã được công nhận nên chủng B. subtilis BRB2.1 có thể được ứng dụng trực tiếp để sản xuất các chế phẩm sinh học phòng chống AHPND trong nuôi tôm nước lợ. ii
ABSTRACT Since its emergence in China in 2009, acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) has been causing massive losses in aquaculture. To date, the disease has been recognized as the biggest threat to the shrimp farming industry in many countries (including Vietnam). The causative agent of AHPND has been identified as Vibrio parahaemolyticus strains that harbor a large plasmid encoding binary toxins PirA/PirB. The aim of this study was to isolate and apply Bacillus isolates that are strongly antagonistic against V. parahaemolyticus to prevent AHPND in cultured shrimps. To this end, we have isolated 149 presumptive Bacillus sp. isolates and 51 Vibrio sp. isolates from shrimp digestive tract, sediment and water samples from commercial shrimp ponds in Bac Lieu, Soc Trang and Ca Mau provinces. By detecting toxin genes (toxR, tdh, trh, pirA và pirB) with PCR and performing histological observation, we have identified 12 V. parahaemolyticus isolates, among which, BĐB1.4v strain, positive for both pirA and pirB, was shown to be the direct cause of AHPND. Furthermore, Multi-locus Sequence Typing (MLST) was used to describe the genetic diversity of a collection of 26 Bacillus isolates. The results showed 4 major clusters, corresponding to 4 Bacillus species, namely B. subtilis (11 isolates), B. velezensis (8 isolates), B. siamensis (5 isolates) và B. licheniformis (2 isolates). Additionally, agar diffusion method was used to reveal the strong antagonistic activity of B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 to V. parahaemolyticus (including strain BĐB1.4v causing AHPND). These two Bacillus isolates could not only secrete high level of protease, amylase, and cellulase, but also adapt to a vast range of temperature, pH and salinity. Results showed that when inoculated at 106 cfu/mL or higher, these two isolates could inhibit the growth of V. parahaemolyticus BĐB1.4v. When tested on Litopenaeus vannamei cultured in tanks of 100L, B. subtilis BRB2.1 and B. siamensis BĐK2.3 strains were proved to be effective against AHPND (shrimps’ survival rates were 85,56% and 76,67% when being cultured with the two isolates). In larger model (1000L), B. subtilis BRB2.1 strain not only protected shrimps from AHPND but also improved their food conversion rate. The antagonistic activity to V. parahaemolyticus of this strain may be explained by the presence of the gene encoding for subtilosin A, which is a wide-spectrum bacteriocin. Since B. subtilis is considered as GRAS, B. subtilis BRB2.1 could be used directly to produce probiotics that prevent AHPND in shrimp farming. iii
iv
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ......................................................................................................................... i TÓM TẮT.............................................................................................................................. ii ABSTRACT ......................................................................................................................... iii CAM KẾT KẾT QUẢ ......................................................... Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC ............................................................................................................................. v DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................................... xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... xiii Chương 1: GIỚI THIỆU..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát .................................................................................... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................ 2 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................................... 3 1.5 Tính mới của luận án: ...................................................................................................... 3 1.6 Thời gian thực hiện .......................................................................................................... 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4 2.1 Khái quát về hiện trạng nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (tôm nước lợ) ......... 4 2.1.1 Tình hình nuôi tôm nước lợ trên thế giới .................................................. 4 2.1.2 Tình hình nuôi tôm nước lợ ở Việt Nam ................................................... 5 2.2 Tình hình dịch AHPND ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam ............................. 6 2.3 Tác nhân gây AHPND trên tôm nuôi ......................................................................... 7 2.4 Chẩn đoán AHPND và các biện pháp phòng, trị bệnh trên tôm nuôi .................. 8 2.4.1 Chẩn đoán AHPND ................................................................................... 8 2.4.2 Phòng chống AHPND ở tôm nuôi............................................................. 9 2.5 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ........................................................................... 12 2.5.1 Đặc tính chủng V. parahaemolyticus ...................................................... 12 2.5.2 Các độc tố của V. parahaemolyticus ....................................................... 14 2.5.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ............................................................................................. 18 2.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 18 2.5.3.2 Ảnh hưởng của pH ............................................................................ 18 2.5.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn ..................................................................... 18 2.6 Khái quát chung về Bacillus subtilis. ......................................................................... 19 2.6.1 Sơ lược về B. subtilis............................................................................... 19 2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của B. subtilis . 20 2.6.3 Phân loại Bacillus theo phương pháp truyền thống ................................. 22 2.6.4 Phân loại Bacillus theo các phương pháp phân tử................................... 22 2.6.5 Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp và nuôi trồng thủy sản ....... 26 2.7 Bacteriocin ..................................................................................................................... 29 2.7.1 Khái niệm ................................................................................................ 29 2.7.2 Phân loại Bacteriocin .............................................................................. 31 2.7.3 Ứng dụng của bacteriocin từ Bacillus trong thủy sản ............................. 31 v
2.7.4 Subtilosin A............................................................................................. 33 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu........................................................ 35 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 36 3.2.2 Phương pháp phân lập Vibrio sp. và xác định V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm ........................................................................................................... 37 3.2.3 Phương pháp phát hiện gen độc tố ở các chủng Vibrio sp. phân lập được .......................................................................................................................... 37 3.2.3.1 pirA.................................................................................................... 39 3.2.3.2 pirB.................................................................................................... 39 3.2.3.3 toxR ................................................................................................... 39 3.2.3.4 tdh...................................................................................................... 40 3.2.3.5 trh ...................................................................................................... 40 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của V. parahaemolyticus .................................. 40 3.2.5 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp ...................................................................................................... 41 3.2.5.1 Phương pháp lấy mẫu........................................................................ 41 3.2.5.2 Phương pháp phân lập Bacillus từ ao nuôi tôm ................................ 41 3.2.6 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 42 3.2.6.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus ........................................................................... 42 3.2.6.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính protease cao ................................................................................................... 42 3.2.6.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính amylase cao ................................................................................................... 42 3.2.6.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính cellulase cao .................................................................................................. 43 3.2.7. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen của Bacillus ............ 43 3.2.8 Phương pháp phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng Bacillus BRB2.1 ............................................................................................... 43 3.2.8.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....................................................................................................................... 43 3.2.8.2. PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng Bacillus BRB2.1 ....... 44 3.2.8.3 Tách dòng và giải trình tự gen sboA từ chủng Bacillus BRB 2.1 ..... 44 3.2.8.4 Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide và trình tự axít amin của subtilosin A ................................................................................................... 44 3.2.9 Phương pháp đánh giá đa đạng di truyền của Bacillus sp. phân lập được .......................................................................................................................... 45 3.2.9.1 Đánh giá đa dạng di truyền nhóm Bacillus dựa trên trình tự 16S rDNA ............................................................................................................. 45 3.2.9.2 Đánh giá đa đạng di truyền của nhóm Bacillus dựa trên phân tích MLST ............................................................................................................ 46 3.2.10 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus sp. ........................................................................................ 47 vi
3.2.11 Kiểm tra khả năng gây AHPND của các chủng V. parahaemolyticus BĐB1.3v, BĐB1.4v, BNB 3.1v, BRB1.1v, CĐB6v trên TTCT ...................... 48 3.2.12 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm .......................................................................................................................... 49 3.2.13 Phương pháp thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với Vibrio sp. ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................. 50 3.2.13.1 Lựa chọn các chủng Bacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus và hoạt tính enzyme ngoại bào cao ................................. 50 3.2.13.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống bể nuôi tôm 100 lít .................. 51 3.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio của các chủng vi khuẩn Bacillus trong hệ thống bể nuôi tôm 1000 lít ........................................ 52 3.2.14.1 Bố trí thí nghiêm: ............................................................................ 52 3.2.14.2 Phương thức thực hiện: ................................................................... 52 3.2.14.3 Cho ăn và quản lý ........................................................................... 52 3.2.14.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................... 53 3.2.15 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 53 Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 54 4.1 Phân lập các chủng thuộc chi Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp.................. 54 4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. phân lập được bằng PCR....................................................................................................................................... 55 4.2.1 Phát hiện gen toxR đặc hiệu cho V. parahaemolyticus............................ 55 4.2.2 Phát hiện gen độc lực tdh ........................................................................ 58 4.2.3 Phát hiện gen độc lực trh......................................................................... 59 4.2.4 Phát hiện gen độc lực pirA ...................................................................... 60 4.2.5 Phát hiện gen độc lực pirB ...................................................................... 60 4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ mặn, pH đến sự phát triển của V. parahaemolyticus ................................................................................................................. 62 4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 62 4.3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 63 4.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v ............................................................................. 64 4.4 Phân lập các chủng thuộc chi Bacillus trong ao nuôi tôm công nghiệp .............. 65 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nuôi tôm công nghiệp ......................................................................................................... 67 4.5.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus ............................................................................................. 67 4.5.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh protease cao. 68 4.5.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh amylase cao . 69 4.5.4 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp. có hoạt tính sinh cellulase cao 70 4.6 Xác định sự có mặt của các gen mã hóa bacteriocin ở chủng BRB2.1 ................ 72 4.6.1 Phát hiện và tách dòng gen mã hóa bacteriocin từ chủng BRB2.1 ......... 72 4.6.2 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1............................................................................................................. 75 vii
4.6.2.1 Xây dựng cây phả hệ trình tự axít amin của subtilosin A từ chủng BRB2.1 .......................................................................................................... 75 4.6.2.2 So sánh trình tự axít amin subtilosin A ............................................. 76 4.6.3 Xây dựng cây phả hệ và so sánh trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu ...................................................... 77 4.6.3.1. Xây dựng cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA ......................... 77 4.6.3.2 So sánh trình tự nucleotide gen sboA ................................................ 77 4.7 Đa dạng di truyền 26 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rDNA và phân tích MLST .......................................................................... 78 4.7.1. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA ............................................................................ 78 4.7.2. Phân tích đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn nghi là Bacillus bằng MLST ............................................................................................................... 79 4.8 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ...................................................................................... 85 4.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3................................................................................... 85 4.8.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3............................................................................................ 86 4.8.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 ....................................................................................... 86 4.9 Kiểm tra khả năng gây AHPND của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên TTCT .................................................................................................................................... 87 4.10 Nghiên cứu độc tính của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v trên tôm ......... 89 4.11 Thử nghiệm tính đối kháng của Bacillus sp. với V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở quy mô phòng thí nghiệm .............................................................................................. 91 4.11.1 Nghiên cứu tính đối kháng của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đối với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v gây AHPND trong môi trường nước nuôi tôm ...................................................................... 91 4.11.2 Thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 Lít............................. 93 4.12 Thử nghiệm khả năng bảo vệ tôm khỏi sự nhiễm V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở quy mô nuôi 1000 lít ....................................................................................... 95 4.12.1. Sự biến động của các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thử nghiệm 95 4.12.2 Sự biến động của chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và mật độ Vibrio trong quá trình thử nghiệm ............................................................................................... 97 4.12.3 Tỉ lệ sống và sự phát triển của tôm trong quá trình thử nghiệm ............ 99 Chương 5: KẾT LUẬN - ĐỀ XUẤT ............................................................................. 101 5.1 Kết luận .........................................................................................................................101 5.2 Đề xuất ..........................................................................................................................101 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 103 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM ....................................................................... 128 PHỤ LỤC B: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.................................................. 149 PHỤ LỤC C: CÁC BẢNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC KHI PHÂN LẬP ..................................................................................................................................... 150 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐỊNH TÊN CỦA 30 CHỦNG NGHI LÀ BACILLUS BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RDNA ................................................................. 161 viii
PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ......................................................................... 164 PHỤ LỤC F: MỘT SỐ HÌNH THỰC NGHIỆM....................................................... 171 ix
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Các gen được sử dụng để phân loại các loài thuộc nhóm B. cereus bằng kỹ thuật MLST ................................................................................................................ 25 Bảng 2.2 Các bacteriocin từ Bacillus sp. được công bố trong khoảng thời gian 2000- 2019 ............................................................................................................................ 32 Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau .............................. 35 Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn sử dụng trong dựng cây phả hệ gen subtilosin A ....... 45 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng cho phân tích MLST ................................................ 46 Bảng 4.1: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio ................................ 54 Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả PCR khuếch đại gen toxR và hình thái khuẩn lạc trên môi trường Chromagar Vibrio ........................................................................................... 57 Bảng 4.3 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các mức nhiệt độ khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ......................................................................... 62 Bảng 4.4 Mật độ (Log cfu/mL) của vi khuẩn V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong các nghiệm thức pH khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy ........................................ 63 Bảng 4.5 Mật độ (Log cfu/ml) của V. parahaemolyticus BĐB1.4v ở các độ mặn khác nhau sau 24 và 48 giờ nuôi cấy .................................................................................. 65 Bảng 4.6 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .............................. 65 Bảng 4.7 Kết quả phân tích MLST 7 gen “house-keeping”....................................... 81 Bảng 4.8 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................. 85 Bảng 4.9 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau ........................................................................... 86 Bảng 4.10 Mật độ của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 sau 24 giờ nuôi cấy ở các độ mặn khác nhau .............................................................................. 87 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của 5 chủng V. parahaemolyticus đến tỉ lệ tôm chết sau 36 giờ gây nhiễm trong hệ thống nuôi 100 lít ....................................................................... 88 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của mật độ cảm nhiễm chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v đến tỉ lệ tôm chết sau 24 giờ ...................................................................................... 90 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của liều cấp giống của hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 đến mật độ V. parahaemolyticus BĐB1.4v trong môi trường nước nuôi tôm ..................................................................................................................... 93 Bảng 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng chống AHPND của chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 trong thùng nuôi 100 lít sau 36 giờ gây nhiễm .... 94 Bảng 4.15: Các chỉ tiêu môi trường trong các nghiệm thức ...................................... 96 Bảng 4.16: Mật độ vi sinh vật tổng số của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL) ........................................................................................................ 98 Bảng 4.17: Mật độ vi khuẩn Vibrio của các nghiệm thức trong quá trình thử nghiệm (cfu/mL) ..................................................................................................................... 98 Bảng 4.18: Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) sau thí nghiệm ................................................................................................................ 100 Bảng C.1: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường NA .......................................... 150 Bảng C.2: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong mẫu nước lấy tại Bạc Liêu sau 24h cấy trên môi trường TCBS ...................................... 151 Bảng C.3: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu).................................................................... 151 x
Bảng C.4: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu bùn thu tại Bạc Liêu) ............................................................... 152 Bảng C.5: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) ........................................ 153 Bảng C.6: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Bạc Liêu) .................................... 154 Bảng C.7: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) ................................. 155 Bảng C.8: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong nước sau 24h cấy trên môi trường TCBS .......................................................................... 156 Bảng C.9: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau)............................................................................. 156 Bảng C.10: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Vibrio trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ........................................................................ 157 Bảng C.11: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Cà Mau) .......................................... 157 Bảng C.12: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Vibrio trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường TCBS (Mẫu lấy tại Cà Mau) ...................................... 158 Bảng C.13: Bảng mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong nước sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ............................. 158 Bảng C.14: Đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ......................................................................... 159 Bảng C.15: Mô tả hình dạng, kích thước khuẩn lạc các chủng Bacillus trong ruột tôm sau 24h cấy trên môi trường NA (Mẫu lấy tại Sóc Trăng) ...................................... 160 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pVA1 và vị trí các gen pirA và pirB ..................................... 8 Hình 2.2 Vị trí gen pirA và pirB trên plasmid pVA1 của V. parahaemolyticus .......... 8 Hình 2.3 Nhuộm mô gan tụy bằng haematoxylin và eosin (Phiwsaiya et al., 2017) ... 9 Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn V. parahaemolyticus dưới kính hiển vi điện tử (https://www.ppdictionary.com/bacteria/gnbac/parahemolyticus.htm) ..................... 13 Hình 2.5 Cấu trúc và các tác nhân độc lực của V. parahaemolyticus (Wang et al., 2015) .......................................................................................................................... 13 Hình 2.6 Cấu trúc của độc tố Cry của B. thuringiensis (Lin et al., 2017).................. 16 Hình 2.7 Cấu trúc của các độc tố PirA và PirB của V. parahaemolyticus (Lin et al., 2017) .......................................................................................................................... 16 Hình 2.8 Hình thái vi khuẩn B. subtilis 168 dưới kính hiển vi điện tử (Zweers et al., 2008) .......................................................................................................................... 19 Hình 2.9 Cấu trúc của Subtilosin A (Abriouel et al., 2011)....................................... 33 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu của luận án ..................................................................... 36 Hình 3.2 Quy trình phát hiện các gen độc tố của các chủng V. parahaemolyticus .... 38 Hình 3.3. Hình thái các loài Vibrio trên môi trường CHROMagar (CHROMagar, Paris, France).............................................................................................................. 38 Hình 4.1: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio phân lập tại Bạc lieu và Cà Mau ...... 55 Hình 4.2 Kết quả PCR khuếch đại gen toxR từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 57 Hình 4.3 Kết quả PCR khuếch đại gen tdh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ........ 59 Hình 4.4 Kết quả PCR khuếch đại gen trh từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ......... 59 Hình 4.5 Kết quả PCR khuếch đại gen pirA từ 31 chủng Vibrio phân lập được. ...... 60 Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen pirB từ 31 chủng Vibrio phân lập được ....... 61 xi
Hình 4.7 Kết quả điện di lại sản phẩm PCR khuếch đại gen pirB từ các mẫu BDB11.1v (19); CRK1.2v (27); BĐB1.4v (31) ......................................................... 61 Hình 4.8: Hình khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus phân lập tại Bạc Liêu, Sóc Trăng và Cà Mau ....................................................................................................................... 66 Hình 4.9 Vòng kháng khuẩn của 6 chủng BRB2.1, BĐK2.3, BNK 6.1, BRK4.4, BNK7.1, BĐB11.1 trên đĩa thạch với vi khuẩn kiểm định là chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 68 Hình 4.10 Vòng ức chế vi sinh vật kiểm định (D-d) của 6 chủng nghi là Bacillus có hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. .................................................................................................................................... 68 Hình 4.11 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh protease của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường thạch SM. ..................................................................... 69 Hình 4.12 Khả năng sinh protease của tập hợp 30 chủng nghi là Bacillus ................ 69 Hình 4.13 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh amylase của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường Starch Agar. .................................................................. 70 Hình 4.14 Khả năng sinh amylase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................. 70 Hình 4.15 Hình ảnh sàng lọc hoạt tính sinh cellulose của một số chủng nghi là Bacillus sp. trên môi trường CMC. ............................................................................ 71 Hình 4.16 Khả năng sinh cellulase của 30 chủng nghi là Bacillus ............................ 71 Hình 4.17 Kết quả PCR khuếch đại gen spaS và sboA từ chủng BRB2.1 ................. 73 Hình 4.18 Kết quả sàng lọc đoạn gen sboA trong vector pJET1.2............................. 74 Hình 4.19 Cây phả hệ trình tự axít amin subtilosin A của chủng Bacillus BRB 2.1 và 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 75 Hình 4.20 So sánh đối chiếu trình tự axít amin subtilosin A của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................. 76 Hình 4.21 Cây phả hệ trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 và 10 chủng tham chiếu. ................................................................................................................. 77 Hình 4.22 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide gen sboA của chủng BRB2.1 với 10 chủng tham chiếu. ...................................................................................................... 78 Hình 4.23 Cây phát sinh chủng loại của 26 chủng Bacillus với các chủng tham chiếu dựa trên trình tự 16S rDNA........................................................................................ 79 Hình 4.24 Kết quả khuếch đại bằng PCR các vùng gen ptA (A); rpoD (B); ilvD (C); glpF (D); pycA (E); purH (F); tpiA (G)...................................................................... 80 Hình 4.25 Cây phát sinh chủng loại dựa trên kết quả phân tích MLST của 26 chủng Bacillus....................................................................................................................... 83 Hình 4.26 Mô gan tụy của tôm thẻ chân trắng khi lây nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BNB3.1v (A) và BĐB1.4v (B), độ phóng đại 200X. ................... 89 Hình 4.27 Tương quan giữa mật độ cảm nhiễm của chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v và tỉ lệ tôm chết (tính theo giá trị probit) ................................................... 90 Hình 4.28 Mô gan tụy của TTCT 24 giờ sau cảm nhiễm với chủng V. parahaemolyticus BĐB1.4v ....................................................................................... 91 Hình 4.29 Tế bào gan tụy tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) .............. 95 độ phóng đại 200X ..................................................................................................... 95 xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT AHPND Acute Hepatopancreatic Bệnh hoại tử gan tụy cấp Necrosis Disease BHI Brain heart infusion Môi trường canh thang não – tim BNNPTNT Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn CMC Carboxymethyl cellulose Môi trường CMC CFU Colony forming unit Khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic acid Axid nucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan EHP Enterocytozoon Hepatopenaei Vi bào tử trùng EMS Early Mortality Syndromy Hội chứng tôm chết sớm ĐC Đối chứng ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO Food and Agriculture Tổ chức Nông Lương Thế Organization of the United giới Nations IHHNV Infectious hypodermal and Vi rút gây bệnh hoại tử cơ hematopoietic necrosis virus quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô IMNV Infectious myonecrosis virus Vi rút gây bệnh hoại tử cơ LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic LB Luria-Bertani broth Môi trường LB MLST Multi-locus Sequence Typing Kỹ thuật MLST MRS de Man, Rogosa and Sharpe Môi trường MRS agar NA Nutrient Agar Môi trường thạch dinh dưỡng xiii
NB Nutrien Broth Canh trường dinh dưỡng NCBI National Center for Trung tâm Quốc gia về Biotechnology Information Thông tin Công nghệ Sinh học NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới NT Nghiệm thức PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn Polymorphism cắt RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic SBO Subtilosin Môi trường SM Skim milk medium Môi trường sữa gầy TCBS Thiosulfate-Citrate Bile- Môi trường TCBS Sucrose agar TDH Thermostable Direct Độc tố TDH Hemolysin TRH TDH Related Hemolysin Độc tố TRH TLH Thermolabile Hemolysin Độc tố TLH TSB Trypto-casein soy broth Môi trường TSB TSV Taura syndrome virus Vi rút gây hội chứng Taura TTCT Tôm thẻ chân trắng VASEP Vietnam Association of Hiệp hội Chế biến và Xuất Seafood Exporters and khẩu Thủy sản Việt Nam Producers WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới WSSV White spot syndrome virus Vi rút gây bệnh đốm trắng YHV Yellow head virus Vi rút gây bệnh đầu vàng pirA Photorhabdus insect-related Gen mã hóa độc tố liên toxin – like gene A quan Photorhabdus A pirB Photorhabdus insect-related Gen mã hóa độc tố liên toxin – like gene B quan Photorhbdus B xiv
toxR Cholera toxin transcriptional Gen mã hóa hoạt hóa phiên activator gene mã độc tố tả tdh Thermostable direct Gen mã hóa hemolysin trực hemolysin gene tiếp bền nhiệt trh TDH-related hemolysin gene Gen mã hóa hemolysin liên quan TDH xv
Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi tôm nước lợ ở quy mô công nghiệp hiện đang phát triển rất mạnh ở Đông Nam Á, Nam Á và Châu Mỹ La tinh. Các loài tôm nước lợ được nuôi công nghiệp nhiều nhất là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon). Nuôi tôm nước lợ công nghiệp là lĩnh vực kinh tế mũi nhọn, góp phần quan trọng trong tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta, đưa Việt Nam vào nhóm các quốc gia xuất khẩu thủy sản đứng đầu trên thế giới. Năm 2017 cả nước có diện tích nuôi tôm nước lợ là 721.100 ha, đạt sản lượng 701.000 tấn. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm ưu thế về nuôi tôm nước lợ, với hơn 91,8% về diện tích và 82,5% sản lượng thu hoạch so với cả nước (Tổng cục thủy sản, 2018). Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2012, nguồn nguyên liệu tôm nuôi nước lợ cho xuất khẩu thiếu hụt nghiêm trọng, do dịch bệnh ở khu vực ĐBSCL; trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndromy - EMS) (Lightner et al., 2012) là nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 2010, AHPND bắt đầu xuất hiện tại vùng ĐBSCL. Đến năm 2011, bệnh này bùng phát thành dịch tôm trên diện rộng, gây thiệt hại trên 97.000 ha tập trung ở các tỉnh: Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre. Năm 2012 dịch bệnh bùng phát thêm các tỉnh Trà Vinh, Kiên Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Theo báo cáo thống kê của Tổng cục Thủy sản, năm 2012 diện tích tôm nuôi nước lợ bị AHPND là 46.093 ha, chiếm 45,7% diện tích tôm nuôi bị bệnh. Trong năm 2017 theo báo cáo của Cục Thú Y, trong cả nước tổng diện tích tôm nuôi thiệt hại do AHPND là 6.793 ha, chiếm hơn 17,9 % tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh (Báo cáo tổng kết 2017, Cục Thú Y). Tháng 5/2013, nhóm nghiên cứu của GS. Lightner (Đại học Arizona) đã công bố kết quả xác định tác nhân gây bệnh của hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tôm chính là một chủng vi khuẩn thuộc loài V. parahaemolyticus, chủng Vibrio này bị nhiễm thể thực khuẩn (phage) tiết ra các độc tố gây chết tôm (Tran et al., 2013). Ngày 12/6/2013, tại Sóc Trăng, Tổng cục Thủy sản đã đưa ra những kết luận về tác nhân gây AHPND là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (chủng V. parahaemolyticus có mang phage, và có thể do các loài Vibrio khác). Bên cạnh 1
đó, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nguồn gốc gây bệnh do vi khuẩn ở tôm nuôi chủ yếu do vi khuẩn Vibrio gây nên. Vi khuẩn Vibrio có thể làm chết ấu trùng tôm, chết tôm giống và tôm trưởng thành, gây thiệt hại đáng kể trong nghề nuôi tôm công nghiệp. Để khống chế dịch bệnh ở tôm nuôi, hạn chế tác động của AHPND ở tôm nuôi do nhóm vi khuẩn Vibrio, cần thiết phải nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ sinh học, kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học hữu hiệu để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm công nghiệp. Một số chủng Bacillus đã được áp dụng thành công trong chế phẩm sinh học, ví dụ, chủng B. subtilis UTM 126 có khả năng sinh chất kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus (Balcázar et al., 2007), hay hỗn hợp hai chủng B. subtilis L10 và G1 trong thức ăn giúp tôm tăng trưởng nhanh hơn 1,5 lần và giúp tăng khả năng đề kháng với V. harveyi thông qua việc kích hoạt hệ thống miễn dịch của tôm (Zokaeifar et al., 2012). Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong nuôi tôm công nghiệp” được thực hiện nhằm tìm kiếm giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus, hạn chế dịch AHPND, đóng góp các giải pháp nuôi tôm công nghiệp hiệu quả và bền vững. 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu các giải pháp hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhằm kiểm soát dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập, lựa chọn và đánh giá các chủng Bacillus sp. đối kháng được vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. - Đánh giá và xác định được đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. trong ao nuôi tôm sú/tôm thẻ thâm canh. 1.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập các chủng V. parahaemolyticus từ ao nuôi tôm công nghiệp và nghiên cứu về các gen độc lực ở các chủng Vibrio sp. bằng PCR - Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp. 2
- Phân lập các chủng Bacillus sp. từ ao nuôi tôm công nghiệp và đánh giá tính đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus, khả năng sinh enzyme thủy phân của các chủng phân lập được và xác định gen mã hóa bacteriocin ở chủng có hoạt tính đối kháng cao. - Xác định đa dạng di truyền của nhóm Bacillus sp. trong ao nuôi tôm công nghiệp. - Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, độ mặn) đến sự phát triển của các chủng Bacillus sp. có hoạt tính đối kháng cao. - Thử nghiệm khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng (L. vannamei) của vi khuẩn Bacillus sp. ở qui mô phòng thí nghiệm. 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu Kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở khoa học và thực tiễn về đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. và khả năng đối kháng của Bacillus sp. đối với V. parahaemolyticus trong ao nuôi tôm nước lợ công nghiệp; tìm kiếm các giải pháp ức chế sự phát triển V. parahaemolyticus gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp trong nuôi tôm công nghiệp. Kết quả của luận án góp phần vào các giải pháp nuôi tôm công nghiệp bền vững theo hướng phòng chống bệnh Hoại tử gan tụy cấp bằng giải pháp sinh học. 1.5 Tính mới của luận án: Luận án đã phân lập được hai chủng B. subtilis BRB2.1 và B. siamensis BĐK2.3 có khả năng đối kháng mạnh với V. parahaemolyticus bao gồm cả chủng gây AHPND. Lần đầu tiên luận án ứng dụng thành công phương pháp MLST để phân loại Bacillus sp. 1.6 Thời gian thực hiện Từ tháng 9/2013 đến 9/2017 3