Luận án Tiến sĩ ngành Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:164

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm men của các nhà máy sản xuất bia bằng phương pháp chiếu xạ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ ngành Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thành Long NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TAN TRONG NƢỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ BÃ MEN BIA LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thành Long NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TAN TRONG NƢỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ BÃ MEN BIA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Lê Quang Luân 2. PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn Thành phố Hồ Chí Minh – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Thành Long ii
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến PGS.TS. Lê Quang Luân và PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và góp ý kiến cho luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - Quý Thầy, Cô Học viện Khoa học và Công nghệ. - Quý Thầy, Cô Hội đồng Khoa học, Viện Sinh học Nhiệt đới. - Quý Thầy, Cô Viện CNSH và Môi trường, Trường ĐH Nha Trang. - Các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. - Bộ Khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ kinh phí, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí và cơ sở vật chất thí nghiệm, Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành nghiên cứu này. - Trân trọng cảm ơn gia đình, các đồng nghiệp và bạn bè, những người luôn hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tác giả luận án Nguyễn Thành Long iii
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... II LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... III MỤC LỤC ............................................................................................................... IV DANH MỤC BẢNG ..............................................................................................VII DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ IX DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................XII TÓM TẮT ............................................................................................................ XIII SUMMAY ............................................................................................................ XVI MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................6 1.1. Giới thiệu tổng quan về β-glucan.........................................................................6 1.1.1. Nguồn thu nhận β-glucan ..................................................................................6 1.1.2. Cấu trúc của β-glucan .......................................................................................7 1.2. Sơ lược về nấm men Saccharomyces...................................................................8 1.3. Phương pháp thu nhận thành tế bào từ nấm men bia Saccharomyces................9 1.3.1. Phương pháp vật lý .........................................................................................10 1.3.2. Phương pháp hóa học .....................................................................................11 1.3.3. Phương pháp sinh học.....................................................................................11 1.4. Phương pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men bia Saccharomyces ... 12 1.5. Các phương pháp cắt mạch β-glucan ...................................................................... 13 1.5.1. Phương pháp hóa học.....................................................................................14 1.5.2. Phương pháp sinh học.....................................................................................14 1.5.3. Phương pháp chiếu xạ.....................................................................................14 1.6. Hoạt tính sinh học của β-glucan.........................................................................19 1.6.1. Tăng cường khả năng miễn dịch .....................................................................19 1.6.2. Chống ung thư .................................................................................................20 1.6.3. Hạ mỡ máu và đường huyết ............................................................................21 1.6.4. Chống oxi hóa và bảo vệ gan ..........................................................................23 1.7. Ứng dụng của β-glucan………………………………………………………..25 1.8. Ứng dụng của β-glucan Mw thấp……………………………………………..28 iv
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................31 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu……………………………………….31 2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................31 2.1.2. Thiết bị chính...................................................................................................32 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu...............................................................33 2.2.1. Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia ...............................................33 2.2.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 ...............37 2.2.3. Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ ...............................................................................................................................39 2.2.4. Thiết lập qui trình chế tạo -glucan có Mw thấp tan trong nước trongkhoảng liều xạ thấp dưới 100 kGy .........................................................................................47 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................49 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................50 3.1. Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia...........................................50 3.1.1. Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy sản xuất bia ...................50 3.1.2. Tách và thu nhận thành tế bào nấm men ........................................................51 3.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết β-glucan từ ................ thành tế bào nấm men Saccharomyces .....................................................................52 3.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ................................................62 3.2.1. Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp ........................... chiếu xạ β-glucan ......................................................................................................62 3.2.2. Sự suy giảm khối lượng phân tử......................................................................64 3.2.3. Phân tích phổ UV ............................................................................................65 3.2.4. Phân tích phổ FTIR .........................................................................................66 3.2.5. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C ..........................................68 3.2.6. Phân tích hàm lượng β-glucan ........................................................................69 3.3. Hoạt tính sinh học của β-glucan tan nước chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ ............................................................................................................................. 70 3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro in vitro .......................................................................................................................70 3.3.2. Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo .............71 3.3.3. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến các chỉ số miễn dịch ở chuột .............75 v
3.3.4. Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo trên chuột .......................................................................................................78 3.3.5. Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn dịch ở gà Lương phượng.......................................................................................................................90 3.4. Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nước trong khoảng liều xạ thấp.......................................................................................................................94 3.4.1. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện pH khác nhau ..94 3.4.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện hiệu chỉnh pH và có H2O2 ......................................................................................................................99 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................106 4.1. Kết luận............................................................................................................106 4.2. Đề nghị.............................................................................................................107 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................115 PHỤ LỤC 1 ............................................................................................................116 PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................119 PHỤ LỤC 3 ............................................................................................................120 PHỤ LỤC 4 ............................................................................................................121 1. Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro theo phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH .............................................................................. 121 2. Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo......................122 3. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến các chỉ số miễn dịch ở chuột.................125 4. Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo trên chuột .......................................................................................................128 5. Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn dịch ở gà Lương phượng ………………………………………………………………………….141 vi
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc, nguồn thu nhận và hoạt tính của β-glucan .................................. 6 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ có Mw khác nhau lên chỉ số AST, ALT trong máu chuột gây tổn thương gan ....................41 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ số về sinh hóa, công thức máu và miễn dịch ở chuột khi cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ theo các liều khác nhau.....41 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ số sinh hóa trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm khi cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ có Mw khác nhau ……………………………………………………………………43 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu ứng tăng trưởng và kích kháng bệnh ở gà lương phượng khi cho ăn bổ sung β-glucan chiếu xạ ở các liều khác nhau .....45 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan ......52 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan ...........53 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan .....54 Bảng 3.4.Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan .....................................................................................................................55 Bảng 3.5. Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mô 500 lít/mẻ...................................................................................................................56 Bảng 3.6. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết .....................................57 Bảng 3.7. Các đỉnh các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan .........................60 Bảng 3.8. Kết quả phân tính hàm lượng các loại glucan trong mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa ...........................................................................................69 Bảng 3.9. Số lượng hồng cầu, bạch cầu tổng số, lympho bào và bạch cầu trung tính trong máu chuột khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ........76 Bảng 3.10. Thể trọng 2 nhóm chuột sau 8 tuần nuôi theo chế độ dinh dưỡng khác nhau...................................................................................................................78 Bảng 3.11. Một số chỉ số sinh hóa của chuột sau 8 tuần nuôi ..................................79 Bảng 3.12. Trọng lượng chuột trước và sau 20 ngày cho uống β-glucan có Mw khác nhau ...................................................................................................................80 Bảng 3.13. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 20 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau .................................................................81 vii
Bảng 3.14. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 40 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ...............................................................................82 Bảng 3.15. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 60 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ...............................................................................83 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên sự tăng trọng và chất lượng thịt ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung ....................................................90 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên các chỉ số miễn dịch ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung..................................................................................92 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của (1,3)/(1,4)- và (1,3)/(1,6)-β-glucan theo Volman và ctv ......7 Hình 1.2. Cấu trúc thành tế bào nấm men Saccharomyces ....................................... 9 Hình 2.1. Dịch bã men bia sử dụng trong nghiên cứu..............................................31 Hình 2.2. Bộ KIT K-YBGL xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan ........................... của Megazyme ..........................................................................................................31 Hình 2.3. Sơ đồ tách chiết từ nguyên liệu bã tế bào nấm men bia β-glucan ............34 Hình 2.4. Thiết kế thí nghiệm mô hình tổn thương gan do CCl4 .............................40 Hình 2.5. Mẫu β-glucan tan nước có Mw khác nhau .................................................41 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm theo dõi khả năng giảm mỡ máu ở chuột .....................44 Hình 2.7. Quy trình lấy máu chuột xét nghiệm chỉ số sinh hoá ...............................45 Hình 2.8. Lấy máu trên gà để tiến hành xét nghiệm ................................................ 46 Hình 3.1. Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau khi rửa (C) và ảnh SEM tế bào nấm men sau khi rửa (D)...............................................50 Hình 3.2. Sản phẩm thành tế bào nấm men trước (A) và sau khi ly tâm (B) và ảnh SEM (C) .........................................................................................................51 Hình 3.3. Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ thành tế bào nấm men sau khi thu nhận (A), sau khi sấy khô ở 60oC (B) và ảnh SEM (C) ......................................57 Hình 3.4. Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm men bia và mẫu β-glucan chuẩn của hãng Sigma ...................................................................59 Hình 3.5. Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia quy mô 500 lít/mẻ .....................................................................................................61 Hình 3.6. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10% ở các liều xạ khác nhau .............................................................................................63 Hình 3.7. Sự suy giảm Mw của β-glucan tan theo liều xạ .......................................64 Hình 3.8. β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở các liều xạ khác nhau...................................................................................................................65 Hình 3.9. Phổ UV-vis β-glucan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ ......................66 Hình 3.10. Phổ IR của β-glucan chiếu xạ nồng độ 10% ở các liều xạ khác nhau ....67 Hình 3.11. Sự thay đổi tỷ lệ cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1)/cường độ đỉnh C-C (1040 cm-1) của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ ................................67 ix
Hình 3.12. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (a) và 13 C (b) của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa ..........................................................................................................68 Hình 3.13. Hoạt tính kháng oxi của β-glucan có Mw khác nhau ..............................71 Hình 3.14. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC(b) ở nhóm chuột thường và chuột gây độc gan (không tiêm CCl4) được cho uống β-glucan có Mw khác nhau .......................................................................................................72 Hình 3.15. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC (b) ở nhóm chuột thường và chuột gây độc gan (không tiêm CCl4) được cho uống β-glucan có Mw khác nhau ................................................................................75 Hình 3.16. Hàm lượng IgG (a) và IgM (b) trong trong máu chuột sau 28 ngày cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ..........................................................77 Hình 3.17. Nhóm chuột HFD (a) và ND (b) sau 8 tuần nuôi ...................................79 Hình 3.18. Mức thay đổi chỉ số cholesterol trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan.........................................84 Hình 3.19. Mức thay đổi chỉ số triglyceride trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan.........................................85 Hình 3.20. Mức thay đổi chỉ số LDL trong máu chuột so với ..................................... trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột thường ............ không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan. .............87 Hình 3.21. Mức thay đổi chỉ số glucose trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan.........................................87 Hình 3.22. Ảnh hưởng của β-glucan có Mw khác nhau đến quầy thịt ở gà .............91 Hình 3.23. Độ trương nước bảo hòa và độ tan của mẫu β-glucan ở điều kiện pH khác nhau.............................................................................................................95 Hình 3.24. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10% ở điều kiện pH khác nhau ..................................................................96 Hình 3.25. Sự suy giảm Mw của β-glucan khi liều xạ ở các điều kiện pH khác nhau...................................................................................................................97 x
Hình 3.26. Phổ IR của β-glucan tan trong nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện pH khác nhau .............................................................................................98 Hình 3.27. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ khác nhau ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2 .............................100 Hình 3.28. Sự suy giảm Mw của β-glucan khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ khác nhau ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2 ..........................................................102 Hình 3.29. Phổ IR của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện pH khác nhau và kết hợp xử lý H2O2 ......................................................................102 Hình 3.30. Giản đồ XRD của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện pH khác nhau và kết hợp xử lý H2O2 ......................................................104 Hình 3.31. Sơ đồ khối quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nước bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện hiệu chỉnh pH và có H2O2 quy mô 1 lít/mẻ…106 xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ABTS Gốc tự do 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) APAP Thuốc giảm đau Acetaminophen ALF Peptide kháng khuẩn (anti-lipopolysaccharide factors) ALT Enzyme Alanin amino transferase AST Enzyme Aspartate amino transferase Da Đơn vị khối lượng phân tử (Dalton) Dp Mức độ polymer hóa (Degree of polymerization) DPPH Gốc từ do 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl ĐC Đối chứng ELISA Một loại kỹ thuật sinh hóa (Enzyme linked immunosorbent assay) FCR Hệ số tiêu tốn thức ăn (Feed conversion rate) FTIR Quang phổ hồng ngoại (Fourier-transform infrared spectroscopy) GPC Sắc ký gel thấm qua (Gel permeation chromatography) HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) IgG Kháng thể globulin G (Immunoglobulin G) IgM Kháng thể globulin M (Immunoglobulin M) LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low density lipoprotein) Mw Khối lượng phân tử ND Chế độ ăn bình thường (Normal diet) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) NT Nghiệm thức SVĐC So với đối chứng TNF Yêu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TLBQ Trọng lượng bình quân XRD Nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) UV Vùng tử ngoại (Ultra-violet) xii
TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học Nhiệt đới. Mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình thu nhận chế phẩm β-glucan từ bã thải nấm men bia của nhà máy sản xuất bia; xác định được cấu trúc đặc trưng c ng như một số đặc tính hiệu ứng sinh học in vitro và in vivo của chế phẩm β-glucan sau khi chiếu xạ; và thiết lập được quy trình công nghệ tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước có Mw thấp phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức năng và chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi. Để đạt được mục tiêu nói trên, đề tài tiến hành thực hiện 4 nội dung nghiên cứu như sau: (1) Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia; (2) Cắt mạch β- glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60; (3) Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ; (4) Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan có Mw thấp và tan nước bằng phương pháp chiếu xạ. Nội dung 1 gồm các thí nghiệm thu nhận thành tế bào nấm men bia phục vụ tách chiết β-glucan tổng số và xác định các đặc trưng cấu trúc của mẫu β-glucan sau khi tách chiết. Nội dung 2 với các thí nghiệm chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp tan trong nước ở các liều xạ khác nhau phục vụ xác định hiệu suất β-glucan Mw thấp tan trong nước tạo thành c ng như các đặc trưng cấu trúc của mẫu sau khi chiếu xạ. Nội dung 3 gồm các thí nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (hoạt tính kháng oxi hoá) và in vivo trên chuột (giải độc gan, hạ lipid và glucose máu, tăng cường yếu tố miễn dịch) và trên gà (tăng trọng và tăng cường miễn dịch). Nội dung 4 với các thì nghiệm chiếu xạ mẫu β-glucan ở các điều kiện pH khác nhau và ứng dụng hiệu ứng cộng hợp (kết hợp xử lý với H2O2) c ng như xác định hiệu suất các đặc trưng cấu trúc nhằm xây dựng quy trình chế tạo β-glucan tan nước có Mw thấp phù hợp và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ. Với các nội dung nói trên, kết quả đạt được của đề tài có thể tóm tắt như sau: - Đã hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men từ bã men bia với sản phẩm β-glucan có độ tinh khiết cao (đạt khoảng 91,8%), có Mw > 64 kDa và có đặc trưng cấu trúc hầu như không khác biệt so với mẫu chuẩn cùng dạng của hãng Sigma. xiii
- Đã chế tạo được β-glucan tan nước có Mw thấp từ 11 - 50 kDa bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60. Việc gia tăng độ pH của mẫu β-glucan, đặc biệt khi xử lý kết hợp với 1% H2O2 đã làm gia tăng mạnh hiệu quả cắt mạch. Kết quả phân tích phổ FTIR, XRD và cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy các mẫu β- glucan tan nước có Mw thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có đặc trưng cấu hầu như không khác biệt so với mẫu β-glucan ban đầu. - β-glucan chiếu xạ có Mw thấp và tan nước có hoạt tính kháng oxi hoá cao và β-glucan có Mw càng thấp thì hoạt tính kháng oxi hoá càng cao. - Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy β-glucan chiếu xạ đã có khả năng bảo vệ gan chuột được gây độc gan bằng CCl4 (chỉ số AST và ALT trong máu chuột cho uống chế phẩm đều có xu hướng giảm dần khi Mw của β-glucan giảm) và chuột cho uống β-glucan có Mw thấp và tan nước có Mw~25 kDa đã giảm 68% chỉ số AST và 48% ALT so với chuột gây độc gan chỉ cho uống nước cất. Bên cạnh đó, chế phẩm này còn có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính và lympho bào c ng như yếu tố miễn dịch dịch thể IgG và IgM. Ngoài ra kết quả thử nghiệm trên chuột béo phì c ng cho thấy β-glucan có Mw~25 kDa là thích hợp cho mục đích làm giảm mỡ máu với khả năng làm giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 33% triglyceride, 39% lượng LDL và 34% lượng glucose sau thử nghiệm 20 ngày. Các chỉ số này tiếp tục giảm khi kéo dài quá trình thử nghiệm lên tới 40 ngày. Sau 20 ngày ngừng sử dụng chế phẩm, hiệu quả của chế phẩm vẫn khá cao với mức giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 41% triglyceride, 40% lượng LDL và 36% lượng glucose trong máu chuột. - Ở gà, khi cho ăn bổ sung chế phẩm β-glucan chiếu xạ có Mw thấp đã có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ nuôi sống và hoạt tính miễn dịch ở gà. So với đối chứng, β-glucan có Mw~25 kDa đã có hiệu ứng tối ưu về mức độ tăng trọng bình quân (tăng 23,63%); tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) và gia tăng chất lượng quầy thịt, bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính và lympho bào; tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh newcastle. - Đã xây dựng thành công quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước có Mw ~25 kDa và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2. Chế phẩm β-glucan Mw thấp tan trong nước chế tạo từ quy trình nói trên xiv
hứa hẹn là hoạt chất bổ sung tốt, hiệu quả, an toàn và đáp ứng nhu cầu nuôi gà sạch không sử dụng kháng sinh c ng như có triển vọng ứng dụng cao cho mục đích làm thực phẩm chức năng nhằm tăng cường miễn dịch c ng như hỗ trợ điều trị các bệnh mỡ máu, chống oxi hóa và giải độc gan. xv
SUMMAY The Thesis entitled “Study on the application of gamma Co-60 irradiation for preparation of bioactive water-soluble low molecular weight β-glucan product from spent brewer’s yeast” has been carried out at Biotechnology Center of Ho Chi Minh City and Institute of Tropical Biology from 11/2015 to 5/2019. The aim of the thesis is to improve the process for preparation of β-glucan product from spent brewer’s yeast; to evaluate the structural characteristics and the in vitro and in vivo biological activities of radiation degraded β-glucan samples; and to build up the process for producing the water-soluble low molecular weight (Mw) β-glucan product with a suitable Mw for application as functional food and additive feed. This study consists of 4 contents such as: (1) Extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast; (2) Degradation of β-glucans by gamma Co-60 irradiation method; (3) Investigation of biological activities of radiation-degraded β-glucans; and (4) built-up of the process for producing the water-soluble low Mw β-glucans product by irradiation method. The fist covers studies on collection of Saccharomyces yeast cell walls for extraction of β-glucans and characterization of the structural properties of extracted β-glucans product. The second includes the experiments of preparation of water-soluble low Mw β-glucan by irradiation at various doses in order to determine the water-soluble yields and structural characteristics of irradiated samples. The third involves bioactivity tests in vitro condition (antioxidant activity) and in vivo on mice (the hepatoprotective, reduction of blood lipid and glucose and immune-stimulation activity) and on broiler (the weight gain and immune-stimulation activity). The fourth describes the experiments for determination of the water-soluble yields and structural characteristics of samples irradiated at various pH conditions and in combination with H2O2 (synergic effect) aiming to build up the process for producing the water-soluble low Mw β- glucan product by irradiation method. With the above research contents, the obtained results in this dissertation can be summaried as bellow: - The process for extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast was successfully improved to produce β-glucans product with high purity (91.8 β-glucan xvi
in content), Mw > 64 kDa and its structural characteristics almost the same as those of the standard β-glucans from Simma Ltd. - The low Mw (11 - 50 kDa) and water-soluble β-glucans were successfully prepared by gamma Co-60 irradiation method. The increase of pH conditions, especially, the combined treatment with 1% H2O2 strongly enhanced the degradation yield. The results from FTIR, XRD and NMR spectra indicated that the structural characters of water-soluble low Mw β-glucans prepared by irradiation method were also most similar to those of unirradiated β-glucan. - The water-soluble low Mw β-glucan showed a high antioxidant activity by radical DPPH and the lower Mw of water-soluble β-glucan displayed the higher antioxidant activity. - The results from test on mine demonstrated that the irradiated β-glucan showed high hepatoprotective activities in CCl4-induced hepatotoxic mice (the decrease of ALT (Alanine-aminotransferase) and AST (Aspartate-aminotransferase) indexes in blood of the tested mice were directly proportional to the decrease of Mw of the supplemented irradiated β-glucans. The supplementation of water-soluble β- glucan with Mw~25 kDa remarkably reduced AST (68%) and ALT (48%) indexes in blood of CCl4-induced hepatotoxic mice compared to those in blood of mice induced hepatotoxic supplied with only distilled water. On the other hand, the supplementation of this water-soluble low Mw β-glucan also caused a significantly increase both of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and human immunity indexes (IgG and IgM) in blood of tested mice. In addition to, the test on obese induced mice also pointed out that the water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa decreased the levels of total cholesterol (38%), triglyceride (33%), LDL-cholesterol (39%) and glucose (34%) in blood of tested mice after 20 days of administration. These indexes were further reduced after 40 days of administration with the water-soluble low Mw β-glucan product. Furthermore, after stopping supplementing with water-soluble low Mw β- glucan, total cholesterol, triglyceride, LDL-cholesterol and glucose in blood of tested mice were still lower than those in blood of the unsupplemmented control ones about 38, 41 and 41%, respectively. xvii
- In broiler, the supplementation with irradiated β-glucan with low Mw enhanced the growth prmotion, suvival rate and immune activities. The supplementation with water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa not only increased the average body weight (23.6%), survival rate (54.5%) and quality of meat but also stimulated the enhacement of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and specific immune components (antibodies related to anti-newcastle disease virus, anti-infectious bursal disease virus and anti- infectious bronchitis virus). - The process for producting the water-soluble β-glucan product with Mw~25 kDa and high bio-acivity by irradiation incombination with H2O2 method was successfully built up. The water-soluble low Mw β-glucan product prepared by this process is promising additive feed for production of clean chicken meat without antibiotic and promising ingredient that can be used in nutraceutical food for therapeutics of diabetic, dyslipidemia and hematoprotective as well. xviii
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Trong hơn hai mươi năm qua, β-glucan đã được nghiên cứu về các tác dụng sinh học có lợi đối với động vật có vú và người. Nó đã được biết đến rộng rãi trong cộng đồng khoa học như là chất kích thích miễn dịch rất mạnh, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da, kháng ký sinh trùng gây bệnh, kích thích quá trình tạo máu, chống đông máu, giúp giảm tỷ lệ đột biến. β-glucan đã được chứng minh là có tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và hạn chế sự phát triển của khối u ở người do vậy nó có hoạt tính phòng chống rất mạnh mẽ khối u lành tính và ác tính. Polymer tự nhiên này còn có tác dụng giúp nâng cao hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân ung thư, rất hiệu quả để làm chất bổ trợ trong điều trị ung thư, làm giảm tác dụng phụ của hóa trị ở những bệnh nhân ung thư và có tác dụng trong phòng ngừa ung thư kết ruột, v.v. Trong chăn nuôi, β-glucan có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch, giúp vật nuôi kháng được một số bệnh c ng như khả năng phục hồi nhanh khi nhiễm phải một số tác nhân gây bệnh, từ đó làm tăng chất lượng sản xuất vật nuôi mà không cần phải dùng đến kháng sinh. Chính vì vậy β-glucan giúp tăng giá trị sản xuất, tạo ra sản phẩm thịt sạch, chất lượng cao, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và môi trường, đồng thời nhằm hướng đến mục tiêu phát triển bền vững. Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao và độ hòa tan thấp nên rất khó được hấp thu c ng như gây ra một số trở ngại để áp dụng rộng rãi trên quy mô công nghiệp. Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp sẽ cho hiệu ứng tốt hơn β-glucan có Mw cao và β-glucan có Mw dưới 30 kDa và tan được trong nước đã cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao hơn so với các β-glucan có Mw cao. β-glucan Mw thấp là những phân đoạn β-glucan dễ tan trong nước nên dễ dàng được hấp thu và các hoạt tính sinh học được sử dụng một cách hiệu quả hơn. Để có được β-glucan Mw thấp thì cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ đã được chứng minh là phương pháp rất hiệu quả. Với những ưu điểm nổi bật như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có thể điều chỉnh liều xạ để thu được β- glucan có Mw thấp như mong muốn, thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao, không 1