Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor lên khả năng tích lũy solsodine ở tế bào in vitro của cây cà gai leo (solanum hainanense hance)

Theo số liệu thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 50 tấn các loại dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền, làm nguyên<br /> liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được<br /> khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Khối lượng<br /> dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa<br /> vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu<br /> khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con<br /> số thống kê cụ thể [10].<br /> Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) còn gọi là cà quạnh, cà gai dây,<br /> cà quýnh, cà vạnh, chẻ nan (Tày), b’rongoon (Ba Na), có tên khoa học khác là<br /> Solanum procumben Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae) [18]. Trong thành phần hóa<br /> học của cà gai leo, solasodine là hợp chất ch nh, đ y là một steroid alkaloid được<br /> t m thấy ở khoảng 250 loài c y khác nhau thuộc họ Cà, đ c biệt là chi Solanum,<br /> ch ng thư ng tồn tại ở dạng glycoside. Các nghiên c u trước đ y cho thấy<br /> solasodine có hoạt t nh kháng viêm và bảo vệ gan, chống lại tế bào ung thư (đ c<br /> biệt là ngăn ngừa ung thư da). Solasodine còn là tiền chất để sản xuất các loại<br /> corticosteroid, testosteroid và thuốc tránh thai. Ngoài ra, ch ng còn có tác dụng<br /> chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan [14]. Gần đ y, nghiên c u cho thấy solasodine<br /> còn có tác dụng bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở ngư i như Herpes simplex,<br /> H. zoster và H. genitalis (Chating và cs), bảo vệ chuột chống lại sự xâm nhiễm của<br /> vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol trong máu… [64].<br /> Tuy nhiên, từ trước đến nay cà gai leo được khai thác chủ yếu từ nguồn<br /> hoang dại, ch ng thư ng phân tán manh múm và chất lượng không đồng đều, trữ<br /> lượng có giới hạn và hiện đang cạn kiệt do bị thu hái bừa bãi. Vì thế, nguồn nguyên<br /> liệu này không đủ để đáp ng cho việc nghiên c u và điều trị.<br /> Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những lĩnh vực ng dụng đạt<br /> nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Phương pháp này với<br /> những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong th i<br /> 1<br /> <br /> gian ngắn, hàm lượng hợp chất th cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy<br /> trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học<br /> trên quy mô công nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên [63].<br /> Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ<br /> vào hệ thống tế bào sống thì khởi động ho c cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC<br /> trong tế bào đó [65]. Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung<br /> elicitor vào môi trư ng nuôi cấy là phương th c để thu được các sản phẩm HCTC<br /> có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi<br /> sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong nuôi cấy tế bào vừa có thể rút<br /> ngắn th i gian lại đạt năng suất cao [42]. Nghiên c u nuôi cấy tế bào huyền phù có<br /> bổ sung elicitor đã được thực hiện thành công ở một số đối tượng như c y nh n s m<br /> (Panax ginseng) [60], [99], rau má (Centella asiatica) [57], giây dác (Cayratia<br /> trifolia) [87], sen tuyết (Saussurea medusa) [106], [112], Pueraria tuberosa [80].…<br /> Các elicitor thư ng được sử dụng trong các nghiên c u là methyl jasmonate<br /> (MeJA), salicylic acid (SA), dịch chiết nấm men (YE), jasmonic acid (JA), ethrel,<br /> chitosan... [57], [62], [65].<br /> Hiện nay đã có một số nghiên c u sản xuất glycoalkaloid toàn phần nói<br /> chung và solasodine nói riêng từ cây cà gai leo, tuy nhiên hiệu suất chưa cao.<br /> Nghiên c u khả năng t ch lũy glycoalkaloid toàn phần trong callus cà gai leo cho<br /> thấy hàm lượng đạt cao nhất 128,17 mg/g khối lượng khô sau 7 tuần nuôi cấy [56].<br /> Các tác giả cũng đã khảo sát khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo và<br /> kết quả cho thấy hàm lượng cao nhất thu được là 121,01 mg/g khối lượng khô sau 4<br /> tuần nuôi cấy [59]. Những nghiên c u này đều thu được kết quả là hàm lượng<br /> glycoalkaloid toàn phần hay solasodine trong callus và tế bào đều cao hơn so với<br /> cây tự nhiên, tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các elicitor thực vật có thể<br /> cải thiện được vấn đề này.<br /> Xuất phát từ đó, ch ng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ả<br /> số elicitor lên khả ă g<br /> <br /> ưởng c a một<br /> <br /> lũy sol sod e ở t bào in vitro c a cây cà gai leo<br /> <br /> (Solanum hainanense Hance).<br /> <br /> p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù<br /> <br /> tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự<br /> 2<br /> <br /> nhiên cho các nghiên c u trong lĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở<br /> cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế bào để ng dụng<br /> trong lĩnh vực dược phẩm sau này.<br /> <br /> Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế<br /> bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).<br /> g<br /> <br /> o<br /> <br /> Kết quả nghiên c u của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá<br /> trị về khả năng t ch lũy solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung<br /> các elicitor. Đồng th i luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên c u và<br /> giảng dạy về lĩnh vực sản xuất các hoạt chất sinh học bằng con đư ng nuôi cấy tế<br /> bào thực vật.<br /> Đề tài là hướng nghiên c u có tiềm năng ng dụng trong lĩnh vực sản xuất<br /> hoạt chất sinh học dùng làm dược liệu bằng nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào<br /> việc bảo vệ và chăm sóc s c khỏe cộng đồng.<br /> g<br /> <br /> gg<br /> <br /> l<br /> <br /> Đ y là một trong những công tr nh đầu tiên tại Việt Nam nghiên c u ảnh<br /> hưởng của một số elicitor lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong nuôi cấy tế<br /> bào cà gai leo. Kết quả của luận án là đáng tin cậy và có thể sử dụng để tiếp tục<br /> nghiên c u phát triển sản xuất solasodine ở quy mô lớn hơn.<br /> g<br /> <br /> ứ<br /> <br /> Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện in vitro tại Phòng thí<br /> nghiệm Hợp chất th cấp, Viện Tài nguyên, Môi trư ng và Công nghệ sinh học,<br /> Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014.<br /> <br /> 3<br /> <br /> C ươ g 1.<br /> <br /> C C<br /> <br /> 1.1.<br /> <br /> C<br /> <br /> C<br /> <br /> Ừ<br /> <br /> C<br /> <br /> C<br /> Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật là quá tr nh điều khiển sự phát sinh<br /> hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách r i trong điều kiện in vitro có định<br /> hướng thành những cấu trúc biệt hóa hay chưa biệt hóa của tế bào trên cơ sở tính<br /> toàn năng của tế bào thực vật [42].<br /> Nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng lớn trong việc cải thiện khả năng tổng<br /> hợp các HCTC có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không<br /> thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật ho c tổng hợp bằng phương pháp hóa<br /> học. Sự phát triển của các HCTC quan trọng trong thương mại là kết quả được<br /> mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên c u này. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào<br /> thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn<br /> lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy [64].<br /> Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các HCTC<br /> từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều HCTC được sản xuất trong suốt<br /> quá trình phân hóa tế bào, vì thế ch ng được tìm thấy trong các mô có khả năng<br /> ph n hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không<br /> xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất th cấp có khuynh hướng ngưng tạo<br /> thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi<br /> cấy huyền phù thư ng tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có<br /> sự tiếp xúc với môi trư ng khác các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện<br /> ở một m c độ nào đó trong khối để tạo thành các HCTC [7].<br /> Nuôi cấy tế bào thực vật sinh trưởng chậm hơn so với vi khuẩn, th i gian<br /> nh n đôi trong khoảng 24-72 gi . Sự khác nhau này dẫn đến việc phải sử dụng các<br /> điều kiện vô trùng tuyệt đối cho nuôi cấy tế bào thực vật. Thông thư ng, tế bào nuôi<br /> cấy không quang hợp, vì vậy phải bổ sung đư ng làm nguồn carbon. Đ y là nguồn<br /> năng lượng hiệu quả nhất để sản xuất HCTC. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào nhanh<br /> 4<br /> <br /> hơn so với nuôi cấy callus hay mô, cơ quan; thao tác dễ dàng và có khả năng tương<br /> thích với các thiết bị nuôi cấy tế bào sử dụng cho vi sinh vật [79].<br /> 1.1.1. C<br /> <br /> ươ g<br /> <br /> y<br /> <br /> o<br /> <br /> cv t<br /> <br /> 1.1.1.1. Nuôi cấy mẻ<br /> Nuôi cấy mẻ là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt th i gian nuôi cấy<br /> không thêm vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sinh khối hay sản phẩm<br /> cuối cùng của quá tr nh trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trư ng thay đổi<br /> theo th i gian, mật độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy<br /> mẻ được xem là một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo<br /> một số pha nhất định với những điều kiện đ c trưng [8].<br /> Trước khi nuôi cấy mẻ, cần thiết phải tiến hành cấy chuyển. Quá trình nuôi<br /> cấy đầu tiên trong b nh tam giác, sau đó tế bào nuôi cấy được đưa vào hệ lên men<br /> nhỏ, rồi cấy chuyển vào hệ lên men lớn hơn. C tiếp tục như vậy cho đến khi đạt<br /> được thể tích thích hợp. Điều kiện bên trong hệ lên men sẽ thay đổi trong một chu<br /> kỳ nuôi cấy mẻ, với sản phẩm và nồng độ tế bào tăng trong khi chất dinh dưỡng cạn<br /> kiệt dần. Nhưng không có thành phần nào được bổ sung vào trong chu kỳ nuôi cấy.<br /> Tất cả mẻ nuôi cấy sẽ được thu hồi khi sản phẩm th cấp đạt giá trị cực đại [8].<br /> Các bình ch a mẫu được đ t trên máy lắc với tốc độ 50-200 vòng/phút ho c<br /> có thể nuôi cấy trong hệ lên men có cánh khuấy và sục khí tạo thuận lợi cho sự trao<br /> đổi khí, sự lưu thông của môi trư ng dinh dưỡng trong b nh nuôi cũng như gia tăng<br /> sự tiếp xúc giữa tế bào nuôi cấy với môi trư ng. Trong đó, nuôi cấy dịch huyền phù<br /> ch a các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng ph n tán trong môi trư ng lỏng.<br /> Thư ng khởi đầu bằng cách đ t các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trư ng lỏng<br /> chuyển động (lắc ho c khuấy) [8].<br /> Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những<br /> chuyển động xoáy của môi trư ng. Sau một th i gian ngắn nuôi cấy, trong dịch<br /> huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào với k ch thước khác nhau, các<br /> mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền<br /> phù hoàn hảo, ch a tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. M c độ<br /> 5<br /> <br />