Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:262

Thêm vào BST

Báo xấu

76
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai chi Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại các tỉnh vùng ĐBSCL. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng ký sinh gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh đến loài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số ngành: 9620112 Cần Thơ, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số ngành: 9620112 Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN VĂN HAI Cần Thơ, 2018
LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án này trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: Con xin gửi hai đấng sinh thành và những người thân yêu nhất của con lòng biết ơn về những gì mà mọi người đã làm cho con, để con có đầy đủ điều kiện học tập và nghiên cứu. PGS. TS. Trần Văn Hai đã tận tình hướng dẫn định hướng, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có cơ hội thực hiện công trình nghiên cứu này. PGS. TS. Nguyễn Văn Huỳnh đã hướng dẫn thực hiện chuyên đề trong luận án Xin gởi lời cảm ơn quý Thầy, Cô và các anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã tận tình giảng dạy, chia sẻ những kiến thức quý báu, nhiệt tình hỗ trợ giúp tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này. Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Thanh Thủy bộ môn Di truyền - Giống nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn em trong việc xử lý thống kê thí nghiệm. Gửi lời cảm ơn đến em Lê Thị Thanh Tâm đã động viên giúp đỡ tinh thần tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện luận án. Gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên Tính, Trụ, Kiều, Duy Khoa, Sỷ, Giang, Tuấn, Hóa… làm việc tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học (NEDO) đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và tất cả những người đã từng giúp đỡ mà tôi chưa liệt kê ra hết trên trang cảm tạ này. Xin thành thật biết ơn Hội đồng bảo vệ luận văn và giáo viên phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quý báu để luận án được hoàn chỉnh. Chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Cần Thơ, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh HUỲNH HỮU ĐỨC ii
Huỳnh Hữu Đức - “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long” Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 9.62.01.12 Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Cần Thơ, 2013 - 2017 TÓM TẮT Luận án tập trung vào các nghiên cứu cơ bản về: (1) Thu thập và định danh các loài từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS - rDNA; (2) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã định danh được loài; (3) Bước đầu đánh giá hiệu lực của các chủng nấm trắng Beauveria trên sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) và các chủng nấm tím Paecilomyces trên rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm; (4) Đánh giá hiệu lực của hai chế phẩm nấm Beauveria và Paecilomyces ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng trên ruộng khoai lang và vườn mãng cầu xiêm tại Vĩnh Long. Nhằm thiết lập cơ sở dữ liệu cho các chủng nấm bản địa, cung cấp thông tin cơ bản cần thiết để chọn lựa chủng nấm có độc tính cao sử dụng trong quản lý phòng trừ dịch hại cây trồng. Kết quả phân lập và định danh đã xác định 16 chủng nấm thuộc loài Beauveria bassiana và 14 chủng nấm thuộc loài Paecilomyces javanicus ký sinh trên côn trùng gây hại cây trồng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Tản nấm của các chủng nấm B. bassiana nuôi cấy trên môi trường PDA thường có màu trắng hoặc màu trắng hơi ửng vàng khi thành thục. Các chủng nấm có đặc điểm chung bởi cuống bào tử đính mọc theo hình vòng xoắn và thành từng cụm dầy đặc của cành bào đài ngắn với một bào tử đơn có dạng hình trứng (2,61 - 2,97 x 2,35 - 2,72 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 - 2,24 μm). Đối với nấm P. javanicus màu sắc tản nấm thay đổi dần, ban đầu màu trắng sau đó chuyển sang màu kem rồi đến màu tím nhạt (xám tro) khi bào tử già, sự phân nhánh cuống bào tử đính dạng vòng không đều, mỗi vòng gồm 2 - 3 thể bình, bào tử đính có dạng hình thoi, đôi khi hình trụ. Kích thước 5,01 - 5,74 x 1,51 - 1,69 μm. Ngoài ra, kết quả phản ứng PCR với hai primer ITS4 và ITS5 đối với hai loài này đều cho sản phẩm PCR là những băng màu có kích thước 580 bp, giải trình tự so sánh mức độ tương đồng trình tự DNA vùng ITS-rDNA cho thấy các chủng nấm có sự tương đồng cao (96,6% đến 99,6%) so với những trình tự vùng ITS-rDNA của hai loài B. bassiana và P. javanicus đã công bố trên Genbank. iii
Đặc điểm sinh học của 16 chủng nấm B. bassiana và 14 chủng nấm P. javanicus cho thấy: Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm P. javanicus đạt trên 94% sau 20 GSKC sớm hơn so với các chủng nấm B. bassiana đạt trên 94% sau 24 GSKC. Môi trường SDAY3 và PDA luôn cho tốc độ phát triển đường kính tản nấm nhanh và cho mật số bào tử cao, ngoài ra chủng nấm P. javanicus còn phát triển tốt trên môi trường CDA. Thời gian để các chủng nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus cho mật số bào tử cao nhất là sau 14 NSKC và đạt mật số bào tử cao khoảng 107 - 108 bt/cm2. Nhiệt độ tối hảo cho nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus phát triển đồng thời tạo nhiều bào tử là từ 25o - 28oC. Khi nhiệt độ tăng lên cao trên 30oC thì cả hai loài nấm đều phát triển chậm lại hoặc không phát triển được. Bào tử các chủng nấm B. bassiana và các chủng nấm P. javanicus có khả năng sống sót sau khi tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ cao trong 8 giờ. Đa số thuốc hoá học trừ nấm bệnh có ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển và nẩy mầm của nấm B. bassiana và nấm P. javanicus ở nồng độ (LKC) và (2 x LKC). Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hiệu lực của các chủng nấm B. bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C. formicarius (Fabricius) và P. javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P.lilacinus (Cockerell) cho thấy các chủng nấm thuộc hai loài này đều có hiệu quả cao đối với ký chủ của chúng, đạt tỷ lệ ký sinh 90% sau 11 ngày chủng nhiễm. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B. bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C. formicarius (Fabricius) và chế phẩm P. javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P. lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN và nhà lưới thì cả hai chế phẩm đều đạt hiệu quả cao trên 80% sau 7 - 11 ngày phun chế phẩm với mật số bào tử chế phẩm từ 108 - 109 (bt/mL) và liều lượng chế phẩm từ 3,0 kg và 3,5 kg. Kết quả đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B. bassiana và P. javanicus trên diện hẹp ở điều kiện ngoài đồng ruộng cho thấy, khi phun 5 lần chế phẩm nấm B. bassiana để phòng trừ SKL và 3 lần chế phẩm P. javanicus để phòng trừ rệp sáp với liều lượng 3,0 kg/ha cho hiệu quả tương đương với biện pháp sử dụng thuốc hoá học theo nông dân. Vì vậy, các kết quả thu được trong nghiên cứu này là cơ sở để khuyến cáo ứng dụng nấm ký sinh B. bassiana và P. javanicus như một tác nhân kiểm soát sinh học trong các chương trình IPM, để thay thế các loại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực đấu tranh sinh học côn trùng. Từ khoá: Beauveria bassiana, Paecilomyces javanicus, rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell), sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) và trình tự DNA vùng ITS-rDNA. iv
Huynh Huu Duc - “Study on morphological, biological characteristics and efficacy of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant herbivores harmful insects in Mekong Delta” Major: Plant protection Code: 9.62.01.12 Educational organization: CanTho University, 2013 - 2017 THESIS ABSTRACT The thesis objectives of the basic experiment were: (1) to collect and identify a number of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant herbivores harmful insects by morphological characteristics and classify the genus differences among isolated Beauveria and Paecilomyces fungi based on the sequences of ITS - rDNA region; (2) to study some biological characteristics, factors affecting the growth and development of the strains of Beauveria and Paecilomyces as identified species; (3) to evaluate the efficacy of B. bassiana isolates on sweet potato weevil Cylas formicarius (Fabricius) and P. javanicus isolates on mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) in-vitro condition; (4) to evaluate of the efficacy of two fresh powder of B. bassiana and P. javanicus fungi inoculant in in-vitro, net house and field conditions at Vinh Long province. Results of the research were to establish a database for native fungal strains, and provide necessary basic information needed to choose the highly virulent isolates using in management of crops pest prevention. The result of the isolation and identification showed that sixteen Beauveria isolates belong to one entomopathogenic Beauveria species, Beauveria bassiana and fourteen Paecilomyces isolates belong to one entomopathogenic Paecilomyces species, Paecilomyces javanicus parasitic on insects at the Mekong Delta provinces. Colonies of strains B. bassiana on PDA medium were normally white or white to pale yellow when mature. These isolates were characterized by conidiophores consisting of whorls and dense clusters of short conidiophorous cells with one-celled ovoid (2.61 - 2.97 x 2.35 - 2.72 μm) or globose (2.24 - 2.28 x 2.23 - 2.24μm). For the colonies of strains P. javanicus changed gradually, at first white, in age becoming cream and then purple (ash gray) when mature, conidiophores forming verticillate branches with phialides in whorls of 2 to 3, conidia has fusiform shape, sometimes cylindrical shape (5.01 - 5.74 x 1.51 - 1.69 μm). In addition, The ITS4 and ITS5 primers, successfully amplified a fragment of approximately 580 bp from all Beauveria and Paecilomyces isolates, the result of the sequences of ITS - rDNA region reported that those both species Beauveria and Paecilomyces strains have a significantly considerable similarity (from 96.6% to 99.6%) compared with others on Genbank. v
The biological characteristics of 16 strains B. bassiana and 14 strains P. javanicus showed that the germination rate of strains P. javanicus was over 94% at 20 hours after cultivation, earlier than the germination rate of strains B. bassiana was over 94% at 24 hours after cultivation. The SDAY3 and PDA medium have given the quick speed of colonies diameter and high density of conidia, furthermore strains P. javanicus can grow well when P. javanicus was cultivated on CDA medium. The time for strains B. bassiana and P. javanicus gave the highest spores number at 14 days after cultivation and there are the high density of conidia about ((107 - 108 conidia) x cm-2). The optimal temperature for strains B. bassiana and P. javanicus development as well as many conidia production were about 25o - 28oC. When the temperature increased above 30oC, both B. bassiana and P. javanicus grew slowly or did not grow. The spores of B. bassiana and P. javanicus were able to survive after coming in contact with high temperature conditions during 8 hours. Almost all fungicides had effected on the growth and germination of B. bassiana and P. javanicus. In laboratory conditions, the first step evaluated the efficacy of B. Bassiana for the control of sweet potato weevil C. formicarius (Fabricius) and the efficacy of P. javanicus for the control of mealybug P. lilacinus. The results of experiments showed that all fungal strains were highly effective for their hosts and the parasitic rate was 90% at date 11th after treatment. The evaluative efficacy of parasitic fungi B. bassiana for the control of sweet potato weevil C. formicarius and parasitic fungi P. javanicus for the control of mealybug P. lilacinus were carried out in laboratory and nethouse conditions. The results of using parasitic fungi B. bassiana and P. javanicus showed that two parasitic fungi showed high effect over 80% after 7 - 11 days following treatment of fresh powder fungi preparation with the concentration of spores from 108 to 109 conidia/mL and the dose of fresh powder fungi inoculant from 3.0 to 3.5 kilograms/ha. The results evaluated the efficacy of parasitic fungi B. bassiana and P. javanicus when experiments were carried out in the field, were sprayed five times by fresh powder fungi inoculant B. bassiana for the control of C. formicarius were spayed for the control of P. lilacinus with the dose of fresh powder fungi preparation from 3.0 kilograms/ha, the results of all experiments gave equivalent effects with using chemistry by famers’ methods. Therefore, collected data in this research, which is the basis to recommend for applying successfully entomopathogenic fungi as a biocontrol agent in the IPM programmes. Key words: Beauveria bassiana, mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) Paecilomyces javanicus, sweet potato weevil Cylas formicarius (Fabricius) and sequences of ITS - rDNA region. vi
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... ii TÓM TẮT .................................................................................................................... iii THESIS ABSTRACT ................................................................................................... v MỤC LỤC .................................................................................................................. vii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. xiii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. xvi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU......................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu .................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................ 4 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................. 4 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ........................................................................... 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6 2.1. Tổng quan tài liệu về hai chi nấm Beauveria và Paecilomyces ............................... 6 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................... 6 2.1.2. Phân bố địa lý và sinh thái của nấm ký sinh côn trùng .............................. 7 2.1.3. Hệ thống phân loại của hai chi Beauveria và Paecilomyces ...................... 8 2.1.4. Vòng đời của Hypocreales và Entomophthorales ...................................... 9 2.1.5. Phương pháp phân lập và định danh nấm ký sinh côn trùng.................... 11 2.1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria và Paecilomyces ......................................................... 20 2.1.7. Sản xuất chế phẩm và công thức phối trộn............................................... 27 2.1.8. Sự suy giảm tính độc của nấm ký sinh ..................................................... 27 2.1.9. Khả năng phòng trừ sinh học của chi nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh gây bệnh côn trùng ........................................... 28 2.2. Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) ..................................................... 40 2.2.1. Phân loại và phổ ký chủ............................................................................ 40 2.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh học ................................................................ 41 2.2.3. Tập quán sinh sống và cách gây hại của sùng khoai lang ........................ 41 vii
2.2.4. Triệu chứng gây hại của sùng khoai lang ................................................. 43 2.2.5. Biện pháp phòng trị sùng khoai lang trên đồng ruộng ............................. 43 2.3. Rệp sáp giả (Planococcus lilacinus Cockerell)...................................................... 44 2.3.1. Phân bố và ký chủ..................................................................................... 44 2.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh học ................................................................ 44 2.3.3. Tập quán sống và cách gây hại ................................................................. 45 2.3.4. Biện pháp phòng trị .................................................................................. 45 2.4. Các loại thuốc bảo vệ thực vật dùng trong nghiên cứu .......................................... 45 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 50 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 50 3.2. Phương Tiện Nghiên Cứu ...................................................................................... 50 3.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 52 3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 53 3.4.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử .......................................................................................................... 53 3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria và Paecilomyces ....................................................................................... 56 3.4.3. Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm (PTN) ................................. 60 3.4.4. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện PTN ................................................................. 62 3.4.5. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện nhà lưới ........................................................... 65 3.4.6. Khảo sát hiệu lực của chế phẩm các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và viii
Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng ....................................................... 66 3.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 72 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 73 4.1. Kết quả nghiên cứu chi Beauveria ......................................................................... 73 4.1.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học ........................................................................................................ 73 4.1.2. Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Beauveria dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS - rDNA) .............................................. 80 4.1.3. Một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria bassiana ký sinh trên sâu hại cây trồng. .......................................................................... 84 4.1.4. Kết quả đánh giá hiệu lực của các chủng nấm Beauveria bassiana phòng trừ sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) .......................................................................................... 102 4.2. Kết quả nghiên cứu chi nâm Paecilomyces .......................................................... 115 4.2.1. Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học ............................................................................. 115 4.2.2. Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Paecilomyces dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS - rDNA)..................................... 123 4.2.3. Một số đặc điểm sinh học của nấm Paecilomyces javanicus ký sinh trên một số loại sâu hại cây trồng .............................................. 131 4.2.4. Kết quả đánh giá hiệu lực các chủng nấm Paecilomyces javanicus trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) .................. 148 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 161 5.1. Kết luận ................................................................................................................ 161 5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 162 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .................................................... 163 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 164 PHỤ CHƯƠNG ........................................................................................................ 185 ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Mười loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Beauveria 59 3.2 Năm loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm đối với nấm Paecilomyces 59 3.3 Các nghiệm thức sử dụng trong đánh giá hiệu quả chế phẩm nấm Beauveria đối với thành trùng SKL C. formicarius (Fabricius) ở điều kiện PTN 63 3.4 Các nghiệm thức sử dụng trong đánh giá hiệu quả chế phẩm nấm tím Paecilomyces đối với rệp sáp P. lilacinus ở điều kiện PTN 65 3.5 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm trắng Beauveria trong phòng trừ SKL ở điều kiện ngoài đồng 68 3.6 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm tím Paecilomyces sp. trong phòng trừ RS ở điều kiện ngoài đồng 70 4.1 Các chủng nấm Beauveria sp. đã được phân lập và kí hiệu 73 4.2 Kích thước bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana 78 4.3 Các chủng nấm Beauveria bassiana đã được phân lập và kí hiệu 79 4.4 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 16 chủng nấm B bassiana được phân lập ở 7 tỉnh ĐBSCL và 10 chủng nấm B. bassiana của một số nước trên thế giới 82 4.5 Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm B. bassiana qua các giờ quan sát 85 4.6 Đường kính tản nấm các chủng nấm B. bassiana ở thời điểm 5 NSKC 86 4.7 Đường kính tản nấm các chủng nấm B. bassiana ở thời điểm 15 NSKC 87 4.8 Đường kính tản nấm các chủng nấm B. bassiana ở thời điểm 29 NSKC 88 4.9 Mật số bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana ở các thời điểm ghi nhận chỉ tiêu. 93 4.10 Tốc độ phát triển trung bình của tản nấm B. bassiana ở các mức nhiệt độ khác nhau. 94 4.11 Khả năng sinh bào tử của các chủng nấm B. bassiana ở điều kiện nhiệt độ khác nhau. 96 4.12 Tỷ lệ (%) bào tử của các chủng nấm B. bassiana nẩy mầm ở nhiệt độ cao. 97 4.13 Ảnh hưởng của 3 nồng độ thuốc sâu đến sự phát triển, tỷ lệ nẩy mầm và mật số bào tử của nấm Beauveria bassiana 101 4.14 Độ hữu hiệu của các chủng nấm B. bassiana đối với thành trùng sùng khoai lang (SKL) C. formicarius ở nồng độ bào tử (5 x 108 bt/mL) trong điều kiện phòng thí nghiệm. 103 x
4.15 Tổng số thành trùng sùng khoai lang chết, tỷ lệ SKL mọc nấm trở lại. 104 4.16 Độ hữu hiệu của 3 mật số bào tử (bt/mL) chế phẩm nấm trắng B. bassiana đối với thành trùng sùng khoai lang C. formicarius (Fabricius) ở điều kiện PTN. 105 4.17 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng B. bassiana đối với thành trùng sùng khoai lang ở điều kiện PTN 106 4.18 Tổng số thành trùng sùng khoai lang chết, tỷ lệ SKL mọc nấm trở lại. 107 4.19 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng B. bassiana đối với thành trùng sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) ở điều kiện nhà lưới 108 4.20 Tỷ lệ thiệt hại trên củ do sùng khoai lang gây ra trên ruộng khoai lang tím Nhật tại các thời điểm. 112 4.21 Năng suất lý thuyết khi thu hoạch khoai lang tím Nhật tại ấp Tân Qui, xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. 113 4.22 Năng suất thực tế khi thu hoạch khoai lang tím Nhật tại ấp Tân Qui, xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. 114 4.23 Các chủng nấm Paecilomyces spp. đã được phân lập và kí hiệu 115 4.24 Kích thước bào tử của các chủng nấm Paecilomyces spp. 122 4.25 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 14 chủng nấm Paecilomyces javanicus được phân lập ở 6 tỉnh ĐBSCL và 10 chủng nấm Paecilomyces javanicus của một số nước trên thế giới 125 4.26 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 8 chủng nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập ở 6 tỉnh ĐBSCL và 10 chủng nấm Paecilomyces lilacinus của một số nước trên thế giới 126 4.27 Bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Purpureocillum lilacinum 129 4.28 Các chủng nấm Paecilomyces javanicus đã được phân lập và kí hiệu 130 4.29 Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm P. javanicus qua các giờ quan sát. 131 4.30 Đường kính tản nấm các chủng nấm P. javanicus ở thời điểm 5 NSKC 133 4.31 Đường kính tản nấm các chủng nấm P. javanicus ở thời điểm 15 NSKC 134 4.32 Đường kính tản nấm các chủng nấm P. javanicus ở thời điểm 25 NSKC 135 4.33 Mật số bào tử của các chủng nấm P. javanicus ở các thời điểm ghi nhận chỉ tiêu. 140 4.34 Tốc độ phát triển trung bình của tản nấm P. javanicus ở các mức nhiệt độ khác nhau 142 4.35 Khả năng sinh bào tử của các chủng nấm P. javanicus ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 143 4.36 Tỷ lệ (%) bào tử của các chủng nấm P. javanicus nẩy mầm ở nhiệt độ cao 145 xi
4.37 Ảnh hưởng của 3 nồng độ thuốc sâu đến sự phát triển, tỷ lệ nẩy mầm và mật số bào tử của nấm P. javanicus 146 4.38 Độ hữu hiệu của các chủng nấm P. javanicus đối với thành trùng rệp sáp Planococcus lilacinus ở nồng độ bào tử (5 x 108 bt/mL) trong điều kiện phòng thí nghiệm 149 4.39 Tổng số thành trùng rệp sáp Planococcus lilacinus chết, tỷ lệ RS mọc nấm trở lại 150 4.40 Độ hữu hiệu của 3 mật số bào tử (bt/mL) chế phẩm nấm tím P. javanicus đối với thành trùng rệp sáp P. lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN 151 4.41 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm tím P. javanicus đối với thành trùng rệp sáp P. lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN 152 4.42 Tổng số thành trùng rệp sáp P. lilacinus chết, tỷ lệ rệp sáp P. lilacinus mọc nấm trở lại 153 4.43 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm P. javanicus đối với thành trùng rệp sáp P. lilacinus ở điều kiện nhà lưới 154 4.44 Hiệu lực của chế phẩm nấm tím P. javanicus đối với thành trùng rệp sáp P. lilacinus gây hại mãng cầu xiêm giống Thái tại Vĩnh Long, 2017 158 4.45 Năng suất lý thuyết khi thu hoạch mãng cầu xiêm giống Thái tại Vĩnh Long, 2017 160 xii
DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ Hypocreales (Anna and Karol, 2012) 11 2.2 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ Entomophthorales (Anna and Karol, 2012) 11 2.3 Cấu tạo cơ quan sinh bào tử của nấm I: B. alba (Limber) Saccas; II: B. bassiana (Bals.) Vuill.; III: B. brongniartii (Sacc.) Petch A: Bộ máy mang bào tử trần với giá bào tử trần và tế bào sinh bào tử trần; B: Các dạng tế bào sinh bào tử trần; C: Bào tử trần (De Hoog, 1972). 13 2.4 Sơ đồ vùng trình tự ITS - rDNA của vi nấm và các primer. (http://nature.berkeley.edu) 17 3.1 Sơ đồ nguyên tắc định danh vi nấm bằng các primer dùng để khuyết đại vùng rDNA. (http://nature.berkeley.edu) 54 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩmnấm B. bassiana trên sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) ở ngoài đồng 67 4.1 Nấm Beauveria sp. ký sinh một số loài côn trùng gây hại được thu thập tại 7 tỉnh thành của Đồng bằng sông Cửu Long (A - B: Sùng khoai lang Cylas formicarius Fabricius; B - C: Bọ nhảy Phyllotreta striolata Fabricius; E: Sùng đất Lepidiota cochinchinae Brenske; F: Rệp sáp giả Planococcus sp.; G: Rầy nâu Nilaparvata lugens Stal; H: Sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius. 74 4.2 Tản nấm 16 chủng nấm thuộc chi Beauveria phân lập trên môi trường PDA (A: Bea1(SKL-CT), B: Bea2(SKL-VL), C: Bea3(SKL-VL), D: Bea4(SKL-VL), E: Bea5(SKL HG), F: Bea6(SKL-KG), G: Bea7(SKL- AG), H: Bea8(BN-CT), I: Bea9(BN-HG), J: Bea10(BN-ST), K: Bea11(SĐ-CT), L: Bea12(RSG-CT), M: Bea13(RSG-HG), N: Bea14(RSG- TV), O: Bea15(RN-ST), P: Bea16(SAT-VL)). 76 4.3 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử nấm Beauveria bassiana được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. 77 4.4 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS - rDNA của các chủng phân lập Beauveria sp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) (MK: maker chuẩn, A - P là ký hiệu của 16 chủng nấm Beauveria sp. từ Bb1 - Bb16) 80 4.5 Sơ đồ phân nhóm loài của 14 chủng nấm Beauveria bassiana phân lập được bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên tình tự của vùng ITS - rDNA. Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại được chỉ xiii
trên các nhánh. Các mẫu Beauveria brongniartii, Beauveria cylindrospora và Beauveria album được xem như loài lai xa 83 4.6 Tốc độ phát triển trung bình của 16 chủng nấm Beauveria bassiana trên năm loại môi trường dinh dưỡng. 89 4.7 Mật số bào tử của 16 chủng nấm B. bassiana trên năm loại môi trường dinh dưỡng tại thời điểm 15 ngày sau khi cấy. 90 4.8 Mật số bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana sau 10 NSKC trên môi trường SDAY3 91 4.9 Diễn biến mật số của SKL trên đồng ruộng khoai lang của nông dân. 109 4.10 Nấm Paecilomyces spp. ký sinh một số loài côn trùng gây hại được thu thập tại 6 tỉnh thành của Đồng bằng sông Cửu Long (A - B - C - F: Rệp sáp Planococcus lilacinus; D: Rệp sáp Crypticerya jacobsoni; E: Rệp sáp Dysmicoccus brevipes; G: Bọ xít nhãn Tessaratoma sp.; H: Rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama) 116 4.11 Tản nấm 22 chủng nấm Paecilomyces spp. được phân lập trên môi trường PDA (A: Pae1(RS-ST), B: Pae2(RS-ST), C: Pae3(RS-AG), D: Pae4(RS- AG), E: Pae5(RS-TG), F: Pae6(RS-TG), G: Pae7(RS-CT), H: Pae8(RS- CT), I: Pae9(RS-CT), J: Pae10(RS-CT), K: Pae11(RS-CT), L: Pae12(RS- VL), M: Pae13(RS-VL), N: Pae14(RS-HG), O: Pae15(RS-CT), P: Pae16(RS-CT), Q: Pae17(RS-CT), R: Pae18(RS-CT), S: Pae19(BXN-CT), T: Pae20(BXN-VL), U: Pae21(BXN-VL), V: Pae22(BXN-HG) 118 4.12 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử của 14 chủng nấm Paecilomyces sp. được ký hiệu từ A - N khi quan sát dưới kính hiển vi quang học 119 4.13 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử của 8 chủng nấm Paecilomyces sp. được ký hiệu từ O - V khi quan sát dưới kính hiển vi quang học 120 4.14 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các chủng phân lập Paecilomyces spp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) (MK: maker chuẩn, A - V: ký hiệu của 22 chủng nấm Paecilomyces spp. từ Pae1 - Pae22) 123 4.15 Sơ đồ phân nhóm loài của 14 chủng phân lập P. javanicus và 8 chủng P. lilacinus phân lập được bằng phương pháp Maximum Likelihood dựa trên tình tự của vùng ITS - rDNA. Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại được chỉ trên các nhánh. Các mẫu P. fumosoroseus, P. farinosus và P. marquandii được xem như một loài lai xa. 128 4.16 Tốc độ phát triển trung bình của 14 chủng nấm P. javanicus trên năm loại môi trường dinh dưỡng. 136 4.17 Mật số bào tử của 14 chủng nấm P. javanicus trên năm loại môi trường 137 xiv
dinh dưỡng tại thời điểm 15 ngày sau khi cấy. 4.18 Mật số bào tử của các chủng nấm P. javanicus sau 10 NSKC trên môi trường CDA. 139 4.19 Hai loại rệp sáp hiện diện trên vườn mãng cầu xiêm giống Thái 156 xv
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic B. bassiana Beauveria bassiana BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base Pair - Cặp Base ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long ĐC Đối Chứng ĐHCT Đại Học Cần Thơ dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dsDNA Double Strand DNA - DNA Sợi Kép EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid EtOH Ethanol - Cồn GSKC Giờ Sau Khi Cấy IPM Integrated Pest Management ITS Interal Transcribed Spacer MQ Milli Q Water - Nước Cất Hai Lần NCBI National Center Biotechnology Information NSKC Ngày Sau Khi Chủng/Ngày Sau Khi Cấy NSKT Ngày Sau Khi Trồng P. javanicus Paecilomyces javanicus P. lilacinus Paecilomyces lilacinus PCI Phenol : Chloroform: Isoamyl Alcohol PCR Polymerase Chain Reaction PTN Phòng Thí Nghiệm Pur. lilacinum Purpureocillum lilacinum rDNA Ribosomal DNA RS Rệp sáp Rệp sáp P. lilacinus Rệp sáp Planococcus lilacinus SDS Sodium Dodecyl Sulfate SKL Sùng Khoai Lang TAE Tris-Acetate - EDTA Buffer TE Tris-Acetate Tris Tris - (Hydroxymethyl) Aminomethane UV UltraViolet: Tia Cực Tím v/v Volume/Volume: Thể Tích/Thể Tích xvi
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu Sự phát triển tính kháng thuốc trừ sâu hóa học của côn trùng và những lo ngại về các ảnh hưởng có hại của hóa chất đến an toàn môi trường và con người đã tạo ra động lực mạnh mẽ cho sự nghiên cứu phát triển các tác nhân vi sinh vật sử dụng phối hợp với các tác nhân khác để kiểm soát côn trùng gây hại. Vì vậy, chiến lược bảo vệ cây trồng trên thế giới và tại Việt Nam đã có sự thay đổi cơ bản, người ta đã thấy rõ những mặt hạn chế của biện pháp sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật. Mặt khác, điều kiện kinh tế xã hội ngày càng phát triển cùng với việc thị trường xuất khẩu nông sản ngày càng được mở rộng đã nâng cao mức yêu cầu đối với chất lượng của nông sản. Từ đó, các mô hình canh tác theo tiêu chuẩn GAP (VietGAP, EuroGAP và GlobalGAP) trên lúa, rau màu và cây ăn trái đã và đang được phát triển rất mạnh ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Trong các tiền đề trên đã đặt ra những hướng đi mới cho ngành Bảo vệ thực vật (BVTV) Việt Nam, một trong những hướng đi đó là nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học để giảm thiểu lượng hoá chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài ra còn có những chương trình quản lý tổng hợp như IPM (Integrated Pest Management) và ICM (Integrated Crop Management) đã được ứng dụng phổ biến và rộng rãi để quản lý phòng trừ dịch hại, trong đó đấu tranh sinh học đóng vai trò khá quan trọng để điều chỉnh sự cân bằng sinh học của quần thể. Một tập hợp đa dạng của vi sinh vật khác nhau hiện đang được xem xét như là các tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng như: virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm. Trong đó giới nấm, theo ước tính của các nhà khoa học có khoảng 1,5 triệu loài (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007; Schmit and Mueller, 2007), với khoảng 110.000 loài được mô tả (Kirk et al., 2008). Trong số này, 700 loài trong 90 chi được công nhận là tác nhân gây bệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), và khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại đã được phát triển dựa trên ít nhất 12 loài nấm ký sinh côn trùng (De Faria and Wraight, 2007). Các nghiên cứu tập trung phát triển và ứng dụng các loài ký sinh côn trùng thuộc bộ Hyphomycetes trong đó có nấm Beauveria và Paecilomyces. Nấm ký sinh gây bệnh trên côn trùng Beauveria bassiana là loài nấm được quan tâm nghiên cứu phát triển và ứng dụng nhiều do có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới như là tác nhân phòng trừ sinh học. Nấm Beauveria bassiana gây bệnh trên 700 loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng 1
(Coleoptera), cánh nữa cứng (Hemiptera), cánh đều (Homoptera), cánh bằng (Isoptera), và sâu non của bộ cánh vẩy (Lepidoptera) (Liang, 1981; Gillespie, 1986; Inglis et al. 1996; Liu et al., 2002; Phạm Thị Thùy, 2004; Nguyễn Thị Lộc và ctv., 2009; Dembilio et al. 2010; Hussain et al. 2009a, 2009b, 2010). Nấm B. bassiana đã được nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Canada, Anh, Úc, Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng như bọ hung hại mía, bọ hung hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắp cải, củ cải… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài sâu hại cây rừng như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây ăn quả, sùng hại mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004). Viện Bảo vệ Thực vật đã có một số nghiên cứu sử dụng nấm này để phòng trừ một số đối tượng sâu hại cây trồng như rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa... trong thời gian gần đây bước đầu đã thu được những kết quả nhất định (Phạm Thị Thùy, 2004). Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công và thương mại hóa các chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana như Ostrinil, Boverin, BotaniGard, Naturalis-L, Mycotrol GHA (Nguyễn Thị Lộc và ctv, 2009; Kunimi, 2005; Kunimi, 2007). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, thức ăn, xác bả hữu cơ và tàn dư thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: Paecilomyces javanicus, Paecilomyces carneus, Paecilomyces farinosus, Pacilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus (CABI, 2002). Người ta đã sản xuất ra chế phẩm Pelomin để phòng trừ ngài đục quả táo, sâu róm thông (Ferron, 1978; Trần Văn Mão, 2004). Đến nay Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces fumosoroseus có khả năng thương mại hóa trên thị trường và có tên thương mại là: PreFeRal, Priority, Pae-Sin để phòng trị rệp sáp và rầy mềm (Kunimi, 2005). Nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces đã được cấp bằng sáng chế tại Trung Quốc. Chủng nấm Paecilomyces javanicus kết hợp hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dưới dạng bột hòa nước, huyền phù hoặc dạng nhũ dầu để phòng trừ một số loại sâu hại cây trồng như sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm… Việc kết hợp nấm tím Paecilomyces javanicus và hoạt chất Azadirzachtin giúp tăng hiệu lực của nấm ký sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtin trong phòng trừ sâu hại (Huang Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b). Bên cạnh đó Huang Zhen and Ren Shunxiang (2008c) cũng đã nghiên cứu kết hợp nấm Paecilomyces javanicus với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 - 0,56) và Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dưới dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại, đặc biệt là các loài chích hút, còn có tác dụng ngăn ngừa tốt các loài dịch hại như bướm sâu tơ, rầy mềm, bọ trĩ. 2