Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:151

Thêm vào BST

Báo xấu

67
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------- LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm PGS.TS. Tô Long Thành Hà Nội, năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này, ngoài sự lỗ lực của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS. TS. Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này. Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu đó! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 4 1.1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới ........................................................ 4 1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam......................................................... 5 1.2. Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng ........................................ 8 1.3. Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae gây ra trên cá biển .................................................................................................. 10 1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae ....................................................... 10 1.3.2. Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển ......... 15 1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc .......................................... 19 1.4.1. Phương pháp vật lý ............................................................................... 19 1.4.2. Các phương pháp vi sinh vật học .......................................................... 21 1.4.3. Đột biến bằng kháng sinh rifampicin .................................................... 22 1.4.4. Giảm độc bằng kỹ thuật gen ................................................................. 24 1.5. Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh .................................. 25 1.5.1. Đáp ứng miễn dịch của cá ..................................................................... 25 1.5.2. Vắc xin phòng bệnh cho cá ................................................................... 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 42 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 42 2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 42 2.2.1. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 42 iii
2.2.2. Hóa chất................................................................................................. 42 2.2.3. Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn ......................................... 42 2.2.4. Thiết bị .................................................................................................. 43 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 43 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 43 2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh .............................................................. 43 2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng ...................................................... 44 2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae ................. 44 2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn ...................... 45 2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ................................................................................................................. 45 2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn............................ 46 2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) trên cá biển của vi khuẩn P. damselae ............................ 47 2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 .......... 48 2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................. 48 2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P.damselae subsp. Damselae và P. damselae subsp. piscicida ..................................................... 49 2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA .................................... 49 2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose ....................................................... 50 2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm ............................................................................................................. 50 2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực.............................................................................................................. 51 2.4.15. Phương pháp mô bệnh học .................................................................. 52 2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen ........... 53 iv
2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực ....................................................... 53 2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu ............................. 53 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 55 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae ................................................... 55 3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh .......................................................................... 55 3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng .......................................................................................................... 57 3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng phương pháp sinh học phân tử ........................................................................ 61 3.1.4. Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập .................... 63 3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae phân lập được ............................................................................................................ 65 3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................... 65 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae .......................................................................................... 69 3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................................... 71 3.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực .................................................................................................................... 73 3.3.1. Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến ............................................................................................................ 73 3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến ................................................................. 76 3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn P. damselae đột biến giảm độc lực trên cá mú .................................................................................. 81 v
3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc ............................................................. 88 3.4. Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực......................................... 104 3.4.1. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu ............................. 104 3.4.2. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ ............................... 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 111 Kết luận ......................................................................................................... 111 Kiến nghị ....................................................................................................... 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................ 112 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................... 113 PHỤ LỤC vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AFLP Amplified fragment length polymorphism BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus BHI Brain heart infusion CFU Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc cs Cộng sự Da Dalton DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FA Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang GS Grouper spleen – tế bào lách cá mú IgM Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M LD50 Lethal dose 50 - liều gây chết 50% nt Nucleotide OD Optical density - mật độ quang ORF Open reading frame -khung đọc mở PCR Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid TCBS Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy UV Ultra violet VNN Viral nervour necrosis vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới ........... 4 Bảng 1.2. Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc ................................... 5 Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam ................................... 7 Bảng 1.4. Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực ................. 37 Bảng 2.1. Mồi khuếch đại các gen UreC và 16S RNA ................................... 49 Bảng 2.2. Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA .............................................. 49 Bảng 3.1. Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm .............................................. 56 Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) .............................. 58 Bảng 3.3. Kết quả xác định liều LD50 của các chủng vi khuẩn P.damselae phân lập .......................................................................................... 64 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 ......................................... 69 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. amselae T1.7 và T4.3 ..................................................................... 71 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 .............................................................. 73 Bảng 3.7. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân UV .................................................................................................. 74 Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân kháng sinh Rifampicin ................................................................... 75 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra gây dung huyết của các dòng Photobacterium damsela đột biến ............................................................................ 77 Bảng 3.10. Kết quả xác định liều LD50 của các dòng vi khuẩn P.damselae đột biến ................................................................................................. 80 Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm ........... 81 viii
Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm ............... 83 Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá thí nghiệm ...................................................................................... 85 Bảng 3.14. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập lại từ cá gây nhiễm .... 87 Bảng 3.15. So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank với chủng P.damselae T4.3 ................................................................................................ 92 Bảng 3.16. So sánh độ tương đồng gen dly Genbank so với chủng P.damselae T4.3 .............................................................................................. 101 ix
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái của vi khuẩn P. damselae ............................................... 11 Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine. ......................... 21 Hình 1.3. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56]. ..................................... 23 Hình 1.4. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56]. ................................ 23 Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp mô bệnh học .................................................. 52 Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng (c) Mẫu cá mú không bị bệnh............................................................................. 55 Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis................. 56 Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae...................................................... 59 Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của chủng T1.7 ......... 60 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và 16S rRNA của vi khuẩn P. damselase ............................................................. 62 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T1.7 .............................................................................. 66 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P. damselae T4.3 .............................................................................. 66 Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P. damselae .... 70 Hình 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ... 72 P. damselae phân lập....................................................................................... 72 Hình 3.10. Khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV .......................................... 75 Hình 3.11. Khuẩn lạc sống sót sau khi sử dụng kháng sinh rifampicin ......... 76 Hình 3.12. Hình ảnh dung huyết thạch máu của các dòng vi khuẩn thí nghiệm . 77 Hình 3.13. Biểu hiện bệnh tích bên ngoài của cá mú gây nhiễm chủng P. damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày) ............................................ 82 Hình 3.14. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm ............................................................................................................... 84 x
Hình 3.15. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm... 86 Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực ........................................................ 89 Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dly của chủng giống gốc và các dòng gây giảm độc lực ........................................................ 89 Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự gen hlyA của chủng gốc T4.3 với trình tự hlyA trên Genbankmã số KF984030.1 ............................................................ 92 Hình 3.19. So sánh trình tự gen hlyA của các dòng đột biến và chủng T4.3 gốc .. 95 Hình 3.20. Vị trí mã mở đầu và mã kết thúc vùng mã hóa protein của dòng U4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 .......................................................................... 98 Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của các dòng T4.3U6, T4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 ................................................................................................ 99 Hình 3.22. Kết quả so sánh trình tự gen dly của chủng gốc T4.3 và LBT6 với trình tự gen dly của Genbank ........................................................................ 100 Hình 3.23. Trình tự đoạn gen dly của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 . 102 Hình 3.24. Trình tự protein suy diễn của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 102 Hình 3.25. Biến thiên mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu ở cá được tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ..................................................................... 105 Hình 3.26. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.8 sau khi tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ............................................................. 107 Hình 3.27. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.7 sau khi tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ............................................................. 108 xi
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích có khả năng sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi triều ven biển và một phần ở các hải đảo, vùng biển hở. Biển Việt Nam có nhiều loài cá phân bố tự nhiên có thể đưa vào nuôi biển như nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược... Trong chương trình nuôi, đến năm 2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.000 tấn cá biển nuôi trong đó 50.000 tấn là nuôi theo quy mô lớn [16]. Hiện tại, mô hình nuôi cá lồng bè có giá trị kinh tế cao trên biển đang được áp dụng phổ biến ở nhiều vùng ven biển nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển mô hình nuôi nhanh về số lượng cũng như về mức độ thâm canh ngày càng cao, tình hình dịch bệnh gây chết cá hàng loạt cũng đã được ghi nhận ngày càng nhiều với tỉ lệ hao hụt cao. Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae gây bệnh Photobacteriosis hay Pasteurellosis còn được gọi là xuất huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên cá biển [5]. Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp tính, biểu hiện bệnh Photobacteriosis như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi [146], [41]. Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ,... Ở Việt Nam, theo báo cáo của các tác giả Đỗ Thị Hòa và cs năm 2008, cho thấy các loài cá biển nuôi tại Khánh Hòa, 1
Kiên Giang và các tỉnh phía Bắc đều bị bệnh do vi khuẩn P. damselae và gây thiệt hại lớn cho người nuôi [5]. Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phòng bệnh còn rất ít do các nghiên cứu và sản xuất còn hạn chế, trên thị trường khan hiếm vắc xin thương mại. Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn P. damselae chủ yếu là ở dạng vô hoạt, sử dụng bằng cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá giống kích thước bé. Người nuôi cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn P. damselae dẫn đến sự kháng thuốc, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm. Nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, thì nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh là rất cần thiết. Hiện tại, có nhiều phương pháp để tạo vắc xin, trong đó phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi khuẩn nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm là phương pháp phổ biến và rất hữu hiệu khắc phục được các hạn chế của vắc xin vô hoạt. Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh” làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển trên quy mô công nghiệp. 2. Mục tiêu đề tài luận án - Xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. - Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Vi khuẩn Photobacterium damselae, một số loài cá biển nuôi lồng (cá mú, cá hồng mỹ, cá bớp (cá giò). 2
- Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: - Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã xác định được các đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae gây bệnh Photobacteriosis ở cá là cơ sở khoa học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh. - Kết quả tạo vi khuẩn P. damselae giảm độc lực bằng kỹ thuật gây đột biến là cơ sở cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho định hướng sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu quả cao. Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài đã tạo được chủng vi khuẩn P. damselae giảm độc lực, an toàn, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá biển ở nước ta. 5. Đóng góp mới của đề tài luận án - Ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện về vi khuẩn P. damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng, đã phân lập và xác định được 07 chủng vi khuẩn, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh. - Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển. Thành công của nghiên cứu sẽ góp phần giải quyết vấn đề một cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc và giảm sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, nâng giá trị sản phẩm cá biển, tăng năng suất cá biển nuôi lồng. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới Theo số liệu của FAO, 2016, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu năm 2014 là 73,8 triệu tấn, trong đó 26,7 triệu tấn nuôi biển (Bảng 1.1). Đối với sản xuất thủy sản biển, Trung Quốc vẫn là nước sản xuất chính tiếp theo là Ấn Độ và Việt Nam. Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới Đơn vị: Triệu tấn Năm Sản lượng 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Đánh bắt Nội địa 10,5 11,3 11,1 11,6 11,7 11,9 Biển 79,7 79,7 82,6 79,7 81,0 81,5 Tổng sản lượng đánh bắt 90,2 89,1 93,7 91,3 92,7 93,4 Nuôi trồng Nội địa 34,3 36,9 38,6 42,0 44,8 47,1 Biển 21,4 22,1 23,2 24,4 25,5 26,7 Tổng sản lượng nuôi trồng 55,7 59,0 61,8 66,5 70,3 73,6 Tổng 145,9 148,1 155,5 157,8 162,9 167,2 Nguồn: FAO 2016 Ở Trung Quốc, việc nuôi lồng bắt đầu vào cuối những năm 1970, ban đầu là nuôi trồng thủy sản nội địa và sau đó nuôi biển. Vào cuối những năm 1970, tỉnh Quảng Đông đã thành công trong việc nuôi cá biển bao gồm cá mú và cá chẽm trong lồng. Năm 1984, số lượng lồng cá biển ở ba tỉnh Quảng Đông, Phúc Kiến và Chiết Giang đã đạt trên 57000. Đến năm 2005, tổng số lồng biển của các mô hình khác nhau đã đạt đến một triệu, sản lượng nuôi lồng là khoảng 200000 tấn/năm với hơn 40 loài cá (Bảng 1.2)[49]. Trong 5 năm gần đây, nghề nuôi cá biển của Trung Quốc phát triển đều theo từng năm, số lượng báo cáo về tổng sản lượng cá biển nuôi từ năm 2010 - 2015 của Cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp cho thấy năm 2010 đạt 0,8082 triệu tấn, năm 2011 đạt 0,9642 triệu tấn, năm 2012 đạt 1,0284 triệu tấn, năm 2013 đạt 1,1236 triệu tấn, năm 2014 đạt 1,1897 triệu tấn, năm 2015 đạt 1,3076 triệu tấn [49]. 4
Bảng 1.2. Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc Vùng nuôi Loài cá Miền Bắc Miền Nam Cá đù vàng (Larmichthys crocea)  Cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus)  Cá giò (Rachycentron canadum)  Cá mú (Epinephelus spp.)  Cá vược (Lateolabrax japonicus)   Cá đá (Sebastodes fuscescens)  Cá tráp đỏ (Pagrus major)   Cá tráp đen (Acanthopagrus schlegelii schelgelii)   Cá chim vây ngắn (Trachinotus ovatus)  Cá nóc hố (Takifugu rubripes)  Cá bơn (Paralichthys olivaceus)  Cá lưỡi trâu (Cynoglossus semilaevis)  Ấn Độ triển khai nuôi cá biển từ năm 1950 bao gồm các loài cá da trơn, cá mú, cá chẽm và cá điểm ngọc trai. Trong những năm đó, hầu hết các trang trại nuôi cá đều ở quy mô nhỏ và bán tập trung. Theo số lượng thống kê của Cục Chăn nuôi và Nghề cá, sản lượng nuôi cá biển của Ấn Độ tăng khá đều đặn kể từ năm 1950-2014, sản lượng năm 1950 là 534.000 tấn, năm 2014 3.440.000 tấn, mặc dù tốc độ tăng trưởng không cao, nhưng nuôi cá biển tận dụng tối ưu tài nguyên biển và đã đóng góp đáng kể cho nền kinh tế . 1.1.2. Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam Trong giai đoạn 2005 - 2010, nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo đã có những bước phát triển đáng kể, diện tích và sản lượng tăng không ngừng. Sản lượng nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo trong giai đoạn năm 2005- 2010 đạt tốc độ tăng trưởng bình quân năm về sản lượng 5,1%/năm, trong đó cá biển tăng 38,1%/năm. Tổng diêṇ tích nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo Việt Nam năm 2005 là 34.174 ha, đến năm 2010 tăng lên đaṭ 38.800 ha, 5
trong đó: tốc độ tăng trưởng nuôi vùng biển hở là 15,4%/năm, diện tích nuôi vịnh, đảo và eo ngách tăng bình quân là 4,86%/năm; diện tích nuôi bãi triều ven biển là 1,8%/năm [22]. Các loài cá biển được nuôi chủ hiêṇ nay bao gồm cá song, cá giò, cá cam, chép biển, tráp đỏ, hồng mỹ, cá vược, đối mục, cá dìa, cá chim vây vàng, trong đó cá song, cá giò, cá vược được xem là một trong những đối tượng được nuôi phố biến nhất. Riêng khu vực Quần đảo Trường Sa chủ yếu nuôi cá chim trắng, cá hồng và cá vược mõn nhọn. Trong giai đoạn năm 2005 - 2010, số lượng lồng, bè nuôi cá lồng liên tục tăng. Tổng số ô lồng năm 2005 là 13.172 ô lồng, đến năm 2010 đạt 30.031 ô lồng; số ô lồng tăng bình quân năm trong giai đoạn năm 2005-2010 đạt 17,92%/năm. Số bè nuôi năm 2005 là 1.461 bè, tăng lên 2.142 bè năm 2010, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân là 7,96%/năm (bảng 1.3). Trong năm 2010, có 1.019 bè cá nuôi ở khu vực vùng biển vịnh Bắc bộ (chủ yếu ở Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa và Nghệ An), 630 bè ở vùng biển miền Trung (Chủ yếu Phú Yên, Khánh Hòa và Ninh Thuận), 140 bè ở vùng biển Đông Nam Bộ (chủ yếu ở Bình Thuận và Bà Rịa-Vũng Tàu) và 353 bè ở Tây Nam Bộ (chủ yếu ở Kiên Giang). Khu vực cụm đảo Đá Tây - Quần đảo Trường Sa-Khánh Hóa đã nuôi 8 lồng công nghiệp kiểu Nauy cải tiến (thể tích 218 m3/lồng. Về sản lượng cá biển nuôi, năm 2005 sản lượng nuôi cá biển đạt 3.141 tấn, đến năm 2010 sản lượng tăng lên 15.751 tấn (đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 38,1%/năm). Năm 2010, tổng sản lượng cá biển là 15.751 tấn, trong đó cá song 7.786 tấn (chiếm 49%), cá giò 4.734 tấn (chiếm 30%), cá vược 1.096 tấn (chiếm 7%), cá biển khác 2.135 tấn (chiếm 14%). Riêng khu vực nuôi cá biển của Úc (ở vịnh Nha Trang) năm 2010 đã nuôi gần 3.000 tấn cá biển (chủ yếu cá giò, song). Đến năm 2014 (sau 3 năm Quy hoạch cá biển được phê duyệt 2011) sản lượng nuôi cá biển ở các loại hình chỉ đạt 63.460 tấn, nhìn chung tốc độ 6
tăng trưởng về quy mô diện tích và sản lượng nuôi khá chậm so với quy hoạch. Sản lượng nuôi cá biển trong lồng bè đến năm 2015 có thể đạt được chỉ tiêu theo quy hoạch là 44.000 tấn. Riêng sản lượng nuôi ao đầm nước mặn lợ chỉ đạt được 50% so với quy hoạch và sản lượng nuôi công nghiệp gần như không thể đạt được chỉ tiêu trong quy hoạch đến năm 2015 đề ra (Bảng 1.3). Đối tượng nuôi cá biển cũng khá đa dạng, tuy nhiên tập trung chủ yếu vẫn là cá vược (chẽm), cá song, cá bớp và cá hồng Mỹ. Diện tích nuôi cá biển trong ao đất cũng đã được mở rộng, tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như Quảng Ninh, Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu và Kiên Giang. Nuôi lồng bè nhỏ nằm rải rác trong eo, vịnh ở các tỉnh ven biển. Nuôi cá biển quy mô công nghiệp dạng lồng bè lớn trên 1.000m3 ở các vùng eo vịnh, biển mở, có thể chịu được sống gió lớn cấp 11 -12 hầu như chưa được các thành phần kinh tế quan tâm đầu tư sản xuất. Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam TT Danh mục QH 2015 2013 QH 2014 1 Tổng sản lượng (tấn) 160000 60953 63460 - Nuôi trong ao nước mặn lợ, ao nuôi 61000 29.058 30289 tôm chuyển đổi (tấn) - Nuôi trong hệ thống lồng nhỏ (tấn) 44000 31895 33171 - Nuôi công nghiệp tập trung (tấn) 55000 2 Giá trị (tỷ USD) 1,04 3 Số lồng bè (lồng) 18231 28273 4 Diện tích nuôi trong ao (ha) 18367 29781 Theo quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 ban hành kèm theo Quyết định số 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày 08 tháng 07 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ NN và PTNT [16]: 7