Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:200

Thêm vào BST

Báo xấu

59
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-thal trong phả hệ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦNTHƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THỊ NGỌC NGA NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2017
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THỊ NGỌC NGA NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN TRUNG KIÊN 2017
LỜI CẢM TẠ Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến - Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ. - Ban giám đốc và các Thầy, Cô Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học. - Ban giám đốc trung tâm Thalasemia (TRC), Trường Đại học Mahidol, Thái Lan. - TS.BS. Hoàng Anh Vũ, Trưởng trung tâm Y - Sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc và quý đồng nghiệp trung tâm chẩn đoán Y Khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh. Đã dạy dỗ, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Đốc các bệnh viện: đa khoa Nguyễn Đình Chiểu, Bến Tre; đa khoa Kiên Giang; Nhi Đồng thành phố Cần Thơ; đa khoa trung tâm An Giang, Huyết học và Truyền máu Cần Thơ, đa khoa Châu Đốc và bệnh viện Nhi Đồng 1, thành phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập số liệu. Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn đã tận tình, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 17 tháng 4 năm 2017 Học viên i
TÓM LƯỢC Tên đề tài: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia ng ng b ng sông Cửu Long b ng kỹ thuật sinh học phân tử Βeta thalassemia (β-Thal) là bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh à mang gen bệnh β-Thal cao. Tại khu ực ng b ng sông Cửu Long hiện nay có hơn 2.000 trẻ β-Thal mắc bệnh. Vì ậy, nghiên cứu thực hiện nh m mục tiêu: xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin à xây dựng phả hệ theo dõi sự di truyền bệnh β-Thal trên bệnh nhân β-Thal ở khu ực ng b ng sông Cửu Long. Nghiên cứu cũng xác định tỷ lệ mang gen bệnh à kiểu hình huyết học của các thể bệnh trong phả hệ à tư ấn di truyền cho người mang gen bệnh kết hợp chẩn đoán trước sinh cho các cặp ợ ch ng mang gen à đang mang thai giai đoạn đầu. Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang trên 341 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal, có hộ khẩu tại 13 tỉnh, thành phố thuộc khu ực ng b ng sông Cửu Long. 12 trong số 341 bệnh nhân được chọn ngẫu nhiên để xây dựng phả hệ nh m nghiên cứu sự di truyền bệnh β- Thal. Kết quả có 17 kiểu đột biến được xác định, 97,2% các đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 –TTCT, Cd71/72 +A, Cd95 +A và IVS2.654 C>T; 2,2% kiểu B thuộc dạng không phổ biến: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C, ()del,-pro) del. Ngoài ra, có 3 kiểu đột biến mới được phát hiện: Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C. Bên cạnh đó, có tổng 12 phả hệ đã được xây dựng: 7 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer, 1 dân tộc Chăm à 1 dân tộc Hoa. 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Có 91/251 (36,3%) người mang gen bệnh à 7 thể bệnh được xác định trong phả hệ. Các thể bệnh: β-Thal đ ng hợp tử, phối hợp HbE/β-Thal, β-Thal dị hợp tử kép đều có kiểu hình thiếu máu nặng à cần truyền máu phụ thuộc; các thể bệnh còn lại chỉ biểu hiện thiếu máu nhẹ, không cần truyền máu. Tư ấn di truyền: 100% các nội dung kiến thức ề bệnh β-Thal, kiến thức chăm sóc bệnh nhân, phòng bệnh β-Thal đều đã được tăng lên có ý nghĩa thống kê (p
ABSTRACT Title: Study on inheritance of pathogenous mutations in Beta thalassemia patients living in the Mekong Delta using molecular biology technique. Βeta thalassemia is the most commonly inherited genetic disorders in the world. Vietnam is one of the countries with high incidence of β-Thal disease. The Mekong Delta had more than 2,000 β-Thal children. Therefore, the subject of the project: to determine the ratio of mutant genotypes and to construct pedigree charts that study the β-Thal inheritance in β-Thal patients who live in the Mekong Delta. Determining the ratio of gene carrier and the hematological phenotypes of the diseases in the pedigree. Genetic counseling for gene carriers and prenatal diagnosis for couples of gene carriers. The study was conducted using a cross-sectional descriptive study was performed on 341 patients, residents in 13 provinces and cities in the area of Mekong Delta. 12 patients will be purposively selected for genealogy to study the inheritance of β-Thal. The study results: 17 types of mutants were identified. 97.2% of the mutations belong to 8 common types of Vietnam: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 -TTCT, Cd71/72 + A Cd95 +A and IVS2.654 C>T; 2.2% uncommon mutations: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C, ()del,-pro) del. There were three new mutant types discovered accounting for 0.6%: Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C. In addition, there were 12 pedigree charts: 7 Vietnamese, 3 Khmer, 1 Cham and 1 Chinese. All pedigrees were inherited in an autosomal recessive pattern. There were 36,3% gene carriers and seven diseases identified in the pedigrees: β-Thal homozygotes, compound heterozygotes of HbE/β-Thal and compound heterozygotes β-Thal had a major anemia and require dependent blood transfusion. The rest of the disease only showed minor anemia, no blood transfusion. After genetic counseling: 100% of knowledge about β-Thal disease, knowledge of patient health care and pre ention of β-Thal disease have been increased significantly (p
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây. Người hướng dẫn Tác giả luận án PGS.TS. Nguyễn Trung Kiên Phạm Thị Ngọc Nga iv
MỤC LỤC Trang CẢM TẠ ............................................................................................................. i TÓM LƯỢC ...................................................................................................... ii ABSTRACT ...................................................................................................... iii LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. iv MỤC LỤC .......................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... ix DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xii TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. xv CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU .............................................................................. 1 1.1. ặt ấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài.............................................................................................. 2 1.3. Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 2 1.4. Tính mới của luận án ................................................................................... 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 4 2.1. Bệnh Beta thalassemia ................................................................................. 4 2.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia ................................. 4 2.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia ..................................................... 5 2.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta- globin ................................................................................................................... 5 2.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia ................................................ 7 2.1.5. Các thể bệnh Beta thalassemia ....................................................... 11 2.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia.................................................. 14 2.1.7. Điều trị Beta thalassemia ............................................................... 16 2.1.8. Phòng bệnh Beta thalassemia ......................................................... 17 2.2. Phương pháp lập à phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia ................. 18 2.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ................................ 18 2.2.2. Phương pháp lập phả hệ ................................................................. 19 2.2.3. Phân tích phả hệ.............................................................................. 19 v
2.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ ...................................................... 20 2.3. Tư ấn di truyền à các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh Beta thalassemia ....................................................................................... 21 2.3.1. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia ........................ 21 2.3.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia ... 22 2.4. Tổng quan các nghiên cứu ề đột biến gây bệnh Beta thalassemia tại Việt Nam .................................................................................................................. 28 CHƯƠNG III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 32 3.1. ối tượng nghiên cứu ............................................................................... 32 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến gen ............................................................................................................. 32 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ ............... 32 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh .......................................................................................... 32 3.2. Thời gian à địa điểm nghiên cứu ............................................................. 33 3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 33 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 33 3.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu .............................................. 33 3.3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 35 3.3.4. Phương pháp thu thập số liệu ......................................................... 40 3.3.5. Phương pháp hạn chế sai số ........................................................... 52 3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 52 3.4. Hạn chế của đề tài ..................................................................................... 53 3.5. ạo đức trong nghiên cứu ......................................................................... 53 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ .............................................................................. 55 4.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu ......................................................... 55 4.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến ............. 55 4.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ ..................................... 56 4.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn ...................................................... 57 4.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin gây bệnh Beta thalassemia ....... 58 4.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen β-globin ..... 58 vi
4.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................. 61 4.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ....................... 70 4.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền ............................................................. 70 4.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu .............................. 81 4.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ ......................................... 84 4.3.4. Tỷ lệ các thể bệnh trong phả hệ nghiên cứu .................................. 84 4.3.5. Kiểu hình huyết học của các thể bệnh Beta thalassemia trong các phả hệ ................................................................................................................ 85 4.4. Tư ấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong các phả hệ nghiên cứu ...................................................................................... 87 4.4.1. Kiến thức đúng về bệnh Beta thalassemia ..................................... 87 4.4.2. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia ............ 88 4.4.3. Kiến thức đúng về phòng bệnh Beta thalassemia .......................... 89 4.4.4. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta thalassemia ....................................................................................................... 89 CHƯƠNG V. THẢO LUẬN .......................................................................... 91 5.1. ặc điểm của đối tượng nghiên cứu ......................................................... 91 5.1.1. Đặc điểm của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến ............. 91 5.1.2. Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ ..................................... 92 5.1.3. Đặc điểm của đối tượng tư vấn ...................................................... 92 5.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh Beta thalassemia ............. 93 5.2.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng để xác định đột biến gen beta globin ........................................................................................................ 93 5.2.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................. 97 5.3. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ..................... 110 5.3.1. Xây dựng phả hệ di truyền ........................................................... 110 5.3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu ........................... 115 5.3.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ nghiên cứu ................... 117 5.3.4. Các thể bệnh Beta thalassemia và kiểu hình huyết học ............. 117 vii
5.3.5. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sàng lọc các thể bệnh trong gia đình bệnh nhân và cộng đồng ......................................................................... 123 5.4. Tư ấn di truyền cho người mang gen đột biến trong các phả hệ .......... 126 5.4.1. Kiến thức về bệnh Beta thalassemia ............................................ 126 5.4.2. Kiến thức về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia ................... 129 5.4.3. Kiến thức về phòng bệnh Beta thalassemia ................................ 130 5.4.5. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta thalassemia ..................................................................................................... 131 CHƯƠNG VI. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................ 135 6.1. Kết luận .................................................................................................... 135 6.1.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long ................................................... 135 6.1.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia ........... 135 6.1.3. Tư vấn di truyền cho người mang gen trong 12 phả hệ ............. 136 6.2. ề xuất ..................................................................................................... 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 137 PHỤ LỤC Phụ lục 1: tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu. Phụ lục 2: phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia Phụ lục 3: phiếu thông tin Phụ lục 4: bộ câu hỏi đánh giá kiến thức tư vấn di truyền Phụ lục 5: kết quả MLPA trên gen α/β-globin của bệnh nhân Nguyễn Thị Thu H và Nguyễn Thị Mộng N Phụ lục 6: danh sách bệnh nhân tham gia xác định kiểu đột biến Phụ lục 7: danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ viii
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức 7 Bảng 2.2 Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới 9 Bảng 2.3 Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ 10 Bảng 2.4 Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo 11 chủng tộc Bảng 2.5 Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng 12 của các thể bệnh -Thal Bảng 2.6 Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng 13 của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE Bảng 2.7 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán β- 15 Thal Bảng 2.8 Tỷ lệ 8 loại đột biến phổ biến trong nghiên cứu ở người Việt 30 Nam Bảng 3.1 Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu 35 Bảng 3.2 Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen -globin 45 Bảng 3.3 Chỉ số DQ đọc kết quả MLPA 47 Bảng 3.4 Trình tự các primer trong phản ứng GAP-PCR 48 Bảng 3.5 Kích thước các loại đột biến 48 Bảng 4.1 Đặc điểm tuổi của đối tượng tham gia xác định kiểu đột biến 55 Bảng 4.2 Phân bố giới tính theo các dân tộc của đối tượng tham gia 55 xác định kiểu đột biến Bảng 4.3 Đặc điểm nơi cư trú của đối tượng tham gia xác định kiểu đột 56 biến Bảng 4.4 Phân bố độ tuổi, giới tính theo các dân tộc của đối tượng xây 57 dựng phả hệ Bảng 4.5 Đặc điểm chung về tuổi, nghề nghiệp, trình độ, quan hệ với 57 bệnh nhân của đối tượng tư vấn Bảng 4.6 Các kiểu đột biến phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự và loại 60 ix
β-Thal Bảng 4.7 Số lượng bệnh nhân mang 2 đột biến và 1 đột biến theo dân 62 tộc Bảng 4.8 Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông 62 Cửu Long Bảng 4.9 Thể bệnh, kiểu phối hợp đột biến và dân tộc của 3 bệnh nhân 63 mang đột biến mới Bảng 4.10 Chỉ số huyết học và hemoglobin của các đột biến mới 63 Bảng 4.11 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Kinh 64 Bảng 4.12 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Khmer 65 Bảng 4.13 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Hoa 65 Bảng 4.14 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Chăm 66 Bảng 4.15 Tỷ lệ các kiểu gen trên 341 bệnh nhân 66 Bảng 4.16 Tỷ lệ các thể bệnh trên 341 bệnh nhân 67 Bảng 4.17 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh 67 nhân β-Thal đồng hợp tử Bảng 4.18 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh 68 nhân β-Thal dị hợp tử kép Bảng 4.19 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh 69 nhân dạng phối hợp HbE/β-Thal Bảng 4.20 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh 70 nhân β-Thal dị hợp tử Bảng 4.21 Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ 83 Bảng 4.22 Tỷ lệ mang gen bệnh theo dân tộc trong 12 phả hệ 83 Bảng 4.23 Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ 84 Bảng 4.24 Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ 84 Bảng 4.25 Đặc điểm huyết học của các thể bệnh β-Thal trong phả hệ 85 Bảng 4.26 Đặc điểm thành phần Hb của các thể bệnh β-Thal trong phả 86 hệ Bảng 4.27 Kiến thức đúng về bệnh β-Thal 87 x
Bảng 4.28 Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal 88 Bảng 4.29 Kiến thức đúng về phòng bệnh β-Thal 89 Bảng 4.30 Kết quả chẩn đoán trước sinh của các cặp vợ chồng mang 90 gen bệnh Bảng 5.1 Ưu khuyết điểm của kỹ thuật RDB, SEQ, MLPA 97 Bảng 5.2 Tỷ lệ 8 kiểu đột biến của nghiên cứu so sánh với nghiên cứu 98 khác Bảng 5.3 Phân bố các kiểu đột biến của nghiên cứu so với một số nước 99 tại khu vực Đông Nam Á xi
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Cấu trúc gen -Thal 5 Hình 2.2 Di truyền bệnh -Thal 5 Hình 2.3 Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal 6 Hình 2.4 Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á 8 Hình 2.5 Bệnh nhân -Thal thể nặng 12 Hình 2.6 Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội NST thường 19 Hình 2.7 Chọc dò dịch ối qua màng bụng 24 Hình 2.8 Sinh thiết gai rau qua âm đạo 25 Hình 2.9 Nguyên lý của kỹ thuật ARMS-PCR 26 Hình 2.10 Đọc kết quả của phương pháp ARMS-PCR 26 Hình 2.11 Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên phần mềm 27 Hình 2.12 Các bước chính trong kỹ thuật MLPA 28 Hình 3.1 Biểu đồ kết quả điện di Hemoglobin 40 Hình 3.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Kit 42 QIAGEN Hình 3.3 Các bước chính trong kỹ thuật RDB 42 Hình 3.4. Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh -Thal tương ứng 43 Hình 3.5 Đọc kết quả kỹ thuật RDB 44 Hình 3.6 Đọc kết quả giải trình tự 45 Hình 3.7. Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật MLPA 46 Hình 3.8 Kết quả của kỹ thuật MLPA 47 Hình 3.9 Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến α-Thal trên 48 gel Hình 4.1 Kết quả một số mẫu bệnh nhân phát hiện đột biến bằng 59 RDB Hình 4.2 Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA được phát hiện 60 bằng SEQ xii
Hình 4.3 Đột biến (δ)del được phát hiện bằng MLPA 61 Hình 5.1 Test sức bền thẩm thấu hồng cầu 125 Hình 5.2 Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu HbE (bên phải) và mẫu 126 bình thường Sơ đồ 2.1 Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi α ở bệnh nhân β-Thal 6 Sơ đồ 3.1 Các bước chính trong nghiên cứu 51 Sơ đồ 4.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đã thực 58 hiện Sơ đồ 4.2 Phả hệ gia đình Kinh 01 71 Sơ đồ 4.3 Phả hệ gia đình Kinh 02 72 Sơ đồ 4.4 Phả hệ gia đình Kinh 03 72 Sơ đồ 4.5 Phả hệ gia đình Kinh 04 73 Sơ đồ 4.6 Phả hệ gia đình Kinh 05 74 Sơ đồ 4.7 Phả hệ gia đình Kinh 06 75 Sơ đồ 4.8 Phả hệ gia đình Kinh 07 76 Sơ đồ 4.9 Phả hệ gia đình Khmer 01 77 Sơ đồ 4.10 Phả hệ gia đình Khmer 02 78 Sơ đồ 4.11 Phả hệ gia đình Khmer 03 79 Sơ đồ 4.12 Phả hệ gia đình Hoa 79 Sơ đồ 4.13 Phả hệ gia đình Chăm 80 Sơ đồ 4.14 Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và các đột 82 biến trong 12 phả hệ nghiên cứu Sơ đồ 5.1 Sơ đồ phòng bệnh β-Thal cho gia đình bệnh nhân và 124 cộng đồng Biểu đồ 4.1 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 01 71 Biểu đồ 4.2 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 02 71 Biểu đồ 4.3 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 03 72 Biểu đồ 4.4 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 04 73 Biểu đồ 4.5 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 05 74 xiii
Biểu đồ 4.6 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 06 75 Biểu đồ 4.7 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 07 76 Biểu đồ 4.8 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 01 77 Biểu đồ 4.9 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 02 77 Biểu đồ 4.10 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 03 78 Biểu đồ 4.11 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Hoa 79 Biểu đồ 4.12 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Chăm 80 Biểu đồ 4.13 Kiến thức đúng về các đặc điểm lâm sàng trước và sau tư 88 vấn xiv
TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng việt ARMS Amplification refractory Hệ thống nhân bản đột biến mutation system chịu nhiệt ASO Allele-specific Oligonucleotide đặc trưng alen oligonucleotide β-Thal Beta Thalassemia Cd Codon Bộ ba giải mã DCIP 2,6‐dichlorophenolindophe Test tủa HbE nol DGGE Denaturing gradient gel Điện di DNA biến tính trên gel electrophoresis gradient ddNTP Dideoxynucleotide DQ Dosage quotient Liều lượng ĐB Đột biến ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long Hb Hemoglobin HMO Health maintenance Tổ chức bảo vệ sức khỏe organization HLA Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người MCH Mean Corpuscular Số lượng hemoglobin trung Hemoglobin bình trong một hồng cầu MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình một hồng cầu MLPA Multiplex Ligation- Khuếch đại đa đoạn dò dependent Probe Amplification NST Nhiễm sắc thể OF Osmotic fragility Test đo sức bền thẩm thấu hồng cầu PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi Probe Đoạn dò RBC Red blood cell Hồng cầu RDB Reverse Dot Blot Lai dò ngược SEQ Sequencing Giải trình tự xv
TRC Thalassemia reseach center Trung tâm Thalassemia TIF Thalassaemia International Liên đoàn Thalassemia thế giới Federation TVDT Tư vấn di truyền WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới WT Wild type alleles Alen hoang dã ( Alen không mang ĐB) xvi
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này (Harper, P., 2010; Higgs, D.R. et al, 2011). Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người (Laosombat, V., 2001; Dương Bá Trực và ctv, 2002; Eleftheriou, A., 2003). Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β- Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc. Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán. Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp. Đây là lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này (Cai, S. and Chehab, F.F, 1996; Gallanello, R., 2005). Liên đoàn thalassemia thế giới (TIF) đã đưa ra chương trình quản lý bệnh bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị cũng như quản lý lâu dài lại đòi hỏi rất nhiều nguồn lực. Một số ít quốc gia có tần suất bệnh thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH
Luận án tốt nghiệp tiến sĩ - Khóa 2013 Trường ĐHCT chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc nghiên cứu về tầm soát bệnh và chẩn đoán trước sinh (Cao, A. et al, 1996; Shu-Rern Chern and Chih-Ping Chen, 2000; Moghaddam, Z.K. et al, 2012). Với tỷ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam cũng rất cần một chương trình quản lý và phòng chống thalassemia. Do vậy, nghiên cứu ứng d ng các k thuật sinh học phân tử để tìm hiểu r các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh trong các gia đình là hết sức cần thiết. Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao ý thức về căn bệnh. Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết. Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh β-Thal ở trẻ em. Đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện nhằm có thêm thông tin về bệnh β-Thal trong khu vực. 1.2. Mục tiêu đề tài (1 ác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các k thuật sinh học phân tử. (2) ây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-thal trong phả hệ. (3 Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người mang gen bệnh được phát hiện trong các phả hệ nghiên cứu. 1.3. Ý nghĩa của luận án * Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo: - Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β- Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân (bệnh nhân ) khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. - Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. * Ý nghĩa về mặt xã hội: - Nâng cao hiểu biết của người mang gen về bệnh -Thal từ đó góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho người bị bệnh thalassemia. - Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện nghiên cứu & phát triển CNSH