Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm phân lập, tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. có khả năng sinh tổng hợp AVG từ đất trồng cây ăn quả của Việt Nam và xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao sử dụng cho trì hoãn sự chín của quả, đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM AMINOETHOXYVINYLGLYCINE TỪ Streptomyces spp. CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETHYLENE ĐỂ TRÌ HOÃN QUÁ TRÌNH CHÍN QUẢ GIAI ĐOẠN CẬN VÀ SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM AMINOETHOXYVINYLGLYCINE TỪ Streptomyces spp. CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TỔNG HỢP ETHYLENE ĐỂ TRÌ HOÃN QUÁ TRÌNH CHÍN QUẢ GIAI ĐOẠN CẬN VÀ SAU THU HOẠCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 94 20 201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trịnh Khắc Quang 2. PGS. TS. Phạm Anh Tuấn HÀ NỘI – 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Văn Nguyện
ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tận tình của các thầy, cô, bạn bè đồng nghiệp và các cơ quan. Đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu rau quả và các cơ quan hữu quan, các doanh nghiệp, các cá nhân và tập thể ở các địa phương đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án tiến sĩ này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Khắc Quang, PGS.TS Phạm Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các anh/chị đồng nghiệp Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm, Bộ môn Cây ăn quả đã rất nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Lãnh đạo và các cán bộ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu rau quả, Ban thông tin và đào tạo VAAS đã luôn động viên, tạo điều kiện và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo sư, Phó Giáo sư, Tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, ủy viên phản biện, ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc và tham gia hội đồng chấm luận án này. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình nội, ngoại, vợ, con tôi và bạn bè đã động viên, cổ vũ, khích lệ trong suốt quá trình thực hiện luận án.
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... x DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................xii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 5 1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả tươi ................................................................ 5 1.1.1. Trên thế giới ...................................................................................................... 5 1.1.2. Ở Việt Nam ....................................................................................................... 5 1.1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam (Citrus sinensis) ..................................... 6 1.1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối tiêu (Musa cavendish) ........................ 7 1.2. Đặc điểm quá trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa của quả trước và sau thu hoạch ........................................................................................................................... 9 1.3. Tác động của ethylene nội sinh đến quá trình sinh trưởng, phát triển và lão hóa của quả......................................................................................................................... 9 1.4. Các nghiên cứu ức chế hoạt động của ethylene nội sinh trước và sau thu hoạch12 1.4.1. Ức chế sinh tổng hợp ...................................................................................... 13 1.4.1.1. Kìm hãm enzyme ACS................................................................................. 13 1.4.1.2. Ức chế enzyme ACO ................................................................................... 13 1.4.1.3. Cạnh tranh cơ chất SAM .............................................................................. 14 1.4.2. Kìm hãm các thụ thể nhận biết ethylene ......................................................... 14 1.4.3. Loại bỏ ethylene .............................................................................................. 15 1.4.3.1. Hấp phụ ........................................................................................................ 15 1.4.3.2. Oxy hóa ........................................................................................................ 15 1.4.3.3. Xúc tác phân hủy .......................................................................................... 16
iv 1.4.3.4. Bộ lọc sinh học ............................................................................................. 16 1.5. Hoạt chất AVG .................................................................................................. 18 1.5.1. Cấu tạo phân tử AVG ...................................................................................... 18 1.5.2. Tính chất hóa lý của AVG .............................................................................. 19 1.5.3. Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene của AVG......................................... 19 1.5.3.1. ACS và các tác nhân kìm hãm ACS ............................................................ 19 1.5.3.2. Cơ chế ức chế ACS của AVG ...................................................................... 20 1.6. Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG.......................................... 21 1.6.1. Sản xuất AVG bằng xạ khuẩn Streptomyces spp. ........................................... 21 1.6.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces spp. ................................................. 21 1.6.1.2. Lên men xạ khuẩn Streptomyces spp. để sản xuất AVG ............................ 25 1.6.1.3. Tách và tinh sạch AVG ................................................................................ 25 1.6.1.4. Công nghệ tạo chế phẩm AVG .................................................................... 27 1.6.2. Sản xuất AVG bằng tổng hợp hóa học............................................................ 29 1.6.3. Kỹ thuật tạo các sản phẩm điều hòa sinh trưởng ............................................ 29 1.7. Các công trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG ....................................... 30 1.7.1. Giai đoạn trước thu hoạch .............................................................................. 30 1.7.1.1. Trên thế giới ................................................................................................. 30 1.7.1.2. Ở Việt Nam .................................................................................................. 31 1.7.2. Giai đoạn sau thu hoạch .................................................................................. 32 1.7.2.1. Trên thế giới ................................................................................................. 32 1.7.2.2. Ở Việt Nam .................................................................................................. 32 1.8. Những ý kiến rút ra từ tổng quan ...................................................................... 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 35 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 35 2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................ 35 2.1.2. Môi trường, hóa chất ....................................................................................... 35 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................. 36 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 36
v 2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu chung ............................................................... 36 2.2.1.1. Phân tích hàm lượng AVG bằng HPLC ....................................................... 36 2.2.1.2. Xác định pH dịch lỏng ................................................................................. 37 2.2.1.3. Xác định sinh khối chủng xạ khuẩn trong dịch lên men .............................. 37 2.2.1.4. Xác định hàm lượng chất khô tổng số trong dịch lỏng ................................ 37 Nhỏ 1 giọt mẫu dịch kiểm tra vào lăng kính của khúc xạ kế .................................... 37 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung................................................... 37 2.2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG........................................................................................................... 37 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng Streptomyces sp. đã lựa chọn ................................................................................................................ 40 2.2.2.3. Nghiên cứu làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hoãn quá trình chín quả ............................................ 43 2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG .................................. 49 2.2.3. Các phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 54 3.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG........................................................................................................... 54 3.1.1. Kết quả phân lập chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp AVG .............. 54 3.1.2. Đặc điểm hình thái chủng S6 .......................................................................... 57 3.1.2. Định tên chủng S6 ........................................................................................... 58 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng S6 ............................................................................................ 60 3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon ......................................................................... 60 3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................. 61 3.2.3. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng .......................................................... 62 3.2.4. Ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng.......................................................... 63 3.2.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống ........................................................................ 64
vi 3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................. 66 3.2.7. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan (DO) .............................................................. 67 3.2.8. Ảnh hưởng của pH môi trường ....................................................................... 68 3.2.9. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6.......................... 69 3.2.10. Tối ưu hóa một số thông số kỹ thuật cho lên men sinh tổng hợp AVG bằng chủng S6 .................................................................................................................... 71 3.3. Làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG .......................................................... 77 3.3.1. Làm sạch dịch chứa AVG bằng li tâm ............................................................ 77 3.3.2. Tinh sạch dịch chứa AVG sau li tâm bằng trao đổi ion .................................. 78 3.3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lưu dịch chứa AVG và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp phụ AVG trên cột trao đổi ion ..................................................................... 78 3.3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian lưu và tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG từ cột trao đổi ion............................................................................................. 79 3.3.2.3. Ảnh hưởng của pH dịch cấp đến khả năng hấp phụ AVG của cột trao đổi ion .............................................................................................................................. 81 3.3.2.4. Ảnh hưởng của pH dịch rửa giải đến hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao đổi ion .............................................................................................................................. 83 3.3.2.5. Mức độ tinh sạch AVG của dịch thu hồi sau trao đổi ion ............................ 83 3.3.2.6. Tăng cường tinh sạch AVG bằng nhiều cột trao đổi ion ............................. 84 3.3.3. Cô đặc dịch sau tinh sạch bằng trao đổi ion .................................................... 87 3.3.4. Thực nghiệm lên men, tinh sạch và cô đặc dịch chứa AVG ở quy mô lên men 100 lít/mẻ................................................................................................................... 88 3.3.5. Tạo chế phẩm AVG ........................................................................................ 90 3.3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào của không khí sấy đến hiệu suất thu hồi của chế phẩm AVG .......................................................................................................... 90 3.3.5.2. Ảnh hưởng nhiệt độ đầu ra của không khí sấy đến hiệu suất thu hồi của chế phẩm AVG ................................................................................................................ 91 3.3.5.3. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG ................................................................................................................ 92
vii 3.3.6. Chất lượng của chế phẩm AVG ...................................................................... 94 3.3.6.1. Các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG ........................................................ 94 3.3.6.2. Các chỉ tiêu sinh học của chế phẩm AVG ................................................... 95 3.3.6.3. Khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene trên quả tươi của chế phẩm AVG trong điều kiện thí nghiệm ........................................................................................ 97 3.3.7. Quy trình tạo chế phẩm AVG ......................................................................... 98 3.4. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG ......................................................... 100 3.4.1. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) ...................................................................... 100 3.4.1.1. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam .......... 100 3.4.1.2. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu cảm quan của cam ........ 102 3.4.1.3. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến sinh trưởng và phát triển của cây cam104 3.4.2. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) ............................. 106 3.4.2.1. Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch chuối ................... 106 3.4.2.2. Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian bảo quản chuối .................... 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 116 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 119 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 139
viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic axit ACO : 1-aminocyclopropane-1-Carboxylic axit oxidase ACS : Aminocyclopropane-1-cacboxylic axit synthase AOAC : Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống) AVG : Aminoethoxyvinylglycine CV : Coefficient of variation (hệ số biến động) DTT : DL-dithiothreitol ĐVTN : Động vật thí nghiệm EDTA : Ethylene diamine tetraacetic axit EIN : Ethylene insensitive (thụ thể chống nhạy cảm ethylene) ERS : Ethylene response sensor (thụ thể cảm biến phản ứng ethylene) ETR : Ethylene response (thụ thể phản ứng ethylene) GDP : Gross domestic product (tổng sản phẩm quốc nội) HEPES : 4-2-hydroxyetyl-1-piperazine etan sulfonic axit HPLC : High performance liquid chromatography LD50 : Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LeETR : Ethylene receptor family from tomato (họ thụ thể ethylene cà chua) LSD : Least significant difference (khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa) MES : 2-(N-morpholino) etan sulfonic axit MOPS : 3-(N-morpholino) propan sulfonic axit OECD : Organisation for economic co-operation and development (Tổ chức hợp tác và phát triển Kinh tế) ppm : Parts per million (một phần triệu) sp. : Species (một loài, chủng thuộc chi) SPE : Solid-phase extraction (chiết pha rắn)
ix spp. : Several species (một số loài thuộc chi) TAPS : 3-{[tri (hidroxymetyl) methyl] amino}propan sulfonic axit TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TSS : Total soluble solids (chất khô hòa tan tổng số) UV : Ultra violet (tia cực tím) VSTP : Vệ sinh thực phẩm
x DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang bảng 3.1 Khả năng ức chế xạ khuẩn S. cellulosae VTCC 41913 của dịch lên 54 men một số chủng có đặc điểm tương tự xạ khuẩn đã phân lập 3.2. Mô hình tối ưu 71 3.3 Kết quả thực nghiệm theo mô hình 72 3.4 Kết quả phân tích ANOVA mô hình 73 3.5 Sự phù hợp của mô hình 74 3.6 Ảnh hưởng của tốc độ li tâm đến khả năng loại bỏ xác tế bào và độ 77 tinh sạch của AVG trong dịch lên men chủng S6 3.7 Ảnh hưởng của thời gian lưu và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp 79 phụ AVG trên cột trao đổi ion 3.8 Ảnh hưởng của tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG từ 80 cột trao đổi ion 3.9 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hấp phụ AVG của cột trao đổi ion 82 3.10 Ảnh hưởng của pH rửa giải đến hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao 83 đổi ion 3.11 Mức độ tinh sạch AVG trong dịch thu hồi sau trao đổi ion 84 3.12 Khả năng tinh sạch AVG với nhiều cột liên tiếp 85 3.13 Tính toán tỉ lệ cô đặc dịch sau trao đổi ion cho 1 lít dịch lên men 87 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính chất của dịch cô đặc chứa AVG 88 3.15 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hình thái pellet, sinh khối và hàm 89 lượng AVG 3.16 Kết quả sản xuất, tinh sạch và cô đặc dịch chứa AVG quy mô 100 89 lít/mẻ 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào không khí sấy đến hiệu suất thu hồi và 91
xi chất lượng chế phẩm AVG 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu ra không khí sấy đến hiệu suất thu hồi và 92 chất lượng chế phẩm AVG 3.19 Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến hiệu suất thu hồi và chất 93 lượng chế phẩm AVG 3.20. Chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG 94 3.21. Khả năng ức chế xạ khuẩn S. cellulosae VTCC 41913 của chế 95 phẩm AVG 3.22. Chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm AVG 96 3.23. Một số chỉ tiêu kim loại nặng của chế phẩm AVG 96 3.24. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam 101 3.25. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến cảm quan của cam 103 3.26. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến thân tán của cây cam 105 3.27. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu về lộc đông cây 105 cam 3.28. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu về quả và năng 106 suất cam 3.29 Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến chất lượng của chuối sau quá 114 trình bảo quản
xii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang hình 1.1 Chu trình Yang 10 1.2. Sơ đồ nguyên lý sinh tổng hợp và truyền tín hiệu ethylene 11 1.3 Cơ chế ức chế hoạt động enzyme ACS nhờ phản ứng tạo phức 20 ketimine ACS-AVG 3.1. Khả năng ức chế xạ khuẩn S. cellulosae VTCC 41913 của dịch lên 55 men chủng S6 3.2. Khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng xạ khuẩn phân lập 55 được trên môi trường Gause II 3.3. Sắc ký đồ AVG chuẩn (Sigma)-HPLC, C18 56 3.4. Sắc ký đồ AVG sinh tổng hợp từ chủng S6-HPLC, C18 56 3.5. Ảnh khuẩn lạc sau 7 (a), 14 (b), 21 (c) ngày nuôi cấy và ảnh bào tử 57 của chủng S6 (d) 3.6. Kết quả nhân bản đoạn gen 16S rARN của chủng S6 58 3.7. Vị trí phân loại của chủng S6 và các loài có họ hàng gần 59 3.8. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 60 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 62 3.10. Ảnh hưởng của một số nguyên tố vi lượng đến khả năng sinh tổng 63 hợp AVG của chủng S6 3.11. Ảnh hưởng của một số nguyên tố đa lượng đến sinh tổng hợp AVG 64 của chủng S6 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến sinh trưởng và sinh tổng hợp 65 AVG của chủng S6 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG 66 của chủng S6 3.14. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sinh trưởng và sinh tổng hợp 67
xiii AVG của chủng S6 3.15. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của 69 chủng S6 3.16. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 70 3.17. Điểm tối ưu hàm lượng AVG của chủng S6 theo mô hình 75 3.18. Sinh khối chủng S6 trước (CT1) và sau tối ưu (CT2) 75 3.19. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng 76 AVG 3.20. Dịch tháo sau cột trong các điều kiện pH dịch lên men khác nhau 81 3.21. Sắc ký đồ chuẩn AVG 100ppm, cột Amino_axit_Xbrige 85 3.22. Sắc ký đồ dịch lên men sau li tâm, cột Amino_axit_Xbrige 86 3.23. Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 1, cột 86 Amino_axit_Xbrige 3.24. Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 2, cột 86 Amino_axit_Xbrige 3.25. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến sinh tổng hợp ethylene của 97 chuối ở 20oC 3.26. Độ chín của chuối tiêu hồng theo thời gian, đối chứng (a); chế 98 phẩm AVG (b); Retain (c) 3.27. Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm AVG dạng bột 98 3.28. Khả năng kéo dài thời gian thu hoạch chuối 107 3.29. Biến đổi độ tròn của các mẫu chuối theo thời gian 108 3.30. Biến đổi độ cứng của các mẫu chuối theo thời gian 108 3.31. Thay đổi tỉ lệ bột/vỏ của chuối theo thời gian 109 3.32. Biến đổi hàm lượng TSS của chuối theo thời gian 110 3.33. Tốc độ chín của chuối ở 13±0,5oC 111 3.34. Hô hấp của chuối trong quá trình bảo quản 112 3.35. Sản xuất ethylene của chuối trong quá trình bảo quản 112 3.36. Biến đổi độ cứng của chuối trong quá trình bảo quản 113
-1- MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài Năm 2019, mặt hàng rau quả nước ta tiếp tục đạt kim ngạch xuất khẩu với khoảng 3,74 tỷ USD, tương đương năm 2018, tăng 6,8% so với năm 2017 và 55,8% so với năm 2016 (Tổng cục Hải quan), vượt qua nhiều mặt hàng nông sản vốn là thế mạnh như chè, hạt tiêu, lúa gạo và trở thành một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực. Theo các chuyên gia, nhu cầu thị trường toàn cầu cho rau quả ngày càng tăng và sẽ đạt khoảng 320 tỷ USD vào năm 2020, đây là tiềm năng rất lớn cho phát triển của ngành rau quả Việt Nam. Điều kiện tự nhiên thuận lợi, người dân có trình độ canh tác cao, Việt Nam có nhiều lợi thế để phát triển ngành rau quả. Với diện tích và sản lượng rau quả không ngừng tăng qua các năm, đạt khoảng 1,8 triệu ha và 27 triệu tấn năm 2019, trong đó nhóm cây ăn quả đạt 1049,6 nghìn ha với sản lượng khoảng 10 triệu tấn/năm, tăng 5,7% so với năm 2018 (Tổng cục Thống kê, Hiệp hội rau quả Việt Nam, 2019). Tuy nhiên, do sản lượng lớn, thu hoạch tập trung, thời hạn sử dụng ngắn, tỉ lệ chế biến thấp, trên 90% rau quả được tiêu thụ ở dạng tươi trong khi công nghệ bảo quản hạn chế gây nhiều khó khăn cho người dân, doanh nghiệp trong tiêu thụ các sản phẩm rau quả, tiềm ẩn nguy cơ an toàn thực phẩm. Mặc dù nhiều biện pháp đã được áp dụng, tổn thất sau thu hoạch rau quả ở nước ta vẫn ở mức cao, 20- 25%. Để khai thác, phát huy tiềm năng và lợi thế của rau quả Việt Nam, ngoài việc triển khai đồng bộ các giải pháp hiện có, cần nghiên cứu ứng dụng các giải pháp công nghệ mới, tiên tiến theo chuỗi giá trị từ sản xuất đến bảo quản chế biến và tiêu thụ sản phẩm. Trong đó, việc nghiên cứu ứng dụng các các công nghệ thân thiện môi trường nhằm nâng cao giá trị, giảm tổn thất sau thu hoạch và tồn dư hóa chất độc hại trên rau quả là thực sự cần thiết. Trên thế giới, để kéo dài thời hạn sử dụng của rau quả, hạn chế tổn thất, nhiều chế phẩm sinh học và hóa học an toàn đã được nghiên cứu. Trong đó, hoạt chất aminoethoxyvinylglycine (AVG) tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces spp. đã được chứng minh là an toàn và có hiệu quả cao trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo
-2- quản nhiều loại quả tươi nhờ khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene-một phytohormon có hiệu ứng thúc đẩy quá trình chín và hư hỏng của quả trước và sau thu hoạch [30], [149]. Trước những hiệu quả và tính an toàn của hoạt chất AVG, hãng Valent BioSciences Corporation (Úc) đã phát triển và sản xuất thành công sản phẩm Retain và được ứng dụng khá phổ biến hiện nay ở nhiều nước phát triển cho trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản nhiều loại quả tươi. Để tăng cường năng lực cung cấp AVG đáp ứng nhu cầu thực tiễn, một số nghiên cứu tổng hợp AVG bằng phương pháp hóa học đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, kỹ thuật hiện tại cho thấy có quá nhiều dung môi và hóa chất độc hại phải sử dụng, quy trình tổng hợp và tinh sạch phức tạp, tốn kém cùng với hiệu suất tổng hợp còn quá thấp, 1-6% [93]. Do đó, phương pháp sinh học vẫn là hướng nghiên cứu chính hiện nay được sử dụng để sản xuất AVG. Nhu cầu sản phẩm như Retain hiện tại là không nhỏ không chỉ ở trong nước mà cả trên thế giới, trong khi đó, nước ta có khí hậu nhiệt đới với nguồn giống vi sinh vật rất phong phú và đa dạng, rất thuận lợi cho nghiên cứu, sản xuất các sản phẩm chứa hoạt chất sinh học như AVG. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn cùng tiềm năng của Việt Nam, trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu sinh học, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu sinh: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch”. 2. Mục đích của đề tài Phân lập, tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. có khả năng sinh tổng hợp AVG từ đất trồng cây ăn quả của Việt Nam và xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao sử dụng cho trì hoãn sự chín của quả, đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Đánh giá được khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu quả trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish). 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các chủng Streptomyces spp. có khả năng sinh tổng hợp AVG trong đất trồng cây ăn quả của Việt Nam. Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men,
-3- thu hồi và tạo chế phẩm AVG. Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo được trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish). 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 4.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch- Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, vùng trồng cam tại Hưng Yên, vùng trồng chuối tiêu hồng tại Thái Nguyên. 4.2. Thời gian nghiên cứu: từ 10/10/2013-10/10/2019 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp cơ sở khoa học, các dữ liệu liên quan đến các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. sinh tổng hợp AVG phân lập được từ đất tại một số vùng trồng cây ăn quả của Việt Nam, môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy, lên men, kỹ thuật tách chiết, thu hồi và tạo chế phẩm AVG. Kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt chất AVG. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. của Việt Nam góp phần bổ sung, hỗ trợ hiệu quả cho các giải pháp hiện có để tăng sản lượng, chất lượng của các loại quả tươi, tiến tới thay thế và loại bỏ từng phần các hợp chất bảo quản có nguồn gốc hóa học độc hại. 5.3. Tính mới của luận án Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu sản xuất chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. phân lập từ đất tại Việt Nam ứng dụng trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi; Xây dựng được quy trình công nghệ lên men, sinh tổng hợp AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. S6, tinh sạch hoạt chất AVG từ dịch lên men, tạo được chế phẩm AVG đạt hàm lượng hoạt chất 10% tính theo khối lượng; Quy trình này có thể áp dụng ở quy mô thích hợp để sản xuất ra chế phẩm AVG đáp ứng cho nhu cầu cấp bách của sản xuất nông nghiệp ở nước ta;
-4- Xây dựng được 02 quy trình sử dụng chế phẩm AVG tạo ra: (i) để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên, (ii) để kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái Nguyên. Chế phẩm AVG đảm bảo chất lượng và ATTP. Mặt khác, sử dụng chế phẩm AVG không ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất của cây trồng, chất lượng của quả. 6. Bố cục của Luận án Luận án gồm 118 trang (không kể phụ lục và tài liệu tham khảo), 29 bảng, 39 hình và 185 tài liệu tham khảo, được trình bày gồm 3 chương, 6 phần chính: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (30 trang); Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (62 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang).
-5- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả tươi 1.1.1. Trên thế giới Quả tươi chứa nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin, đường, axit hữu cơ, chất xơ, chất chống oxy hóa và khoáng chất cần thiết cho sức khỏe con người [66]. Với những giá trị và lợi ích mà quả tươi mang lại, nhu cầu về quả tươi trên thế giới ngày càng cao và không ngừng phát triển. Tiêu thụ quốc tế đã tăng khoảng 40%, châu Á tăng khoảng 50% trong giai đoạn từ 2005 đến 2016 [62]. Với dân số gần 8 tỷ người năm 2019 và dự kiến sẽ vượt quá 10 tỷ người vào năm 2050 [61], áp lực sản xuất thực phẩm trên toàn thế giới trong đó có quả tươi ngày càng lớn và có nguy cơ thiếu hụt. Tuy nhiên, tổn thất sau thu hoạch quả tươi trên toàn cầu vẫn cao, trung bình 15-38% [52], trong đó ở các nước đang phát triển khoảng 24-45% và các nước phát triển khoảng 2-20% [159]. Trong sản xuất quả tươi, các nước Đông Nam Á là các nhà sản xuất chính, đóng góp tới 66% tổng sản lượng quả tươi toàn cầu [18]. Nhưng với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, đặc tính suy giảm nhanh chóng và nghiêm trọng chất lượng sau khi thu hoạch, hạn chế về công nghệ bảo quản lả những rào cản thương mại quốc tế lớn nhất của quả tươi Đông Nam Á [177]. Giảm thiểu tổn thất thông qua kéo dài thời hạn sử dụng là một cách hiệu quả để tăng sản lượng. Giảm tổn thất quả tươi được coi là một yêu cầu chiến lược, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á [101]. 1.1.2. Ở Việt Nam Việt Nam là nước đang phát triển thuộc Đông Nam Á. Những năm gần đây, ngành rau quả đã có những bước phát triển đáng ghi nhận ở tất cả các khâu, từ chọn tạo giống, kỹ thuật canh tác đến sau thu hoạch và tiêu thụ với diện tích và sản lượng liên tục tăng qua các năm, đạt 1049,6 nghìn ha, tăng 59,6 nghìn ha so với năm 2018 [13], [14]. Trong đó, nhiều nhóm cây ăn quả có sản lượng cao như chuối 2100 nghìn tấn [16], cam 960,9 nghìn tấn,; bưởi 779,3 nghìn tấn, xoài đạt 814,8 nghìn tấn, thanh long 1.242,5 nghìn tấn [14].