Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 và tasiRNA-ARF trong điều kiện nhiệt độ cao và hạn ở cây Arabidopsis Thaliana

Chia sẻ: Chuheodethuong 09 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:147

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã theo chiều 5’-3’ do hoạt động của enzyme AtXRN4 trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao trên đối tượng cây mô hình Arabidopsis. Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã do hoạt động của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc hoa Arabidopsis khi bị tác động bởi điều kiện hạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 và tasiRNA-ARF trong điều kiện nhiệt độ cao và hạn ở cây Arabidopsis Thaliana

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HẢI ANH NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN AtXRN4 VÀ tasiRNA-ARF TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ CAO VÀ HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS THALIANA LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN HẢI ANH NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN AtXRN4 VÀ tasiRNA-ARF TRONG ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ CAO VÀ HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS THALIANA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số 62 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Motoaki Seki 2. PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng Hà Nội - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu để nhận học vị nào khác. Thông tin tổng hợp trong luận án được trích dẫn nguồn gốc một cách đầy đủ và chính xác. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh i
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam), Viện RIKEN (Nhật Bản) và ban đào tạo sau đại học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Motoaki Seki (Trưởng nhóm nghên cứu mạng lưới hệ gen thực vật – RIKEN CSRS) và PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng (Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp), đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ của nhóm nghiên cứu về mạng lưới hệ gen thực vật, Viện RIKEN, Nhật Bản - nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong đề tài luận án, đã tạo điều kiện và thời gian cho tôi hoàn thành luận án này. Để hoàn thành luận án, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................i LỜI CẢM ƠN......................................................................................................ii MỤC LỤC..........................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................viii DANH MỤC BẢNG............................................................................................x DANH MỤC HÌNH............................................................................................xi MỞ ĐẦU..............................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài...................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài........................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài........................................................................2 3.1. Nội dung 1: Xác định vai trò của enzyme 5'-3' exoribonuclease (AtXRN4) trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen trong điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao..........................................................................................................2 3.2. Nội dung 2: Xác định vai trò của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc hoa trong điều kiện hạn..........................................................2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..........................................................................3 4.1. Ý nghĩa khoa học..........................................................................................3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn...........................................................................................4 5. Tính mới của nghiên cứu.................................................................................4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................6 1.1. Đặt vấn đề.....................................................................................................6 1.1.1. Biến đổi khí hậu làm tăng nhiệt độ bề mặt trái đất, gây nên hiện tượng hạn hán trên diện rộng..........................................................................................7 1.1.2. Tác động của nhiệt độ cao và hạn hán đến thực vật.................................11 1.1.2.1. Tác động của nhiệt độ cao lên thực vật................................................11 1.1.2.2. Tác động của hạn hán đến thực vật.......................................................12 1.1.3. Phản ứng của thực vật với các điều kiện bất thuận: nhiệt độ cao và hạn hán......................................................................................................................14 iii
1.1.3.1. Phản ứng của thực vật khi bị tác động bởi nhiệt độ cao.......................14 1.1.3.2. Phản ứng của thực vật khi bị tác động bởi điều kiện hạn hán...............16 1.2. Tổng quan về cơ chế điều hoà sau phiên mã..............................................17 1.2.1. Quá trình phân rã mRNA.........................................................................17 1.2.1.1. Các chu trình phân rã mRNA cơ bản....................................................17 1.2.1.2. Các chu trình phân rã mRNA đặc biệt..................................................23 1.2.2. Cơ chế điều hoà phiên mã thông qua các sRNA (small RNA)................29 1.2.2.1. mỉNA.....................................................................................................31 1.2.2.2. siRNA....................................................................................................34 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu về vai trò của enzyme AtXRN4 và tasi-RNA ở thực vật...............................................................................................................38 1.3.1. Các nghiên cứu về chức năng và vai trò của enzyme AtXRN4 ở thực vật.......................................................................................................................38 1.3.2 Các nghiên cứu về vai trò và chức năng của tasiRNA ở thực vật.............45 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................49 2.1. Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................49 2.1.1. Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 trong chống chịu nhiệt độ cao.....................................................................................49 2.1.2. Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu vai trò của tasiRNA liên quan đến hình thành cấu trúc hoa của cây Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn......................................................................................................................50 2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu......................50 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu................................................................................51 2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................51 2.2.1. Xử lý hạt trong nuôi cấy in vitro..............................................................51 2.2.2 Nuôi cấy in vitro.......................................................................................51 2.2.3. Nuôi cấy trong nhà kính..........................................................................52 2.2.4. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu nhiệt................................................52 iv
2.2.4.1. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu nhiệt độ cao của các dòng đột biến…………………………………………………………………………….52 2.2.4.2. Thí nghiệm đánh giá khẳ năng chịu nhiệt của các dòng đột biến có bổ sung bước thích nghi nhiệt độ............................................................................53 2.2.5. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn..................................................53 2.2.6. Thí nghiệm so sánh mật độ và kích thước khí khổng ở cây WT và cây đột biến atxrn4-3......................................................................................................53 2.2.7. Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA.....................................................54 2.2.7.1. Tách chiết mRNA.................................................................................54 2.2.7.2. Tổng hợp cDNA...................................................................................55 2.2.8. Phương pháp RT-PCR.............................................................................56 2.2.9. Phương pháp qRT-PCR...........................................................................57 2.2.9.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 đến khả năng chịu nhiệt độ cao.......................................................................................58 2.2.9.2. Các cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu vai trò của tasiRNA-ARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn..........................59 2.2.10. Phân tích biểu hiện gen bằng phương pháp Microarray........................60 2.2.10.1. Phân tích biểu hiện gen bằng Microarray trong nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 trong điều kiện chịu nhiệt độ cao..................................................60 2.2.10.2. Phân tích biểu hiện gen bằng Microarray trong nghiên cứu vai trò của tasiRNA-ARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn......................................................................................................................61 2.2.11. Phân tích mức độ phân rã mRNA..........................................................62 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................63 3.1. Kết quả nghiên cứu vai trò của gen AtXRN4 trong điều kiện chịu nhiệt độ cao......................................................................................................................63 3.1.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây WT và cây đột biến atxrn4 khi nhiệt độ tăng nhanh đến ngưỡng gây chết..................................................................63 v
3.1.2. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 đến khả năng làm mát và thoát hơi nước ở cây Arabidopsis......................................................................................68 3.1.3. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 đến việc hình thành khí khổng và kích thước khí khổng ở Arabidopsis..........................................................................72 3.1.4. Đánh giá tác động của đột biến gen AtXRN4 đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của hệ gen ở Arabidopsis...........................................................................74 3.1.5. Đánh giá tác động của gen AtXRN4 đến sự thay đổi mức độ biểu hiện của các gen thuộc nhóm cảm ứng nhiệt ở điều kiện thường....................................76 3.1.6. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 trong việc điều hoà mức độ biểu hiện một số gen liên quan đến khả năng thoát hơi nước ở Arabidopsis................... 90 3.1.7. Nghiên cứu xác định mRNA của các gen nào là mục tiêu để protein AtXRN4 phân rã…………………………….................……………………...92 3.1.8. Đánh giá vai trò của gen AtXRN4 đến việc điều khiển khả năng cảm ứng nhiệt ở Arabidopsis............................................................................................94 3.1.9. Đột biến gen HSFA2 làm mất khả năng chịu nhiệt độ cao và khả năng cảm ứng nhiệt của cây đột biến atxrn4-3...........................................................97 3.2. Thảo Luận: Vai trò của gen AtXRN4 trong việc đáp ứng với điều kiện nhiệt độ cao.................................................................................................................99 3.3. Kết quả nghiên cứu vai trò của tasiRNA-ARF trong việc bảo đảm cấu trúc bình thường của hoa trong điều kiện hạn ở Arabidopsis.................................101 3.3.1. Đánh giá vai trò của tasiRNA-ARF đến việc hình thành hạt ở Arabidopsis thông qua đột biến gen RDR6......................................................101 3.3.2. Xác định nguyên nhân làm giảm khả năng thụ phấn ở cây Arabidopsis đột biến, mất khả năng sinh tổng hợp tasiRNA...............................................104 3.3.3. Đánh giá vai trò của tasiRNA trong việc điều khiển mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến hình thành cấu trúc hoa ở Arabidopsis.........................106 3.3.4. Đánh giá vai trò của tasiRNA đến việc điều hoà mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến việc hình thành cấu trúc hoa, các gen sinh tổng hợp và phản ứng với auxin……..........…………………………………………….....109 vi
3.4. Thảo luận: tasiRNA-ARF đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo cấu trúc thông thường của hoa ở cây Arabidopsis khi đáp ứng với điều kiện chịu hạn....................................................................................................................112 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................114 4.1. Kết luận.....................................................................................................114 4.2. Kiến nghị...................................................................................................115 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................116 vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ ABA Abscisic acid APX Ascorbate perosidase BTB Bắc Trung Bộ CAT Catalase Col-0 Columbia 0 cRNA Complementary RNA DCL Dice like protein DCP Decapping protein EJC Exon junction complex ERF Ethylene response factor FAO Food and Agriculture Organization FDR False discovery rate GO Gene ontology GR Glutathione HSE Heat shock element HSF Heat shock factor HSP Heat shock protein miRNA Micro RNA mRNA Messanger RNA MS Murashige and Skoog ncRNA Non-coding RNA NGD No-go decay NMD Nonsense mediate decay NSD Non-stop mRNA decay PABP Poly(A) binding-protein PAN Poly(A) binding-protein (PABP)-dependent poly(A) nuclease PARN Poly(A) ribonuclease PCR Polymerase chain reaction POD Peroxidase PTC Pemature termination codon PTGS Post transcriptional gene silencing ra-siRNA Repeat associated small interfering RNA RDR RNA dependent Rnase RISC RNA-induced silencing complex viii
RITS RNAi-induced transcriptional silencing complex RNAi RNA interference ROS Reactive Oxygen Species RT-PCR Reverse transcriptase polymease chain reaction RT-qPCR Reverse transcriptase quantitative polymease chain reaction SD Standard deviation siRNA Small interferon RNA snoRNA Small nucleolar RNA SOD Superoxide dismutase T-DNA Transfer DNA tasiRNA trans-acting siRNA TGS Transcriptional gene silencing UTR Untranslated reagion VCS VARISCO WT Wild type XRN Exoribonuclease ix
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh sự khác biệt và tương đồng giữa sRNA và mRNA…...…..30 Bảng 1.2. So sánh sự khác nhau giữa miRNA và siRNA..................................33 Bảng 2.1. Các cặp mồi RT-qPCR sử dụng trong nghiên cứu vai trò của gen ATXRN4 đến khả năng chịu nhiệt độ cao…………………..................……….58 Bảng 2.2 Các cặp mồi RT-PCR sử dụng cho nghiên cứu vai trò tasiRNA-ARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn ….......…...59 Bảng 2.3. Các cặp mồi RT-qPCR sử dụng cho nghiên cứu vai trò của tasiRNA- ARF đến hình thành cấu trúc hoa Arabidopsis trong điều kiện chịu hạn..........60 Bảng 3.1 Danh sách 88 gen thuộc nhóm “đáp ứng với điều kiện bất thuận” tăng mức độ biều hiện ở cây đột biến atxrn4-3 so với cây WT đồng thời cũng tăng mức độ biểu hiện do nhiệt độ cao ở WT............................................................77 Bảng 3.2. Danh sách các gen thuộc nhóm “đáp ứng với nhiệt dộ” (GO:0009408) tăng mức độ biểu hiện trên dòng đột biến atxrn4-3 so với WT trong điều kiện nhiệt dộ thường ........................................................................86 Bảng 3.3. So sánh mức độ biểu hiện của gen liên quan đến hình thành và cấu trúc của khí khổng giữa cây đột biến atxrn4-3 và cây WT ở điều kiện thường…………………………………………………………………………91 x
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mức độ biến đổi của nhiệt độ trung bình bề mặt trái đất....................8 Hình 1.2. Thay đổi về số lượng ngày/đêm lạnh, ngày/đêm nóng trên toàn cầu........................................................................................................................9 Hình 1.3. Tình hình khan hiếm nước ngọt trên thế giới....................................10 Hình 1.4. Tác động của hạn hán đến (A) quá trình sinh trưởng của thực vật (B) quá trình quang hợp của thực vật.......................................................................13 Hình 1.5. Cơ chế đáp ứng các yếu tố bất thuận phi sinh học thông qua các HSF và HSP ..............................................................................................................15 Hình 1.6. Cơ chế đáp ứng điều kiện hạn ở thực vật..........................................17 Hình 1.7. Các chu trình phân rã mRNA cơ bản ở sinh vật đa bào....................18 Hình 1.8. Chu trình phân rã mRNA theo cơ chế kiểm soát NMD....................27 Hình 1.9. Chu trình phân rã RNA theo các cơ chế NGD (A) và NSD (B).......28 Hình 1.10. Phân loại RNA. RNA được phân thành hai nhóm chính: nhóm mã hoá và nhóm không mã hoá...............................................................................29 Hình 1.11. Quá trình sinh tổng hợp và hoạt động của miRNA.........................32 Hình 1.12. Cơ chế sinh tổng hợp và vai trò của các siRNA.............................35 Hình 1.13. Quá trình sinh tổng hợp và hoạt động của tasiRNA.......................37 Hình 1.14. Mô hình thể hiện cơ chế phân rã các trình tự mRNA đầu 3’ là sản phẩm của quá trình phân rã bằng miRNA.........................................................39 Hình 1.15. Mô hình thể hiện vai trò phân rã các mRNA không mũ m7Gpp và đuôi poly(A) của enzyme AtXRN4...................................................................41 Hình 1.16. Vai trò của enzyme AtXRN4 trong điều hoà đáp ứng Ethylene.....43 Hình 1.17. Sơ đồ miêu tả vai trò của tasiRNA-ARF trong việc điều hoà số lượng mRNA của các gen ARF, từ đó tác động đến việc kéo dài rễ phụ ở cây Arabidopsis........................................................................................................47 Hình 3.1. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng tỷ lệ sống sót của cây Arabidopsis khi nhiệt độ tăng nhanh đến ngưỡng gây chết...............................65 xi
Hình 3.2. Đột biến ở gen AtXRN4 làm giảm tỷ lệ sống sót của cây Arabidopsis khi nhiệt độ tăng đến ngưỡng gây hại................................................................67 Hình 3.3. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng làm mát ở Arabidopsis trong điều kiện nhiệt độ cao...............................................................................69 Hình 3.4. Đột biến ở gen AtXRN4 làm tăng khả năng thoát hơi nước ở Arabidopsis........................................................................................................71 Hình 3.5. Đột biến gen AtXRN4 làm thay đổi kích thước khí khộng ở Arabidopsis........................................................................................................73 Hình 3.6. Phân tích mức độ biểu hiện của hệ gen Arabidopsis khi gen AtXRN4 bị đột biến trong điều kiện nhiệt độ thường và nhiệt độ cao..............................75 Hình 3.7. So sánh mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ cao giữa........................................................................................89 Hình 3.8. mRNA của hai gen HSFA2 và ERF1 là mục tiêu trực tiếp để phân rã của AtXRN4 ở điều kiện nhiệt độ thường.........................................................93 Hình 3.9. Enzyme AtXRN4 đóng vai trò phân rã mRNA của HSFA2 khi cây được đưa về nhiệt độ thường sau quá trình cảm ứng nhiệt................................96 Hình 3.10. Đột biến ở gen HSFA2 làm mất đi khả năng chịu nhiệt độ cao và khả năng cảm ứng nhiệt của cây đột biến atxrn4-3...........................................98 Hình 3.11. Đột biến gen RDR6 làm giảm khả năng thụ phấn của Arabidopsis trong điều kiện hạn...........................................................................................103 Hình 3.12. Đột biến gen RDR6 làm thay đổi tương quan chiều dài giữa nhị và nhuỵ hoa ở Arabidopsis...................................................................................105 Hình 3.13. Quá trình làm câm gen bằng tasiRNA-ARF đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc hoa ở Arabidopsis trong điều kiện hạn............108 Hình 3.14. Kết quả phân tích hệ gen ở nụ hoa của cây WT và cây đột biến rdr6 trong điều kiện thường và điều kiện hạn..........................................................111 xii
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Áp lực gia tăng dân số cùng với việc biến đổi khí hậu đã và đang tác động mạnh mẽ đến hệ sinh thái, đặc biệt là cây trồng. Tăng dân số cùng với các yếu tố khác như: nhiệt độ tăng, hạn hán, ngập mặn làm cho diện tích cũng như sản lượng của cây nông nghiệp bị suy giảm nặng nề, ảnh hưởng lớn đến an ninh lương thực toàn thế giới. Để khắc phục các thực trạng trên, ngoài việc giảm thiểu các nguy cơ gây ô nhiễm môi trường, các nguy cơ làm thiếu hụt nguồn tài nguyên thì việc nghiên cứu, chọn tạo ra các giống cây trồng có khả năng tăng sức chống chịu với các điều kiện bất thuận cũng sẽ là mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học. Việc nghiên cứu cơ chế đáp ứng với các điều kiện bất thuận vì thế là vấn đề tiên quyết giúp tạo nên cơ sở khoa học để tiến hành cải tạo các giống cây trồng phục vụ cho an ninh lương thực và phát triển công nghiệp. Quá trình đáp ứng với các điều kiện bất thuận ở thực vật thông qua nhiều chu trình sinh lý khác nhau, dựa trên việc điều khiển mức độ biểu hiện các gen liên quan. Các nghiên cứu đã cho thấy không chỉ quá trình điều hoà trước phiên mã mà cả quá trình điều hoà sau phiên mã cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giúp thực vật đáp ứng với các điều kiện bất thuận phi sinh học (Hirayama and Shinozaki, 2010). Để bổ sung cơ sở dữ liệu về cơ chế điều hoà biểu hiện gen sau phiên mã, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập chung xác định và đánh giá vai trò của chu trình phân rã mRNA cơ bản, có sự tham gia của enzyme 5'-3' exoribonuclease trong việc đáp ứng điều kiện nhiệt độ cao. Chúng tôi cũng đồng thời nghiên cứu vai trò của cơ chế bất hoạt gen bằng tasiRNA trong việc đáp ứng điều kiện hạn hán. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu này tập chung vào hai mục tiêu chính: - Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã theo chiều 5’-3’ do hoạt động của enzyme AtXRN4 trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao trên đối tượng cây mô hình Arabidopsis. - Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã do hoạt động của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc hoa Arabidopsis khi bị tác động bởi điều kiện hạn. 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài 3.1. Nội dung 1: Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã theo chiều 5’-3’ do hoạt động của enzyme AtXRN4 trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ cao trên đối tượng cây mô hình Arabidopsis. - Xác định tác động của đột biến gen AtXRN4 đến hình thái phát triển của cây Arabidopsis trong điều kiện nhiệt độ thường và nhiệt độ cao. - Xác định tác động của đột biến gen AtXRN4 đên mức độ biểu hiện của hệ gen, sàng lọc các nhóm gen liên quan đến khả năng đáp ứng chịu nhiệt độ cao ở cây Arabidopsis bằng phương pháp microarray và RT- qPCR. - Xác định được các gen có mRNA là mục tiêu trực tiếp để phân rã do enzyme AtXRN4, đồng thời xác định vai trò của các gen này trong việc đáp ứng điều kiện nhiệt độ cao. 3.2. Nội dung 2: Xác định vai trò của cơ chế điều hoà sau phiên mã do hoạt động của tasiRNA-ARF trong việc hình thành và phát triển cấu trúc hoa Arabidopsis khi bị tác động bởi điều kiện hạn 2
- Đánh giá sự khác biệt về kiểu hình do việc mất khả năng sinh tổng hợp tasiRNA-ARF trong điều kiện chịu hạn. - Xác định vai trò của tasiRNA-ARF lên mức độ biểu hiện của hệ gen, sàng lọc được các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu hạn bằng phương pháp microarray. - Phân tích mức độ biểu hiện của một số gen đặc trưng liên quan đến việc hình thành cấu trúc hoa trong điều kiện chịu hạn, khẳng định việc thay đổi cấu trúc hoa sau khi xử lý hạn liên quan đến vai trò điều hoà sau phiên mã của tasiRNA-ARF. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu này sẽ góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về vai trò của điều hoà sau phiên mã, đáp ứng với các yếu tố bất thuận phi sinh học, từ đó cho thấy không chỉ quá trình điều hoà biểu hiện gen trước phiên mã mà quá trình điều hoà sau phiên mã cũng góp phần quan trọng để cây trồng có thể đáp ứng với các điều kiện bất thuận. Nghiên cứu xác định được vai trò của enzyme AtXNR4 trong việc đảm bảo số lượng mRNA của các gen HSFA2 và ERF1 luôn ở mức độ cho phép trong điều kiện thường, vai trò này của enzyme AtXNR4 còn được thể hiện trong việc kiểm soát lượng mRNA của gen HSFA2 trong điều kiện cảm ứng nhiệt, nhanh chóng đưa cây trở lại trạng thái phiên mã bình thường sau khi nhiệt độ thay đổi từ mức cao xuống mức bình thường. Nghiên cứu này cũng chỉ ra được quá trình điều hoà sau phiên mã thông qua tasiRNA-ARF là cần thiết, để đảm bảo việc hình thành cấu trúc hoa ở Arabidopsis được diễn ra bình thường, trong trường hợp cây bị tác động bởi điều kiện hạn hán. 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm cơ sở dữ liệu để từ đó các nghiên cứu ứng dụng có thể được thực hiện, nhằm áp dụng các chu trình điều hoà sau phiên mã làm thay đổi mức độ biểu hiện của hệ gen hay một số gen nhất định trong các điều kiện bất thuận. Đối với mRNA của các gen là mục tiêu trực tiếp để phân rã của AtXRN4, việc tìm ra các trình tự gắn đặc hiệu để AtXRN4 có thể gắn vào sẽ có một ý nghĩa quan trọng. Khi các trình tự này bị biến đổi, AtXRN4 có thể sẽ không gắn được vào mRNA từ đó mất khả năng phân rã. Việc này có thể sẽ giúp các nhà khoa học có thêm phương tiện để nghiên cứu điều hoà biểu hiện gen đáp ứng với các điều kiện bất thuận Ở thực vật, mức độ biểu hiện của các gen ARF chịu tác động chủ yếu bởi hàm lượng auxin nội sinh, lượng auxin này sẽ biến đổi tuỳ thời kỳ sinh trưởng cũng như do tác động của các yếu tố môi trường. Việc nắm được cơ chế điều hoà sau phiên mã của các gen ARF cũng sẽ giúp các nhà khoa học có thêm phương thức can thiệp vào việc điều khiển mức độ biểu hiện của các gen này trong các điều kiện bất thuận, từ đó tạo nên các giống cây trồng có khả năng chống chịu cao. 5. Tính mới của nghiên cứu Nghiên cứu cũng lần đầu tiên đưa ra được các gen cụ thể (ERF1 và HSFA2) có mRNA bị phân rã theo chiều 5'-3' do hoạt động của enzyme AtXRN4, từ đó khám phá thêm được vai trò của enzyme này trong việc điều hoà mức độ biểu hiện gen HSFA2 trong điều kiện thường cũng như điều kiện cảm ứng nhiệt. Nghiên cứu này cũng chứng minh được vai trò của tasiRNA-ARF trong việc đảm bảo sự phát triển bình thường của cấu trúc hoa ở Arabidopsis, chứng minh vai trò điều hoà sau phiên mã của tasiRNA đến 4
các gen chịu hạn và các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp và đáp ứng auxin. 5
CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặt vấn đề Công nghiệp hoá và hiện đại hoá nhanh chóng không chỉ mang lại lợi ích thiết yếu cho cuộc sống con người mà còn đem lại những tác động tiêu cực đến hệ sinh thái toàn cầu. Bùng nổ dân số cùng với sự phát triển xã hội đã và đang tạo áp lực lên hệ sinh thái bằng việc tận dụng tối đa nguồn tài nguyên tự nhiên như nhiên liệu hoá thạch, đất đai và nguồn nước... Tuy nhiên một trong những tác động tiêu cực nhất do quá trình phát triển nhanh chóng đó là làm biến đổi khí hậu toàn cầu theo hướng không mong muốn. Biến đổi khí hậu là hiện tượng thời tiết trung bình đặc thù của một vùng bị thay đổi. Nó có thể bao gồm thay đổi về lượng mưa trung bình, thay đổi về nhiệt độ trung bình hay các yếu tố thời tiết đặc thù khác (http://www.nasa.gov/audience/forstudents/5-8/features/nasa-knows/what- is-climate-change-58). Các tác động chủ yếu tạo nên biến đổi khí hậu bao gồm các yếu tố tự nhiên cũng như các yếu tố hình thành do tác động của con người thông qua quá trình sinh hoạt và phát triển. Những thiệt hại do biến đổi khí hậu gây ra đối với sự sống, đó là làm tăng số lượng và mức độ của các hiện tượng bất thuận phi sinh học như: nhiệt độ tăng cao, nhiệt độ xuống thấp, hạn hán, ngập mặn, nhiễm phèn... Các hiện tượng trên tác động một cách nhanh chóng đến môi trường sống của các loài sinh vật, từ đó tạo nên các hiện tượng bất thuận sinh học như: tăng cường sự phát triển của các loại bệnh do vi khuẩn, vi rút hay các yếu tố bất thuận sinh học khác. Trong các yếu tố bất thuận phi sinh học kể trên, nhiệt độ môi trường tăng cao và hạn hán là hai yếu tố gây tác động mạnh mẽ và trực tếp đến quá trình phát triển và sinh trưởng của thực vật, từ đó tác động tiêu cực đến năng suất và chất lượng cây trồng trên toàn thế giới. 6