Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:152

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn (VK) và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2021
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học TS. Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2021
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và TS. Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất cũng như động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất để tôi có thể thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện. Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn, đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tôi tình yêu thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và hoàn thành tốt nội dung luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 NCS. Phạm Quang Huy i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Các thông tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021 Tác giả NCS. Phạm Quang Huy ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... ix MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4 1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin .......................................................... 4 1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người. ....................................................................................................... 4 1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng.................... 5 1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm............................ 7 1.2. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ....................................................................................................... 12 1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm ......................... 12 1.2.2. Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin............ 13 1.2.3. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ........................................................................................ 18 1.3. Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs ................................................................................................. 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27 2.1. Vật liệu.......................................................................................................... 27 iii
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 27 2.1.2. Các hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................... 29 2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 30 2.1.4. Sơ đồ thí nghiệm .......................................................................................... 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 32 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome ..................... 32 2.2.2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu ...... 32 2.2.3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ............ 32 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like ........................... 33 2.2.5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV ...................................................................................................... 34 2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome ............................................... 35 2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA metagenome.................................................................................................. 35 2.2.8. Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR ................................ 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 39 3.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mô phòng thí nghiệm............................................................................ 40 3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng ..................... 40 3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng .................. 42 3.2. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR ......................................................................................................... 46 3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR ....................................... 46 iv
3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C và BHR......................................................................................................... 47 3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR................................................ 49 3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc tính lý hóa của đất ........................................................................................ 69 3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C và BHR ............................................................................... 70 3.2.6. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin ................................................................................................ 72 3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome đã được phát hiện ......................................................................................... 76 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................. 79 4.1. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR thu được. ........................................................................................ 79 4.2. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và khoáng hóa dioxin). ..................................................................................... 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 95 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................................ 97 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.................................................... 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 105 PHỤ LỤC v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn ....................................... 42 Bảng 3.2. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22 ................................................. 45 Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn ...................................... 45 Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao ....................................................... 47 Bảng 3.5. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48 Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48 Bảng 3.7. Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR ......... 52 Bảng 3.8. Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin ............................................. 57 Bảng 3.9. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và BHR ............................................................................................ 66 Bảng 3.10. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng trong tập dữ liệu chuẩn hóa......................................................... 71 Bảng 3.11. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4- D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ liệu KEEG ................................................................................... 72 vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB ................................. 4 Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T ....... 5 Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học. ................................................................................. 8 Hình 1.4. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học ............................ 20 Hình 1.5. Các bước thực hiện phân tích metagenomic ................................. 22 Hình 2.1. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) ................... 27 Hình 2.2. Mặt cắt dọc của lô xử lý................................................................ 28 Hình 2.3. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (ký hiệu BHR) ............................................................................... 28 Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu .......................................................... 31 Hình 2.5. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống MG RAST ..................................................................................... 37 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất .............................................................. 40 Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét..... 41 Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn ........................... 41 Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn ......................................................................................... 42 Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ................................. 43 vii
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921 ........... 43 Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn ....... 44 Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn ..... 45 Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose....................... 47 Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng ngoài) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq ............... 51 Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và BHR............................................................................................... 52 Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR ....... 53 Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR ........ 54 Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR ........ 55 Hình 3.15. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR ....... 56 Hình 3.16. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và BHR ............................................................................................... 63 Hình 3.17. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR............................................................................................... 63 Hình 3.18. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và BHR............................................................................................... 63 Hình 3.19. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR ...... 65 Hình 3.20. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR...... 65 Hình 3.21. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong metagenome của mẫu C và BHR .................................................. 70 Hình 3.22. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa metagenome C và BHR. ............................................................... 71 viii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích °C Độ C 1,2,3,7,8- 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin PeCDD 2,3,7,8- 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin/ furan TCDD/F 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (chất diệt cỏ) 2,4,5-TCP 2,4,5-trichlorophenol 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-DCP 2,4-dichlorophenol bp Base pair BQP Bộ Quốc phòng CDS Coding sequence (Trình tự mã hóa) Clusters of Orthologous Groups (Cơ sở dữ liệu về gen và COG protein) cs Cộng sự CSDL Cơ sở dữ liệu DBF Dibenzofuran DC Chất diệt cỏ DCĐ Dịch chiết đất DCP Dichlorophenol DD Dibenzo-p-dioxin DDD 1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene DDMS 1,1'-(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene) DDNU 1-chloro-4-[1-(4-chloro-phenyl) ethenyl]benzene DDT 1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane ix
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel DGGE građient biến tính) ĐGMT Đánh giá môi trường DNA Deoxyribonucleic Acid European Bioinformatics Institute (Ngân hang cơ sở dữ liệu EBI Châu Âu) evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous eggNOG Groups (Cơ sở dữ liệu về chú thích chức năng gen) United States Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ EPA Môi trường Hoa Kỳ) Gb Gigabyte High Resolution Gas Chromatography Mass Spectrometry HR-GC/MS (Sắc ký khí khối phổ độ phân giải cao) Integrated Microbial Genome (Hệ thống bộ gen vi sinh vật tích IMG hợp) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Cơ sở dữ liệu về KEGG gen và con đường chuyển hóa giả định) Mb Megabyte Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems MG-RAST Technology (Hệ thống phân tích tự động metagenome trực tuyến mã nguồn mở) MS Multiple Sampling (Lấy mẫu đa điểm) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (Hydrocarbon thơm đa PAH nhân) PCB Polychlorinated biphenyl PCDD Polychlorinated dibenzo-p-dioxin x
PCDF Polychlorinated dibenzofuran PCP Pentachlorophenol PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PFAM Protein families database (Cơ sở dữ liệu protein) POPs Persistent Organic Pollutants (Hợp chất hữu cơ khó phân hủy) Ppt Part per trillion (10-12) QCVN Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam RefSeq Reference Sequence (Cơ sở dữ liệu trình tự tham chiếu) RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Real time PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp theo thời gian thực) Single Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình SSCP sợi đơn) TCP Trichlorophenol TEF Toxic Equivalent Factor (Độ độc tương đương) Temperature Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel TGGE građient nhiệt) TNT Trinitrotoluen Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa T-RFLP hình chiều dài đoạn cắt cuối) United States Agency for International Development (Cơ quan USAID phát triển quốc tế của Hoa Kỳ) VK Vi khuẩn VK KK Vi khuẩn kị khí VK KSF Vi khuẩn khử sulfate VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn xi
1 MỞ ĐẦU Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ độc tương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam (Cecil, 1986). Hỗn hợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên bị phá hủy, sức khỏe di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều thế hệ, quần xã vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể đánh giá chính xác được. Do đó, ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng và ô nhiễm các hợp chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải được loại bỏ theo công ước Stockholm. Do đó, nghiên cứu đánh giá vai trò thực chất của các quần xã vi sinh vật trong tự nhiên cũng như trong các vùng đã và đang được xử lý khử độc là rất cấp thiết. Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụng phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism - SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain Reaction – RT PCR) tăng dần nhằm xây dựng công nghệ xử lý ô nhiễm với hiệu suất cao và triệt để hơn bởi vi sinh vật. Ở Việt Nam, quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m3 – 100 m3 ở sân bay Đà Nẵng tới quy mô hiện trường 3.384 m3 ở sân bay Biên Hòa. Qua các công bố mới được cập nhật, các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến 0,1% cho thấy hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện trong nhiều thập niên qua. Do đó, việc áp dụng các công cụ nghiên cứu hiện đại trở nên rất cần thiết để có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần xã VSV để từ đó cải tiến quy trình công nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và
2 nâng cao hiệu suất xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn đọng ở Việt Nam và các loại chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới. Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từ mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệ mới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống. Bởi vì kết quả thu được cung cấp thông tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệ gene chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyển hóa trong metagenome của mẫu nghiên cứu. Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng công cụ metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấp bức tranh đầy đủ nhất có thể về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật nhằm nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ áp dụng đối với ô nhiễm dioxin mà còn với các POPs khác. Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi thành phần hóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu. Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hòa bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc trung bình 21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu chôn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg. Tên luận án của nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập”. Kết quả về sự đa dạng và các đặc điểm, cấu trúc quần xã và khả năng phân hủy dioxin của một số đại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu thu được từ đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” mã số ĐTĐLCN.13/14 do PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019.
3 1) MỤC TIÊU Đánh giá đa dạng VSV trong (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và (ii) mẫu đất đã được xử lý làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học ở các lô “Chôn lấp tích cực” sau 60 tháng ở sân bay Biên Hòa, Đồng Nai, Việt Nam bằng công cụ metagenomic; Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn (VK) và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu. 2) NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa; - Tách chiết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự DNA bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500; - Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ dữ liệu metagenome của các mẫu nghiên cứu; - Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng bằng tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. 3) NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trong các quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chức năng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic cùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm; - Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành công của công nghệ phân hủy sinh học đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình công nghệ, nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao cũng như một số loại hình ô nhiễm POPs khác.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin 1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người. Dioxin là gọi tắt của nhóm các chất hữu cơ khó phân huỷ với hai vòng thơm gắn từ 1 đến 8 nguyên tử clo có quan hệ gần gũi với nhau về cấu trúc và tính chất hóa học. Khi đề cập tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là chủ yếu nhắc tới các nhóm Policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) có 75 chất và Polyclodibenzofuran (PCDF) có 135 chất, polyclobiphenyl (PCB) bởi chúng thường tồn tại dạng hỗn hợp của các chất hóa học bền vững trong môi trường (Schecter, 2013; Van den Berg và cs., 1998). Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao nhất là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3,7,8-PeCDD) với tổng độ độc tương đương TEF (Toxic Equivalency Factor) là 1 (tổ chức Y tế thế giới - WHO). Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB (Nguồn: Kulkami và cs., 2008) Các PCDD, PCDF và PCB có tính không phân cực cao, độ hòa tan trong nước rất thấp, có xu hướng tích lũy vào đất mùn, trầm tích, các vật chất kị nước như mô mỡ động vật (Schreiner và cs., 1997) và rất bền vững trong tự nhiên. Dioxin có thể di chuyển trên bề mặt đất, theo dòng nước và theo không khí gây ra ô nhiễm môi trường trong phạm vi rộng và phức tạp. Thời gian bán huỷ của dioxin là 10-100 năm tùy vị trí và điều kiện tự nhiên. Thời gian bán huỷ của dioxin trong đất là 4.720 ngày (~13 năm), hexaclobenze là 1.530 ngày (4,2 năm), PCBs là 940 ngày (2,6 năm), PAHs là 570 ngày (1,6 năm), pentaclophenol 100 ngày. Trong cặn đáy ao hồ hay còn gọi là trầm tích dioxin có thể tồn tại hàng trăm năm. Dioxin có nhiệt độ
5 nóng chảy khá cao, ngay cả ở nhiệt độ 1.200oC quá trình phân huỷ dioxin vẫn là quá trình thuận nghịch, dioxin chỉ bị phân huỷ hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn 1.200- 1.400oC. Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T (Nguồn: Schmalenberger và Tebbe, 2003) Hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ chứa dioxin do Mỹ phun rải nhằm phát quang các cánh rừng tại miền Trung và Nam Việt Nam làm hơn 4 triệu ha rừng đã bị phá hủy hoàn toàn, sự tồn lưu chất diệt cỏ/dioxin trong đất từ đó phân tán bởi lớp nước mặt, nước ngầm, tích tụ trong cơ thể sinh vật. Mặt khác, các sân bay đã từng được sử dụng làm điểm tập kết, súc rửa thùng đựng, máy bay sau khi phun rải nên lượng lớn chất độc còn tồn lưu làm biến đổi hệ sinh thái, giết chết rất nhiều động, thực vật cũng như phá hủy hệ VSV đất. EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người ở tất cả các liều lượng khi đã phơi nhiễm (Van den Berg và cs., 2006). Theo Angelo và cộng sự, PCBs có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh và hệ sinh sản (D’Angelo và Nunez, 2010) nên có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau. Theo thời gian ô nhiễm, hệ VSV sẽ mất dần là nguyên nhân đất bị sói mòn vì thiếu dưỡng chất. 1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam phần lớn do tồn dư bởi chiến tranh hóa học do Mỹ gây ra từ 1961 và tập trung chủ yếu ở các sân bay quân sự cũ như Biên Hòa, Đà Nẵng với các mức độ khác nhau.
6 Gần đây, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (United States Agency for International Development – USAID) cùng Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự thuộc Bộ Quốc phòng (BQP) lấy từ 76 vị trí theo phương pháp lấy mẫu đa điểm (MS) để điều tra mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa. Tổng cộng thu thập hơn 1.400 mẫu và phân tích nồng độ dioxin đối chiếu với Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam (QCVN 45:2012/BTNMT) và ngưỡng dioxin của BQP đối với từng điểm lấy mẫu cho thấy ô nhiễm nặng nhất tập trung ở khu Tây Nam sân bay (độ độc lên tới 110.000 ppt ở độ sâu 30 – 60cm). Thống kê cho thấy khoảng 315.700 – 377.700 m3 và 92.800 – 117.600 m3 trầm tích ô nhiễm dioxin (42% ở khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi chôn lấp Z1 là khu vực có lô xử lý 3.384 m3 đất ô nhiễm bằng phương pháp phân hủy sinh học được thực hiện bởi PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 15% ở khu Tây nam, 19% ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc và khoảng 5% tổng khối lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay). Diện tích ô nhiễm ước tính là khoảng 522.400 m2, trong đó có khoảng 369.600 m2 diện tích đất và 152.800 m2 diện tích trầm tích. Tình trạng ô nhiễm dioxin ở sân bay Đà Nẵng được thể hiện trong Báo cáo tổng kết của Văn phòng 33 và công ty Hatfield cho thấy khu vực đầu bắc sân bay (khu pha trộn và đóng nạp) và khu Pacer Ivy (khu vực lưu trữ ở phía nam sân bay) nồng độ TCDD cao nhất đạt tương ứng 361.000 ppt và 20.600 ppt ở độ sâu từ 0 – 10 cm với đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm 99% và 65%. Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chôn lấp tích cực với hiệu quả phân hủy dioxin từ 50-70% ở khu đầu bắc sân bay (Hà và cs., 2005). Đã tiến hành xử lý khử độc đất ô nhiễm có độ độc cao hơn 43.000 ng TEQ/kg ở 11 công thức khác nhau ở qui mô pilot (2 m3) ngay tại sân bay Đà Nẵng, sau 6 tháng xử lý 30% tổng độ độc đã bị loại bỏ tính chung cả các công thức hiếu khí và kị khí. Đây là công trình hợp tác giữa viện công nghệ sinh học với Cục bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (United States Environmental Protection Agency – EPA) năm 2009 với kinh phí
7 từ quỹ Ford (Hà và cộng sự , 2010). Lần đầu tiên ở Việt Nam và cũng là lần đầu tiên trên thế giới công nghệ phân hủy sinh học khử dioxin (độ độc chủ yếu từ đồng phân 2,3,7,8 TCDD) sản xuất từ công nghệ cũ của những năm 50 của thế kỷ trước được tiến hành ở qui mô lớn 3384 m3. Bằng sự kết hợp của thi công cơ giới, bán cơ giới (ở một số công đoạn nhỏ) do các cán bộ khoa học của 2 cơ quan Viện KH&CN Việt Nam và Bộ Quốc phòng đã cùng thực hiện công nghệ được gọi là: “Chôn lấp tích cực”. Tháng 3 và 4/2009, Viện Công nghệ Sinh học đã phối hợp với các đơn vị của Bộ Tư lệnh Hóa học xử lý 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu Z1 của sân bay Biên Hòa. Trong các hố chôn lấp tích cực sự phân hủy sinh học xảy ra ở 3 điều kiện hiếu khí (có oxy), kỵ khí (không có oxy) và kỵ khí không bắt buộc (có ít oxy). Quá trình xử lý bao gồm thúc đẩy sự chuyển hóa, phân hủy và giai đoạn cuối cùng tốt nhất là khoáng hóa hoàn toàn các hỗn hợp chất độc bao gồm dioxin (độc nhất) là 2,3,7,8-TCDD (chiếm từ 90 - 99,63% tổng độ độc), 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP và các PAH có nhiều vòng thơm v.v. Năm 2009 Bộ quốc phòng Việt Nam và cụ thể là Bộ Tư lệnh Hóa học đã chôn lấp hơn 90.000 m3 trong khuôn khổ dự án ở khu vực Z1 và 3.384 m3 đất thuộc dự án này đã được làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học như đã đề cập ở trên. Năm 2011, USAID và BQP Việt Nam cùng phối hợp thực hiện Dự án Xử lý Môi trường tại Sân bay Đà Nẵng sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa. Đất, bùn nhiễm dioxin được đưa vào mố kín trên mặt đất và nung nóng tới nhiệt độ tối thiểu 335ºC để tiêu hủy dioxin. Dự án đã xử lý hơn 90.000 m3 đất, trầm tích ô nhiễm trầm tích nhiễm dioxin nồng độ thấp và đã bàn giao vào cuối năm 2018. Tuy nhiên, sản phẩm sau khi sử dụng phương pháp giải hấp phụ nhiệt vẫn gây nhiều tranh cãi về hiệu quả môi trường và sản phẩm cuối cùng vẫn còn phải xử lý tiếp. 1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm Do đất bị ô nhiễm ở mức rất nặng, phức tạp và kéo dài nên việc xử lý triệt để tuân thủ công ước Stockholm là rất cần thiết. Hiện có rất nhiều phương pháp hóa học, lý học, sinh học được đề xuất để xử lý nhưng cần có những nghiên cứu kỹ trước khi áp dụng. Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ