Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

Chia sẻ: Tần Mộc Phong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:148

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) được thực hiện với mục tiêu nhằm biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả năng chịu hạn cao hơn cây không chuyển gen. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 12/2021
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Chu Hoàng Hà 2. GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 12/2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các kết quả đã trình bày trong luận án. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS.TS. Chu Hoàng Mậu, người đã trực tiếp hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, động viên tôi có được sự tự tin, khắc phục khó khăn để hoàn thành tốt bản luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Đỗ Tiến Phát, ThS Tạ Thị Đông, ThS Nguyễn Hồng Nhung và các cán bộ, nghiên cứu viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ trong bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp tôi tích lũy nhiều kiến thức, phương pháp nghiên cứu về các vấn đề hiện đại của sinh học và công nghệ sinh học, đồng thời đưa ra nhiều đóng góp quý báu để tôi có thể hoàn thành kế hoạch học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo, Bộ phân đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc tới thầy cô, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ khó khăn trong suốt chặng đường học tập, nghiên cứu của tôi thời gian qua. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng
iii MỤC LỤC Lời cam đoan .......................................................................................................... i Lời cảm ơn ............................................................................................................ ii Mục lục................................................................................................................. iii Danh mục các chữ viết tắt ..................................................................................... vi Danh mục hình ..................................................................................................... ix Danh mục bảng ..................................................................................................... xi MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 6 1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN VÀ CƠ CHẾ CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT ........................ 6 1.1.1. Ảnh hưởng của stress hạn đến sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính sinh lý, sinh hoá của thực vật ................................................................................................................. 6 1.1.2. Phản ứng của thực vật trong điều kiện stress hạn ....................................................... 11 1.2. GLYCINE BETAINE, CHOLINE OXIDASE ...................................................... 18 1.2.1. Glycine betaine.............................................................................................................. 18 1.2.2. Choline oxidase ............................................................................................................. 23 1.3. NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN ............................................................................................................. 29 1.3.1. Cây đậu tương ............................................................................................................... 29 1.3.2. Chuyển gen ở đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............. 31 1.3.3. Nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen ....................... 33 1.3.4. Tình hình nghiên cứu chuyển gen codA ở thực vật .................................................... 38 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................46 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................... 46 2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................................................ 46 2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector ........................................................................ 46 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR .................................................................... 46 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ ......................................................................................... 48 2.2.1. Hoá chất ......................................................................................................................... 48
iv 2.2.2. Thiết bị ........................................................................................................................... 48 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 49 2.3.1. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA và chuyển gen ở thuốc lá ..... 49 2.3.2. Nhóm phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 ...................................................................................................................... 53 2.3.3. Nhóm phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen codA ......................................... 55 2.3.4. Phân tích và xử lý dữ liệu ............................................................................................. 60 2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ........................................................ 61 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................62 3.1. THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA ....... 62 3.1.1. Tạo cấu trúc chuyển gen codA ..................................................................................... 62 3.1.2. Đánh giá hoạt động của vector mang gen chuyển codA trên cây thuốc lá ................ 66 3.1.3. Thảo luận kết quả thiết kế vector và hoạt động của vector biểu hiện trên cây thuốc lá .......................................................................................................................... 69 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN CODA Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 ......................................................................... 72 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng tạo chồi đậu tương ............................... 73 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương .......................................................................................... 74 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương ..................................................................................................... 78 3.2.4. Thảo luận kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen codA ở giống đậu tương ĐT22 ........................................................................... 79 3.3. BIẾN NẠP GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN ................................................................ 82 3.3.1. Kết quả chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22 .............................................. 82 3.3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen ........................................................................... 84 3.3.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen ............................................................................................................................................ 90
v 3.3.4. Thảo luận kết quả biến nạp gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và thử nghiệm khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen ................................................. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................101 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...................102 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................103
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid APX Ascorbate peroxidase BADH Betaine aldehyde dehydrogenase BAP 6-benzyladenine purin bar Bialaphos resistance bp Base pair Cặp base CAM Crassulacean acid metabolism CAT Catalase CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy CHDH Choline dehydrogenase CMO Choline monooxygenase COD Choline oxidase codA Choline oxidase from Agrobacterium globiformis CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DHAR Dehydroascorbate reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DW Dry weight Khối lượng khô ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAD Flavin adenine dinucleotide FW Fresh weight Khối lượng tươi GA3 Gibberellic acid GB Glycine Betaine GM Germination medium Môi trường nảy mầm HSP Heat shock protein
vii IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid kb Kilo base kDa Kilo Dalton Môi trường dinh dưỡng cơ LB Luria Bertani bản nuôi cấy vi khuẩn LEA Late embryogenesis abundant MAPK Microtubule associated protein kinase MDA Malondialdehyde MDHAR Monodehydroascorbate reductase MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Môi trường dinh dưỡng MS Murashige and Skoog cơ bản MS mRNA Messenger ribonucleic acid NAA α-Naphthaleneacetic acid OD Optical density Mật độ quang pat Phosphinothricin acetyltransferase PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PEAMT phosphoethanolamine N-methyltransferase PEG Polyethylene glycol PEPC Phosphoenolpyruvate carboxylase PHBH p-hydroxybenzoate hydroxylase POD Peroxidase PPT Phosphinothricin rd29A Response-to-Dehydration 29A RM Rooting medium Môi trường ra rễ ROS Reactive oxygen species SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi
viii SIM Shoot induction medium Môi trường tạo chồi SOD Superoxide dismutase Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase Vùng DNA plasmid T-DNA Transfer DNA chuyển vào thực vật Ti- plasmid Tumor inducing - plasmid T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen KLK Khối lượng khô UV Ultraviolet Tia cực tím WT Wild type Cây không biến nạp 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- X-gal galacto-pyranoside YEP Yeast extract peptone Cao chiết nấm men
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử (b) của GB.........................19 Hình 1.2. Các con đường sinh tổng hợp GB ..........................................................20 Hình 1.3. Quá trình oxy hóa choline thành GB xúc tác bởi choline oxidase...........24 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của choline oxidase độ phân giải 1,86 Å................24 Hình 1.5. Vị trí hoạt động của choline oxidase kiểu dại với sản phẩm hoạt động ...25 liên kết với GB [150] ............................................................................................25 Hình 1.6. Lối vào vị trí hoạt động của choline oxidase [137].................................26 Hình 2.1. Trình tự gen codA được tổng hợp bởi Epoch Life Science Inc. ..............47 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ....................................................................49 Hình 2.3. Sơ đồ các vector pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S- codA .....................................................................................................................51 Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pIBTII và pCAMBIA bằng enzyme HindIII và EcoRI ..................................................................................................62 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn E. coli chứa các vector thiết kế ..................................................................................................................64 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pIBTII mang các cấu trúc gen thiết kế ...........................................................................................................64 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn A. tumefaciens C58 mang các cấu trúc gen thiết kế ........................................................................................65 Hình 3.5. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá chuyển gen .67 Hình 3.6. Chồi thuốc lá chuyển gen chọn lọc trên môi trường bổ sung PPT 1,5 mg/l .67 Hình 3.7. Kết quả gây hạn sinh lý bằng PEG 8000 2,5% các dòng thuốc lá chuyển gen............................................................................................................68 Hình 3.8. Kết quả định lượng hàm lượng GB trong các dòng thuốc lá chuyển gen 69 Hình 3.9. Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc SIM2 với nồng độ PPT khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy ............................................................................74
x Hình 3.10. Các mảnh lá mầm sau các thời gian đồng nuôi cấy khác nhau..............77 Hình 3.11. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen ...83 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 bằng PPT ..............................84 Hình 3.13. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng PPT ..............................84 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR ......................................................86 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR ......................................................86 Hình 3.16. Kết quả phân tích Southern blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 .....................................................................................................................88 Hình 3.17. Kết quả phân tích Western blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 .....................................................................................................................89 Hình 3.18. Khả năng nảy mầm của đậu tương sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường hạn nhân tạo ..............................................................................................90 Hình 3.19. Chiều dài thân mầm của các dòng hạt đậu tương trên môi trường hạn nhân tạo ................................................................................................................91 Hình 3.20. Kiểu hình của các dòng đậu tương vào ngày thí nghiệm thứ 9 trong điều kiện hạn nhân tạo ..........................................................................................93 Hình 3.21. Sinh khối thu được vào ngày thứ 9 của các dòng đậu tương trong thí nghiệm chịu hạn nhân tạo .....................................................................................94 Hình 3.22. Hàm lượng GB của các dòng đậu tương chịu hạn ................................95 Hình 3.23. Hàm lượng proline của các dòng đậu tương chịu hạn...........................95 Hình 3.24. Hàm lượng MDA của các dòng đậu tương chịu hạn.............................96 Hình 3.25. Hoạt độ POD của các dòng đậu tương chịu hạn ...................................97
xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài cây trồng chuyển gen codA mã hóa choline oxidase sinh tổng hợp GB tăng khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học .................44 Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu ...............................................................47 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối với T4 ligase.................................................52 Bảng 2.3. Môi trường nuôi khuẩn .........................................................................54 Bảng 2.4. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen codA ở đậu tương ...56 Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen codA vào giống thuốc lá K326 sử dụng PPT sàng lọc.........................................................................................................................66 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng tạo chồi..............................74 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi.............75 Bảng 3.4. Ảnh hưởng cuả thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi ..........................................................................................................77 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến khả năng diệt khuẩn và tạo chồi của các mảnh lá mầm sau chuyển gen .......................................78 Bảng 3.6. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương .........82 Bảng 3.7. Kết quả biến nạp các cấu trúc chuyển gen codA ....................................85 Bảng 3.8. Các dòng đậu tương thế hệ T1 có biểu hiện gen codA và có khả năng chống chịu hạn......................................................................................................87
` 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu đang diễn ra trên quy mô toàn cầu dẫn tới tình trạng hạn hán, đặc biệt là hạn mặn ngày càng kéo dài, gây khó khăn lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp. Bên cạnh đó, biến đổi khí hậu cũng khiến diện tích đất sản suất nông nghiệp bị thu hẹp, gia tăng sự suy thoái đất, xói mòn rửa trôi, thường xuyên khan hiếm về nguồn nước. Stress hạn đã trở thành một trở ngại lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng nông nghiệp toàn cầu. Cường độ và mức độ nghiêm trọng của hạn hán được dự đoán sẽ còn gia tăng trong thời gian tới [109]. Vì vậy, việc chọn tạo giống các cây trồng có khả năng chịu hạn nhằm ứng phó với những tác động của biến đổi khí hậu là vấn đề mang tính cấp thiết và thời sự. Đậu tương là một trong những cây nông nghiệp quan trọng trên thế giới, là nguồn cung cấp protein bổ dưỡng với chi phí thấp, được sử dụng làm thức ăn cho con người và gia súc với các sản phẩm đa dạng từ sử dụng trực tiếp hạt thô đến chế biến thành phẩm… Ngoài ra, đậu tương còn giữ vai trò cải tạo đất nông nghiệp do khả năng cố định nitơ trong khí quyển. Tại Việt Nam, cây đậu tương giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng, tuy nhiên, năng suất đậu tương ở Việt Nam còn thấp, diện tích trồng trọt chưa được mở rộng nhiều. Nguyên nhân chính là chưa có giống đậu tương phù hợp, quy mô sản xuất nhỏ lẻ và điều kiện thời tiết không thuận lợi. Cây đậu tương tuy có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Đậu tương dễ bị tổn thương bởi các stress phi sinh học và hạn là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lượng đậu tương. Những ảnh hưởng nổi bật nhất của hạn là giảm khả năng nảy mầm, cây sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, giảm quang hợp, giảm khả năng hút khoáng. Trong bối cảnh hiện nay, vấn đề nâng cao khả năng chịu hạn ở cây đậu tương để giảm thiểu thiệt hại
` 2 năng suất trong điều kiện môi trường thiếu nước là nhiệm vụ cấp bách của các nhà chọn giống cây trồng nông nghiệp. Trên thế giới, việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã được quan tâm nghiên cứu với nhiều hướng tiếp cận khác nhau, như sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại. Trong đó, những hiểu biết và tiến bộ của các kỹ thuật chuyển gen hiện nay đã mở ra triển vọng lớn trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây đậu tương. Đối với thực vật, đặc tính chịu hạn là tính trạng số lượng phức tạp, chịu ảnh hưởng của một hệ thống các gen mục tiêu cũng như sự chi phối của các yếu tố môi trường, vật lý và hoá học. Sản phẩm của các gen này tác động trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc điều hòa chức năng nhóm gen chịu hạn, như kiểm soát sự đóng mở khí khổng, giảm nồng độ ROS (reactive oxygen species), tăng cường phát triển bộ rễ, điều chỉnh thẩm thấu, bảo vệ tính toàn vẹn của màng, ổn định cấu trúc enzyme hoặc protein… [68]. Khi gặp điều kiện khô hạn, thực vật thường có xu hướng tăng cường tổng hợp, tích luỹ các chất chuyển hoá như các loại đường tan, amino acid… để điều chỉnh áp suất thẩm thấu cho tế bào. Vì vậy, một trong các hướng nghiên cứu tiếp cận cơ chế chống chịu hạn hiện nay chính là làm gia tăng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nước. Trong đó, glycine betaine (GB) là một trong những chất bảo vệ thẩm thấu được nghiên cứu rộng rãi nhất. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, GB là chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi. Nhiều loại gen đã được sử dụng để tạo ra cây chuyển gen có sự tăng tích lũy GB đã cho thấy sự hiệu quả trong việc tăng cường khả năng chịu đựng các stress phi sinh học và tăng năng suất. Một số cây trồng chuyển gen mã hoá enzyme liên quan đến sinh tổng hợp GB cũng thể hiện khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như chịu nóng [175]; chịu lạnh [134]; chịu hạn [171] và chịu mặn [160].
` 3 Trong số các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau, con đường sinh tổng hợp GB từ tiền chất choline xúc tác bởi enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA là có hiệu quả và đơn giản nhất. Gen codA đã trở thành mục tiêu nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học đối với kỹ thuật trao đổi chất của các loài thực vật quan trọng về mặt kinh tế để chống chịu stress thẩm thấu [133]. Phương pháp chuyển gen codA từ Arthrobacter globiformis vào các loại cây trồng không tích lũy GB tự nhiên như đậu xanh [21]; khoai tây [38]; cà chua [164]… để nâng cao khả năng chống chịu trong các điều kiện stress phi sinh học khác nhau đã chứng minh sự đơn giản và hiệu quả của phương pháp này. Tại Việt Nam, gen codA mã hoá sinh tổng hợp GB đã được chuyển thành công vào cây xoan [5], [9] và cây thuốc lá [78]; các cây chuyển gen này có khả năng chịu hạn, chịu mặn hơn so với các cây đối chứng không chuyển gen. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen codA liên quan đến sinh tổng hợp GB nhằm nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương giúp cây phát triển tốt hơn, cho năng suất và sản lượng cao hơn trong điều kiện môi trường bất lợi là nghiên cứu mang tính thực tiễn và cần thiết. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả năng chịu hạn cao hơn cây không chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu tạo cấu trúc chuyển gen mang gen codA trong vector biểu hiện thực vật
` 4 1) Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA. 2) Biến nạp cấu trúc chuyển gen mang gen codA vào mô cây thuốc lá. Đánh giá hoạt động và biểu hiện gen chuyển codA trên các dòng thuốc lá chuyển gen. 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhằm thăm dò hiệu quả chuyển gen codA ở cây đậu tương 1) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phosphinothricin (PPT) đến khả năng tạo chồi từ lá mầm đậu tương. 2) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương. 3) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương. 3.3. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn 1) Biến nạp di truyền và tạo cây đậu tương chuyển gen codA. 2) Phân tích cây đậu tương chuyển gen codA. 3) Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen codA. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam tạo thành công cây đậu tương mang gen codA tăng khả năng chịu hạn so với cây đậu tương không biến nạp. Luận án là công trình có hệ thống với nội dung được trình bày từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu hiện gen và tạo dòng cây chuyển gen codA có hàm lượng GB tích luỹ cao. Cụ thể là: 1) Đã xác định được các yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA và tạo đa chồi ở giống đậu tương ĐT22. Nồng độ PPT 3 mg/l ở giai đoạn cảm ứng tạo chồi trong môi trường SIM và nồng độ PPT 1,5 mg/l ở giai đoạn kéo dài chồi trong môi trường SEM; dịch khuẩn có giá trị OD650= 0,6, thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng
` 5 nuôi cấy 5 ngày trong tối và diệt khuẩn bằng cefotaxime 500 mg/l là thích hợp cho cảm ứng tạo chồi và kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc. 2) Lần đầu tiên gen codA được chuyển thành công và biểu hiện ở cây đậu tương Việt Nam. Sự biểu hiện của gen chuyển codA trong cây đậu tương chuyển gen đã làm tăng hàm lượng GB, proline, tăng hoạt độ của POD, giảm hàm lượng MDA so với cây cây đậu tương không chuyển gen. 3) Bốn dòng đậu tương chuyển gen codA ở thế hệ T1 đã được đánh giá, hàm lượng GB ở dòng đậu tương chuyển gen tăng từ 248,9% - 288,3% so với cây không chuyển gen; hàm lượng proline tăng 1,5 - 2 lần, hoạt động của POD tăng lên gấp 4 lần và hàm lượng MDA giảm 0,5 lần so với cây không chuyển gen. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả nghiên cứu đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu các stress phi sinh học của cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. Về mặt khoa học, kết quả của luận án đã chứng minh được sự tăng cường biểu hiện gen codA mã hóa enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp GB đã làm tăng khả năng chống chịu hạn ở cây đậu tương. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để cải thiện khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở thực vật nói chung và cây họ đậu nói riêng bằng kỹ thuật biểu hiện gen. Kết quả đăng tải trên các bài báo khoa học là tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ nghiên cứu và giảng dạy sinh học. Về mặt thực tiễn, các dòng đậu tương chuyển gen codA có thể được sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, đáp ứng một phần nhu cầu đậu tương đang thiếu trong nước hiện nay. Kết quả nghiên cứu của luận án có thể áp dụng vào các giống cây họ đậu và các loài thực vật khác trong định hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng GB giúp tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
` 6 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN VÀ CƠ CHẾ CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 1.1.1. Ảnh hưởng của stress hạn đến sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính sinh lý, sinh hoá của thực vật 1.1.1.1. Tác động của hạn đến sự sinh trưởng và phát triển Stress hạn được hiểu và định nghĩa dưới nhiều góc độ khác nhau. Trong nông nghiệp, stress hạn là hiện tượng xảy ra khi môi trường không đủ nước cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây trồng tại một thời điểm nhất định. Mức độ nghiêm trọng của stress hạn phụ thuộc vào thời gian và cường độ hạn, lượng mưa, khả năng giữ nước của đất, sự thoát hơi nước của lá và sức sống của thực vật [136]. Thực vật chịu áp lực của stress hạn khi độ ẩm trong đất thấp, lượng nước có sẵn cho rễ giảm hoặc/và khi tốc độ thoát hơi nước của lá cao hơn so với mức độ hấp thu nước của rễ. Các triệu chứng hạn ở thực vật khác nhau giữa các loài thực vật, tùy thuộc vào khả năng chống chịu, điều kiện sinh trưởng, giai đoạn phát triển và các yếu tố của môi trường. Các triệu chứng này bao gồm cả những thay đổi về mặt hình thái như héo rũ, rụng lá, già hoá sớm cũng như sự thay đổi ở cấp độ tế bào: giảm sức trương, đóng khí khổng, mất cân bằng áp suất thẩm thấu và tăng sản xuất ROS. Một số thực vật có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn. Khả năng chịu hạn là một đặc điểm phức tạp xảy ra thông qua một số cơ chế: (i) trốn hạn (tăng tốc giai đoạn sinh sản của cây trước khi bị stress có thể cản trở sự tồn tại của nó), (ii) tránh hạn (chịu đựng với lượng nước bên trong tăng lên và ngăn ngừa tổn thương mô) và (iii) chịu hạn (khả năng chịu đựng với hàm lượng nước bên trong thấp trong khi vẫn duy trì sự phát triển trong thời gian khô hạn) [24]. Sau một thời gian khô hạn, tỷ lệ cây sống sót khi được tưới lại được gọi là tỷ lệ sống sót trong hạn hán. Stress hạn là một yếu tố ảnh hưởng đến hình thái, sinh lý và sự phát triển của
` 7 cây từ giai đoạn hạt nảy mầm, phát triển chồi và rễ, thân và lá cho đến giai đoạn sinh sản [109]. Giai đoạn hạt nảy mầm là giai đoạn rất nhạy cảm với stress hạn. Trong điều kiện hạn hán, quá trình nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây non có nhiều thay đổi đáng chú ý, như giảm số lượng và tỷ lệ nảy mầm của hạt; giảm chiều dài, khối lượng chất khô của rễ và chồi; giảm khả năng sống sót của cây con, kéo dài thời gian nảy mầm của hạt [128]. Độ ẩm đóng vai trò thiết yếu trong việc kích hoạt enzyme trong quá trình nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm bị giảm đáng kể ở cây đậu gà (Cicer arietinum L.) trong điều kiện thiếu nước [20]. Trong giai đoạn sinh trưởng của cây, ảnh hưởng sớm nhất khi gặp stress hạn là héo lá, giảm chiều cao cây, gián đoạn quá trình hình thành chồi và hoa. Chiều cao thực vật có liên quan chặt chẽ đến kích thước tế bào và sự già hoá của lá. Chiều cao cây giảm chủ yếu là do giảm khả năng hút, vận chuyển khoáng trong cây, giảm khả năng phân chia và kích thước tế bào, tăng rụng lá trong điều kiện khô hạn [169]. Nước có ảnh hưởng nhất định đến sự phân bố của rễ cây. Khi thiếu nước, thực vật có xu hướng tăng cường hút nước từ các tầng đất sâu hơn bằng cách phát triển cấu trúc bộ rễ thông qua sự tăng trưởng của chiều dài rễ cái và sự tăng số lượng, lan rộng của các rễ bên [135]. Ở đậu tương, sự ức chế sinh trưởng ở chồi mạnh hơn, sinh khối của chồi giảm nhiều hơn so với rễ, dẫn đến tỷ lệ rễ/ chồi cao hơn trong điều kiện thiếu nước [49]. Để chống lại hạn hán, đậu tương có xu hướng phát triển hệ thống rễ bên lớn hơn, số lượng lông rễ nhiều hơn và đường kính xylem to hơn. Sự thiếu hụt đạm sẽ có thể xảy ra khi stress hạn làm giảm số lượng và khối lượng khô của nốt sần cây đậu tương. Khi đậu tương bị thiếu đạm, rễ ít phân nhánh, cây thấp còi, ít quả và hạt hơn cây khỏe mạnh, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất [92]. Lá là bộ phận chính của cây, diện tích bề mặt lá có ảnh hưởng lớn đến quá trình quang hợp và sự phát triển của cây. Trong điều kiện khô hạn, hiện tượng giảm kích thước và số lượng lá, lá già hoá sớm đã được quan sát thấy ở nhiều loài thực vật [26]. Sự biến đổi hình thái, kích thước lá có vai trò quan trọng trong khả năng