Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hiện tượng Methyl hóa vùng Promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:127

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Nghiên cứu hiện tượng Methyl hóa vùng Promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt" nghiên cứu nhằm tối ưu hóa thành phần, điều kiện kỹ thuật và đánh giá độ nhạy MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt; xác định mối liên quan giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thư và quá sản lành tính tuyến tiền liệt; phát triển kỹ thuật lai điểm tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hiện tượng Methyl hóa vùng Promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG QUÁ SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG QUÁ SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu, cộng tác với các cộng sự khác, là sản phẩm của đề tài KC.04.05/11-15; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng nhƣ các hội nghị trong nƣớc và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại trong luận án chƣa đƣợc tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà nội, ngày tháng 4 năm 2018 Nghiên cứu sinh Vƣơng Diệu Linh
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Võ Thị Thương Lan, Khoa Sinh học, Đai học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Cô không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận án, là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ đã cấp kinh phí cho đề tài KC.04.05/11-15 hỗ trợ cho nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và các đồng nghiệp Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua. Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh Vương Diệu Linh
MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................................ 4 DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... 8 DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... 12 MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 13 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 16 1.1. Ung thƣ .......................................................................................................... 16 1.1.1. Thực trạng ung thƣ .......................................................................................16 1.1.2. Cơ sở tế bào học ung thƣ ..............................................................................17 1.1.3. Di truyền học ung thƣ ...................................................................................19 1.2. Di truyền ngoại gen và ung thƣ ....................................................................... 22 1.2.1. Di truyền ngoại gen ......................................................................................22 1.2.2. Biến đổi histone trong ung thƣ ......................................................................23 1.2.3. Methyl hóa DNA ..........................................................................................24 1.2.4. Methyl hóa DNA bất thƣờng trong ung thƣ...................................................25 1.3. Ung thƣ tuyến tiền liệt .................................................................................... 26 1.3.1. Phân độ trong ung thƣ tuyến tiền liệt.............................................................26 1.3.2. Methyl hóa DNA trong ung thƣ tuyến tiền liệt ..............................................28 1.3.3. Cấu trúc và chức năng gen GSTP1 ................................................................30 1.4. Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA ........................................................ 31 1.4.1. Phƣơng pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) ................32 1.4.2. Phƣơng pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction) .....................................................................................33 1.4.3. Phƣơng pháp định lƣợng qMS-PCR .............................................................34 1.5. Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng bệnh ung thƣ ...................... 36 1.5.1. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ .................................................... 366 1.5.2. Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ tuyến tiền liệt ................................38 1.5.3. Triển vọng của các bộ kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA ....................39 1.6. Nghiên cứu methyl hóa DNA trong ung thƣ ở Việt Nam ................................ 41 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 43 1
2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 43 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................43 2.1.2. Các vật liệu ...................................................................................................43 2.1.3. Hóa chất .......................................................................................................44 2.2. Thiết bị chính ................................................................................................. 46 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 47 2.3.1. Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA ..................................................................47 2.3.2. Nuôi cấy dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 .........................................47 2.3.3. Tách chiết DNA tổng số...............................................................................48 2.3.4. Xử lý DNA tổng số với bisulfite ...................................................................48 2.3.5. Tách dòng .....................................................................................................49 2.3.6. Phƣơng pháp PCR ........................................................................................52 2.3.7. Phƣơng pháp lai điểm ...................................................................................56 2.3.8. Phƣơng pháp điện di .....................................................................................57 2.3.9. Xác định nồng độ DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ................58 2.3.10. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................................58 2.3.11. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR ............................................58 2.3.12. Xác định số bản copy .................................................................................59 2.3.13. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học .........................................................59 2.4. Sơ đồ thí nghiệm............................................................................................. 60 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 61 3.1. Thu thập và phân loại mẫu .............................................................................. 61 3.2. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 63 3.2.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu và dòng tế bào nuôi cấy PC3 ...........................63 3.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin ..........................................63 3.3. Xử lý DNA tổng số với bisulfite ..................................................................... 66 3.3.1. Xây dựng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng DNA sau xử lý bisulfite ...........66 3.3.2. Xử lý DNA tổng số của các mẫu bệnh phẩm với bisulfite .............................68 3.4. Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ...... 69 3.5. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa .................... 73 3.5.1. Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn ..............73 2
3.5.2. Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu bằng giải trình tự ...............................74 3.6. Xác định methyl hóa promoter gen GSTP1 ở các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính .................................................................................. 77 3.7. Xác định ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 của phản ứng MS- PCR ....................................................................................................................... 80 3.8. Phân tích tình trạng methyl hóa của promoter gen GSTP1 và các đặc điểm lâm sàng ....................................................................................................................... 82 3.9. Xây dựng qui trình lai điểm (dot blot) để tăng độ nhạy và độ chính xác phát hiện sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa từ phản ứng MS-PCR................................... 85 3.9.1 Đánh dấu đầu dò với biotin ............................................................................87 3.9.2. Tối ƣu điều kiện lai điểm ..............................................................................88 3.9.3. Xác định tính đặc hiệu của kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa và không methyl hóa ............................................................................89 3.9.4. Xác định ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật lai điểm ..........................................91 3.9.5. Xác định sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ các mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt và mẫu quá sản lành tính ..................................................................92 KẾT LUẬN ........................................................................................................... 97 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 98 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................................................................................... 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 100 Tiếng Việt ........................................................................................................... 100 Tiếng Anh ........................................................................................................... 100 Trang Web .......................................................................................................... 114 3
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm A280 Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ) AMACR Alpha-Methylacyl CoA Racemase AP-1 Activator Protein - 1 APC Adenomatous polyposis of the colon gene Apoptosis Chết theo chƣơng trình AUC Area under the ROC curve bp Base pair BHV-4 Bovine Herpesvirus - 4 BRCA1/2 Breast cancer susceptibility gene BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) BstUI Enzym giới hạn BstUI C-onc Cellular oncogenes CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A gene (p16(INK4a)) COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis CRBP1 Cellular retinol-binding protein-1 CRISP-3 Cysteine-rich secretory protein 3 cs. Cộng sự Da Dalton DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase dNTP Deoxynucleotide triphosphate DRE Digital Rectal Exam (Thăm khám qua trực tràng) dTTP Deoxythymidine triphosphate 4
dUTP Deoxyuridine triphosphate EcoRI Enzym giới hạn EcoRI EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) FFPE Formalin fixed paraffin embedded GIST Gastrointestinal Stromal Tumor (U mô đệm dạ dày - ruột) GSH Glutathione GSPT1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene GSTs Glutathione S-transferase GTP Guanosine Triphosphate H&E Haematoxylin & Eosin HATs Histone acetyltransferase HDACs Histone deacetylase HDMs Histone demethylase HIC1 Hypermethylated in cancer 1 gene HMTs Histone methyltransferase hTERT Humans Telomerase Reverse Transcriptase Gene International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên IARC cứu ung thƣ thế giới) JMJD3 Jumonji domain-containing protein 3 gene JNK c-Jun N-terminal kinase kb Kilobase = 1000 bp v-kit Hardy-Zuckerman 4 filine sarcoma viral oncogene KIT homolog LB Luria-Bertani (môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn) LSD1 Lysine specific demethylase 1A MDR Multidrug resistance gene MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog 1 gene MS-DBA Methyl specific dot blot assay (Lai điểm đặc hiệu methyl) 5
MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) PBS Phosphate Buffer Saline PC3 Prostate cancer cell lines (Dòng tế bào nuôi cấy) PCA3 prostate cancer antigen 3 gene Platelet – Derived Growth Factor (yếu tố tăng trƣởng có nguồn PDGF gốc tiểu cầu) PDGFRA Platelet-derived growth factor alpha gene PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) PSA Prostate Specific Antigen (Kháng thể đặc hiệu tuyến tiền liệt) PSMA Prostate-speciﬁc membrane antigen RASSF1A Ras association domain family 1A gene Rb1 Retinoblastoma 1 gene ROC Receiver Operating Characteristic RTK Receptor Tyrosine Kinase SA-AP Streptavidin - Alkaline Phosphatase SAT2, D424, Trình tự DNA lặp lại NBL2 SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEPT9 Septin 9 gene SHOX2 Short stature homeobox 2 gene SP1 Specificity Protein 1 SSC Saline Sodium Citrate SYBR Syber Green (thuốc nhuộm DNA) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene UTX ubiquitously-transcribed TPR gene on the X chromosome UV Tia tử ngoại VHL Von Hippel-Lindau gene 6
V-onc Viral Oncogenes WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới) 7
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sáu đặc trƣng cơ bản của ung thƣ 18 Hình 1.2 Các dạng điển hình theo phân độ Gleason 27 Hình 1.3 Cấu trúc gen GSTP1 30 Hình 1.4 Nguyên tắc của phƣơng pháp COBRA 32 Hình 1.5 Phƣơng pháp MS-PCR khuếch đại DNA sau xử lý bisulfite 34 với các cặp mồi đặc hiệu cho DNA methyl hóa và DNA không methyl hóa Hình 1.6 Phƣơng pháp MethyLight sử dụng đầu dò Taqman và các 35 mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa hoặc DNA không methyl hóa hoặc DNA không chứa cytosine trong trình tự Hình 1.7 Kỹ thuật HeavyLight sử dụng các chuỗi oligonucleotide 36 blocker (đoạn màu đen) liên kết với DNA không bị methyl hóa, ngăn cản các mồi gắn vào khuôn, dẫn tới không khuếch đại DNA không methyl hóa. Ngƣợc lại, chuỗi này không bám đƣợc vào DNA bị methyl hóa nên các mồi và đầu dò Taqman khuếch đại đƣợc DNA bị methyl hóa Hình 1.8 Dấu chuẩn sinh học cho phép xác định những thay đổi ở 37 cấp độ nhiễm sắc thể, thay đổi trình tự nucleotide, biến đổi di truyền ngoại gen, biểu hiện RNA và sản phẩm protein Hình 2.1 Đầu dò GSTP đƣợc thiết kế dựa trên trình tự GSTP1 bị 44 methyl hóa đã tách dòng trong plasmid tái tổ hợp pG-Me Hình 2.2 (A) Các bƣớc xử lý bisulfite. (B) Kết quả minh họa DNA 49 bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa sau khi xử lý với bisulfite: MeC – Cytosine bị methyl hóa đƣợc giữ nguyên là C; C không bị methyl hóa biến đổi thành U Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 60 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 nuôi cấy trong 61 8
môi trƣờng thích hợp đƣợc sử dụng để tách chiết DNA Hình 3.2 Phân độ mô học các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt theo 62 phân độ Gleason Hình 3.3 Kết quả điện di DNA tổng số tách từ máu (M) và từ dòng 63 tế bào PC3 (PC3) trên gel agarose 1 %. Hình 3.4 Kết quả điện di minh họa DNA tổng số tách từ mẫu đúc 64 nến ung thƣ tuyến tiền liệt (P1-P4) và từ mẫu quá sản lành tính (B1-B4) trên gel agarose 1 %. Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin 66 trên gel agarose 1,5 % Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin với 68 cặp mồi đặc hiệu cho DNA không xử lý bisulfite (A) và cho DNA sau xử lý (B) trên gel acrylamide 8 % Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR minh họa DNA đƣợc xử lý 69 bisulfite hoàn toàn Hình 3.8 Vị trí các mồi đặc hiệu cho phản ứng nested MS-PCR phát 71 hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 do đề tài thiết kế. GS Me-F1, GS Me-F2, GS Me-R: các mồi phát hiện GSTP1 bị methyl hóa (chữ màu xanh dƣơng). GS Un-F1, GS Un-F2, GS Un-R: các mồi phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa (chữ bôi màu ghi). Cặp mồi khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa (gạch chân màu xanh dƣơng) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (gạch chân màu xanh lá cây) theo công bố của Nakayama và cs. Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm nested MS-PCR phát hiện 71 GSTP1 bị methyl hóa (A) và GSTP1 không bị methyl hóa (B) trên gel acrylamide 8 % Hình 3.10 Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi MS-PCR 72 phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa (149 bp) (A) và GSTP1 bị methyl hóa (155 bp) (B) 9
Hình 3.11 (A) Sơ đồ vị trí nhận biết của BstUI trên trình tự GSTP1 bị 74 methyl hóa có kích thƣớc 155 bp đƣợc khuếch đại trong phản ứng MS-PCR. (B) Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR cắt với enzym BstUI trên gel acrylamide 10 % Hình 3.12 Kết quả kiểm tra sự có mặt của trình tự GSTP1 không xử lý 75 bisulfite (A), của GSTP1 bị methyl hóa (B) và GSTP1 không bị methyl hóa (C) trong các plasmid tái tổ hợp Hình 3.13 (A) Kết quả so sánh trình tự promoter gen GSTP1 với ngân 76 hàng dữ liệu. (B) Kết quả giải trình tự trình tự GSTP1 không xử lý bisulfite, GSTP1 bị methyl hóa và không bị methyl hóa Hình 3.14 Kết quả minh họa sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa 78 promoter gen GSTP1 trên mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt Hình 3.15 Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp pG-Me (A) và DNA 81 tổng số tách từ máu (B) trên gel agarose 1 % Hình 3.16 (A) Kết quả PCR xác định ngƣỡng phát hiện GSTP1 từ 82 plasmid pG-Me dạng thẳng có nồng độ pha loãng theo bậc 10, mỗi bậc pha loãng đƣợc lặp lại 2 lần. (B). Kết quả PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ 10 copy (G) hoặc từ hỗn hợp 15 ng DNA tổng số mẫu máu trộn với 10 copy plasmid (H), hoặc từ hỗn hợp 15 ng DNA máu đã xử lý bisulfite trộn với 10 copy plasmid (HX). Mẫu M15: 15 ng DNA tổng số tách từ máu. Mẫu MX15: 15 ng DNA máu xử lý bisulfite Hình 3.17 Đƣờng cong ROC thể hiện mối liên quan giữa methyl hóa 85 promoter gen GSTP1 với loại mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt/quá sản lành tính (A), với phân độ Gleason (B) và với độ tuổi bệnh nhân (C) Hình 3.18 Đầu dò GSTP đƣợc thiết kế dựa trên trình tự GSTP1 bị 87 methyl hóa đã tách dòng trong plasmid tái tổ hợp pG-Me 10
Hình 3.19 Kết quả đánh dấu đầu dò GSTP với biotin 88 Hình 3.20 Kết quả tối ƣu điều kiện khóa màng 88 Hình 3.21 Kết quả tối ƣu nhiệt độ lai 89 Hình 3.22 Kết quả lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa 90 155 bp (Ct-MeG) với GSTP1 không methyl hóa 149 bp (Ct-UnG) hoặc phân biệt sản phẩm MS-PCR bị methyl hóa (Me) với sản phẩm không bị methyl hóa (Un) khuếch đại từ DNA của PC3 đã xử lý Hình 3.23 Ngƣỡng phát hiện trình tự GSTP1 bị methyl hóa trong kỹ 92 thuật lai điểm Hình 3.24 Kết quả lai điểm phát hiện các sản phẩm MS-PCR có 93 GSTP1 bị methyl hóa từ 39 mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt Hình 3.25 (A) Kết quả lai điểm phát hiện các sản phẩm MS-PCR có 93 GSTP1 bị methyl hóa từ 4 mẫu quá sản lành tính B1-B4. (B) Sản phẩm PCR khuếch đại trình tự 155 bp từ các mẫu quá sản lành tính B1-B4 có GSTP1 bị methyl hóa Hình 3.26 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm MS-PCR 155 bp từ 94 các mẫu quá sản lành tính B1-B4 và mẫu ung thƣ P4 có GSTP1 bị methyl hóa 11
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số gen bị methyl hóa quá mức trong ung thƣ ở ngƣời 26 Bảng 2.1 Các bộ kit tách chiết, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 44 Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu 46 Bảng 2.3 Các trình tự promoter gen GSTP1 đƣợc tách dòng 49 Bảng 2.4 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR với cặp mồi β- 53 globin Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại gen β-globin 53 không bị methyl hóa Bảng 2.6 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự 54 promoter gen GSTP1 từ DNA tổng số Bảng 2.7 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự 54 promoter gen GSTP1 không bị methyl hóa Bảng 2.8 Thành phần và điều kiện phản ứng MS-PCR khuếch đại 55 promoter gen GSTP1 bị methyl hóa Bảng 2.9 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại các trình 55 tự với cặp mồi đặc hiệu của vector tách dòng Bảng 2.10 Thành phần và điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò 56 GSTP với biotin Bảng 2.11 Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm 57 Bảng 3.1 Kết quả xác định nồng độ DNA tách chiết từ dòng tế bào 63 PC3 và mẫu máu bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ Bảng 3.2 Kết quả xác định nồng độ DNA tách chiết từ mẫu bệnh 65 phẩm đúc paraffin bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ Bảng 3.3 Tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 73 Bảng 3.4 Mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng và methyl hóa 83 promoter gen GSTP1 ở các mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính 12
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách thức methyl hóa DNA và biến đổi histone. Thay đổi mức độ methyl hóa DNA là một trong những biến đổi di truyền ngoại gen tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen. Thực tế cho thấy rất nhiều bệnh ung thƣ khác nhau liên quan mật thiết đến thay đổi mức độ methyl hóa ở promoter của các gen ức chế khối u; làm bất hoạt các gen đó dẫn đến hình thành và phát triển ung thƣ. Ngoài ra, mức độ methyl hóa bất thƣờng còn là dấu hiệu tiên lƣợng bệnh tái phát hoặc di căn. Hoạt động của những gen liên quan đến tính nhạy cảm với hóa, xạ trị có thể bị thay đổi bởi sự methyl/khử methyl dẫn đến tính kháng. Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lƣợng và điều trị ung thƣ. Ung thƣ tuyến tiền liệt là loại ung thƣ phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới. Giống nhƣ ở các loại ung thƣ khác, hiện tƣợng methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong ung thƣ tuyến tiền liệt, đặc biệt ở giai đoạn sớm. Trong đó, gen đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1 (π-class glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử các độc tố gây ung thƣ. Methyl hóa GSTP1 xảy ra phổ biến (90 %) ở ung thƣ tuyến tiền liệt nhƣng rất hiếm ở các loại ung thƣ khác. Hơn nữa, methyl hóa GSTP1 tăng tỷ lệ với cấp độ ung thƣ từ nguyên phát đến di căn. Tuy nhiên tỷ lệ methyl hóa GSTP1 thay đổi phụ thuộc vào chủng tộc, vùng địa lý. Do đó methyl hóa GSTP1 đƣợc tập trung nghiên cứu với các chủng tộc ngƣời ở các quốc gia khác nhau để phát triển thành dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt. Năm 2011, công ty MDx Health (Mỹ) đã thử nghiệm bộ kit “ConfirmMDx” phát hiện sớm ung thƣ tuyến tiền liệt dựa vào methyl hóa của 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A. Năm 2013, bộ kit này đã đƣợc thƣơng mại và đƣa vào danh mục bảo hiểm y tế chi trả cho thăm khám định kỳ ở Mỹ. Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl hóa DNA nói chung và dấu chuẩn methyl hóa DNA liên quan đến ung thƣ nói riêng mới đƣợc triển khai. Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu chuẩn mới, dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán 13
sớm, tiên lƣợng đúng và điều trị đích chính xác là nhiệm vụ cấp thiết của sinh y học hiện đại. Với mong muốn nghiên cứu di truyền ngoại gen và theo kịp những tiến bộ của Y học hiện đại trong việc ứng dụng các dấu chuẩn mới phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lƣợng sống cho ngƣời dân Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hiện tƣợng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt” với mục đích: 1) Tối ƣu hóa thành phần, điều kiện kỹ thuật và đánh giá độ nhạy MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 2) Xác định mối liên quan giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thƣ và quá sản lành tính tuyến tiền liệt, 3) Phát triển kỹ thuật lai điểm tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. Nội dung nghiên cứu: - Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, - Thiết lập và xác định điều kiện tối ƣu để xử lý bisulfite cho DNA tổng số tách chiết từ dòng tế bào PC3, từ mẫu máu và các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt, - Xây dựng đối chứng chuẩn cho phản ứng MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1. DNA tách từ dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 bị methyl hóa và DNA tách từ mẫu máu ngƣời khỏe mạnh làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa, - Áp dụng các kỹ thuật MS-PCR (methylation-specific PCR), phƣơng pháp xác định trình tự gen và kỹ thuật cắt enzym giới hạn phân tích mức độ methyl hóa promoter gen GSTP1 trong các mẫu bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 14
- Xây dựng các mẫu đối chứng GSTP1 bị methyl hóa, GSTP1 không bị methyl hóa để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR, tức là xác định đƣợc nồng độ (số alen GSTP1 tối thiểu bị methyl hóa) mà kỹ thuật MS-PCR có thể phát hiện đƣợc khi áp dụng hỗ trợ chẩn đoán ung thƣ tuyến tiền liệt, - Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng, -Thiết kế đầu dò cho kỹ thuật lai điểm nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện sự methyl hóa ở promoter gen GSTP1. Những đóng góp mới của luận án: - Lần đầu tiên xây dựng và tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter gen GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt; xác định đƣợc tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính chiếm 66,1 % và 10,8 %. Ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt qua phản ứng MS-PCR là 0,15 %. - Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với ung thƣ tuyến tiền liệt, p < 0,05. - Kết hợp kỹ thuật lai điểm với kỹ thuật MS-PCR để tăng độ nhạy (ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 là 0,01 %), đảm bảo độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện methyl hóa ở promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. 15
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ung thƣ Ung thƣ đƣợc xem là căn bệnh nan y trong đó một số tế bào của một tổ chức (mô) phân chia không kiểm soát, xâm lấn sang các tổ chức lân cận và có khả năng di căn đến các tổ chức khác ở xa nơi xuất hiện khối u nguyên phát [101]. Sinh trƣởng không kiểm soát của tế bào liên quan đến các hiện tƣợng: (1) Bất hoạt các gen ức chế khối u, (2) Kích hoạt các gen tiền ung thƣ thành các gen gây ung thƣ (3) Thay đổi hoạt động của các gen có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA. Cả ba hiện tƣợng này liên quan chặt chẽ đến đột biến lớn ở cấp độ nhiễm sắc thể cũng nhƣ đột biến điểm ở một gen riêng biệt. Tuy nhiên, cả 3 hiện tƣợng đều có thể xảy ra ngay cả khi không có một đột biến nào dù chỉ một nucleotide. Đó là do những biến đổi (hay có thể xem là đột biến) ở mức độ di truyền ngoại gen mà không liên quan tới biến đổi trong trình tự DNA. Đặc biệt, những biến đổi di truyền ngoại gen thƣờng xuất hiện sớm, thúc đẩy tế bào bình thƣờng chuyển sang trạng thái ác tính, từ đó dẫn đến phát sinh khối u [93]. 1.1.1. Thực trạng ung thƣ Ung thƣ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và là nguyên nhân tử vong đứng thứ hai ở các nƣớc đang phát triển [61]. Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, ƣớc tính đến năm 2030 dân số thế giới sẽ tăng đến 8,3 tỷ ngƣời, khả năng mắc ung thƣ mới mỗi năm khoảng 27 triệu ngƣời, 17 triệu ngƣời chết vì ung thƣ [19]. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC, trong các trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong vì ung thƣ, hơn một nửa số ca có liên quan và hơn hai phần ba trƣờng hợp ung thƣ sẽ gia tăng ở những nƣớc có thu nhập thấp và trung bình. Ung thƣ chủ yếu tập trung ở các dạng ung thƣ phổi, vú, tuyến tiền liệt, buồng trứng, gan, máu, da…[19] Việt Nam là nƣớc đang phát triển gắn liền với sự thay đổi về kinh tế, mức sống đƣợc nâng cao, dẫn đến sự gia tăng của một số bệnh nhƣ tim mạch, tiểu đƣờng và ung thƣ. Năm 2007, Việt Nam có khoảng 110 000 ngƣời mắc ung thƣ mới trong đó 16