Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:149

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng" là phát triển được bộ chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài góp phần phát triển nghề nuôi tu hài nói riêng và nghề nuôi biển của Việt Nam nói chung.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9.42.01.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Xuân Viết PGS. TS Thái Thanh Bình Hà Nội - 2023
i LỜI CAM ĐOAN Tôi là Triệu Anh Tuấn, Nghiên cứu sinh (NCS) khóa 36, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội chuyên ngành Di truyền học, mã số: 9.42.01.21, xin cam đoan Luận án là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các nội dung, kết quả nghiên cứu phân tích, đánh giá do chính tôi thực hiện trên cơ sở các nguồn số liệu đã thu thập được. Các tài liệu tham khảo trong luận án là cơ sở lý luận để đánh giá tổng quan, so sánh, phân tích và thảo luận đã được trích dẫn đầy đủ và đúng theo quy định. Nội dung và kết quả trong luận án đảm bảo độ tin cậy, tính khoa học, không trùng lặp và đã được NCS công bố một phần trên các tạp chí chuyên ngành uy tín trong và ngoài nước. Hà Nội , ngày 15 tháng 04 năm 2023 NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết và PGS.TS. Thái Thanh Bình là những người hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ nghiên cứu sinh trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận án. Nghiên cứu sinh xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Trường cao đẳng kinh tế, kỹ thuật và Thủy sản và các anh, chị công tác tại phòng Công nghệ sinh học của nhà trường đã tạo mọi điều kiện trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, phòng Sau đại học và toàn thể các thầy cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian học tập tại nhà Trường. Xin cảm ơn Uỷ ban nhân dân tỉnh Phú Thọ, Trường Đại học Hùng Vương đã hỗ trợ kinh phí học tập, Phòng Khoa học và Công nghệ tạo điều kiện về thời gian để nghiên cứu sinh học tập và hoàn thành luận án. Xin được cảm ơn Giáo sư Christopher Austin cùng cộng sự tại Trung tâm Công nghệ Genomics, Trường Đại học tổng hợp Deakin, Geelong, Australia đã giúp đỡ NCS thực hiện đề tài luận án. Xin cảm ơn Hội nông dân huyện Vân Đồn, ông Hà Văn Ninh và ông Nguyễn Hồng Quang đã hỗ trợ NCS trong quá trình khảo sát, thu mẫu, tiến hành thí nghiệm. NCS xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và sẵn sàng giúp đỡ trong suốt những tháng năm học tập và thực hiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2023 NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................3 5. Đối tượng, phạm vi giới hạn của luận án............................................................4 6. Những đóng góp mới của luận án .......................................................................4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ..........................................................5 1.1. Giới thiệu chung về tu hài ....................................................................................5 1.1.1. Vị trí phân loại học ...................................................................................5 1.1.2. Phân bố tự nhiên ......................................................................................5 1.1.3. Một số đặc điểm cấu tạo tu hài ................................................................6 1.1.4. Tình hình nuôi và khai thác tu hài ............................................................7 1.2. Nghiên cứu chọn giống theo hướng tăng trưởng ...............................................14 1.2.1. Chọn lọc dựa trên kiểu hình ...................................................................14 1.2.2. Chọn lọc theo kiểu gene .........................................................................15 1.3. Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu nhuyễn thể hai mảnh vỏ ...........16 1.3.1. Chỉ thị phân tử ........................................................................................16 1.3.2. Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu phân loại ...........................21 1.3.3. Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứuxây dựng mã vạch DNA ở một số loài. ....................................................................................................22 1.3.4. Chỉ thị SNP ứng dụng trong nghiên cứu ở các loài hai mảnh vỏ ..........27 1.3.5. Nghiên cứu giải trình tự hệ gene ở loài hai mảnh vỏ .............................28 1.4. Một số nghiên cứu di truyền phân tử ở tu hài ....................................................32
iv CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................35 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................35 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................35 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................36 2.3.1. Điều tra thành phần loài tu hài, hiện trạng nghề nuôi tu hài tại Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài .....................36 2.3.2. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. rhynchaena ..........38 2.3.3. Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài L. rhynchaena .........39 2.3.4. Phương pháp giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài L. rhynchaena ......40 2.3.5. Phương pháp phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài...............................................................................................................41 2.3.6. Phương pháp phân tích, xử lý dữ liệu .........................................................45 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................53 3.1. Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh ...........53 3.1.1. Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn ........53 3.1.2. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn hiện nay ..................................................................................55 3.2. Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. rhynchaena ...........................................57 3.2.1. Khảo sát dữ liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gen 16S rRNA, COI của giống Lutraria trên hệ thống mã vạch quốc tế ..................................57 3.2.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài tu hài .........................61 3.2.3. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L. rhynchaena ................64 3.3. Giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã của tu hài L. rhynchaena ................69 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA ..................................................................69 3.3.2. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã tu hài ......70 3.3.3. Ứơc lượng kích thước hệ gene tu hài .....................................................71 3.3.4. Lắp ráp hệ gene của tu hài L. rhynchaena .............................................72 3.3.5. Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại và tìm kiếm đa hình .....................74
v 3.3.6. Lắp ráp hệ gene phiên mã ......................................................................75 3.3.7. Dự đoán và chú thích hệ gene tu hài ......................................................75 3.3.8. So sánh đặc điểm hệ gene L. rhynchaena với các loài hai mảnh vỏ ......76 3.4. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài ...........................................................................................................79 3.4.1. Giải trình tự ezRAD-Seq ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm .....................................................................................................79 3.4.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu, sàng lọc các SNP ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.................................................................................84 3.4.3. Sàng lọc outlier loci ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm .....................................................................................................86 3.4.4. Sàng lọc chỉ thị SNP tiềm năng ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm .....................................................................................................87 3.4.5. Thiết kế mồi và nhân đoạn trình tự chứa chỉ thị SNP tiềm năng sàng lọc được ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm ...................93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................96 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ...........98 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................99 PHỤ LỤC .............................................................................................................. 1PL
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt tắt BAC Bacterial artificial chromosome Nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo bp Base pair Cặp base BOLDS Barcode Of Life Data Systems Hệ thống cơ sở dữ liệu mã vạch sống BUSCO Benchmarking Universal Single- Bộ trình tự tham chiếu Copy Orthologs BWA Burrowr-Wheerler Alignment Tool Công cụ dóng hàng COI Cytochrome C Oxidase subunit I Vùng gene COI CS Cộng sự CSDL Data base Cơ sở dữ liệu CSIRO Commonwealth Scientific and Tổ chức nghiên cứu khoa học và Industrial Research Organisation công nghiệp khối thịnh vượng chung Dam DNA adenine methylase Enzyme metyl hóa Adenine DNA DNA Acid Deoxyribonucleic Axid Đêoxyribônucleic, DNA ĐVTM Động vật thân mềm EBV Estimated Breeding Value Giá trị chọn giống ước tính EST Expressed Sequence Tag Đoạn trình tự biểu hiện EzRAD Enzyme Restriction-site Associated DNA liên kết vị trí enzym cắt hạn DNA chế FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lương thế giới GWS Genome Wide Selection Chọn lọc dựa trên toàn bộ hệ gen Hi-C High-throughput chromosome Chụp cấu trúc nhiễm sắc thể conformation capture thông lượng cao NCS Nghiên cứu sinh
vii NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới ONT Oxford Nanopore Technology Công nghệ đọc dài PB Pacific Biosciences Khoa học sinh học Thái Bình Dương PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng số lượng RAPD Randomly Amplified Polymorphism Đa hình DNA khuếch đại ngẫu DNA nhiên RNA Ribonucleic Acid Acid Ribonucleic RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế Polymorphism SAM Sequence Alignment/ Map Dóng hàng trình tự/ bản đồ SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotic đơn SPB Sample Purification Beads Hạt tinh sạch mẫu TSLR TruSeq Synthetic Long Read Tổng hợp đọc dài bằng TruSeq WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gene
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện EzRAD ..............41 Bảng 3.1. Thành phần loài tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn ............................53 Bảng 3.2. Hiện trạng nghề nuôi tu hài (L. rhynchaena) tại Vân Đồn năm 2019.....55 Bảng 3.3. Mã số truy cập và kích thước trình tự DNA gene 16S rRNA, COI của các loài trong giống Lutraria trên GenBank ................................58 Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của tu hài L. rhynchaena với trình tự DNA của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%) ................................................................................59 Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene COI của tu hài L. rhynchaena với trình tự gene COI của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%) ........................................................................................60 Bảng 3.6. Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene 16S rRNA (437 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu ........................................65 Bảng 3.7. Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene COI (615 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu .................................................66 Bảng 3.8. Kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài (L. rhynchaena) .............70 Bảng 3.9. Kết quả giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài (L. rhynchaena) ..........71 Bảng 3.10. Kết quả lắp ráp và chú thích hệ gene tu hài ........................................73 Bảng 3.11. Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng giữa hai nhóm tu hài ..........................................................................................79 Bảng 3.12. Tóm tắt kết quả xử lý giải trình tự ......................................................82 Bảng 3.13. Thống kê SNP trong 12 gene liên quan tính trạng tăng trưởng ở tu hài ...85 Bảng 3.14. Thông tin về SNP sau sàng lọc ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm ............................................................................86 Bảng 3.15. Kết quả xử lý dữ liệu trình tự dựa trên hệ gene tham chiếu (dDocent và Stacks) và contig của nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm ............................................................................87
ix Bảng 3.16. Số lượng biến dị phát hiện ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh, tăng trưởng chậm và kiểu biến dị phân tử ...........................................90 Bảng 3.17. Thông tin SNP tiềm năng cho nhóm tu hài tăng trưởng nhanh ..........93 Bảng 3.18. Thông tin SNP tiềm năng cho nhóm tu hài tăng trưởng chậm ............93 Bảng 3.19. Thông tin cặp mồi SNP và sản phẩm khuếch đại ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm .......................................94
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tu hài (Lutralia rhynchaena, Jonas 1844) thu tại Vân Đồn, Quảng Ninh ...........................................................................................5 Hình 1.2. Bản đồ thu mẫu và mật độ tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn, Quảng Ninh ...........................................................................................6 Hình 1.3. Tình hình khai thác thủy sản trên thế giới .............................................8 Hình 1.4. Quy trình tóm tắt xây dựng mã vạch DNA .........................................24 Hình 1.5. Sơ đồ sự phát triển của công nghệ giải trình tự gene ..........................31 Hình 2.1. Màu nucleotide cơ sở sử dụng hiển thị mã vạch DNA .......................39 Hình 2.2. Sơ đồ các bước giải trình tự hệ gene từ mẫu mô cơ tu hài L. rhynchaena ..........................................................................................39 Hình 2.3. Sơ đồ các bước giải trình tự hệ gene phiên mã từ mô tiêu hóa của tu hài L. rhynchaena ............................................................................40 Hình 2.4. Sơ đồ các bước giải trình tự RAD xác định chỉ thị phân tử SNP ở nhóm tu hài (L. rhynchaena) tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm ....42 Hình 2.5. Phản ứng Dam methyl hóa enzyme.....................................................43 Hình 2.6. Phản ứng Dam methyl hóa bằng enzyme giới hạn MboI và Sau3AI .................................................................................................43 Hình 2.7. Quy trình chọn lọc các đoạn DNA có kích thước mục tiêu ................44 Hình 2.8. Cấu trúc của adapter sử dụng trong giải trình tự Illumina ..................44 Hình 2.9. Các bước tiến hành sàng lọc SNP theo qui trình Stacks .....................50 Hình 3.1. Hình dạng và màu của xi phông ở tu hài.............................................54 Hình 3.2. Kết quả truy vấn trình tự gen 16S rRNA của giống Lutraria bằng công cụ Megablast ...............................................................................58 Hình 3.3. Kết quả MEGABLAST sử dụng trình tự truy vấn gene COI của các loài thuộc giống Lutraria ...............................................................60 Hình 3.4a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích trình tự gen 16S rRNA sử dụng thuật toán ML của chương trình MEGAX ..............................................................................................61
xi Hình 3.4b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene 16S rRNA sử dụng thuật toán BI của chương trình BEAST ................................................................................................62 Hình 3.5a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene COI sử dụng thuật toán ML của chương trình MEGAX ..............................................................................................63 Hình 3.5b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lutraria dựa vào phân tích trình tự gene COI sử dụng thuật toán BI của chương trình BEAST ...63 Hình 3.6. Trình tự mã vạch DNA vùng gene 16S rRNA và mã QR của L. rhynchaena ..........................................................................................66 Hình 3.7. Trình tự mã vạch DNA vùng gene COI và mã QR của L. rhynchaena ..........................................................................................69 Hình 3.8. DNA tổng số tách từ một số mẫu cơ màng áo tu hài trên gel điện di .......70 Hình 3.9. Chỉ số k-mers. (A) với k = 19, (B) với k = 21, (C) với k = 25............71 Hình 3.10. So sánh hệ gene tu hài (L. rhynchaena) với các loài hai mảnh vỏ đã được công bố (tính hoàn chỉnh của BUSCO, ước tính kích thước hệ gene so với lắp ráp và nội dung lặp lại) ...............................77 Hình 3.11. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu tu hài tăng trưởng nhanh (giếng N1 – N5), tăng trưởng chậm (giếng C1-C5), giếng M: Marker (thang chuẩn DNA). ..........................................................79 Hình 3.12A. Kiểm tra chất lượng theo từng vị trí base của bộ dữ liệu giải trình tự RAD-Seq ở tu hài tăng trưởng nhanh với bộ trình tự đọc xuôi (A) ........81 Hình 3.12B. Kiểm tra chất lượng theo từng vị trí base của bộ dữ liệu giải trình tự RAD-Seq ở tu hài tăng trưởng chậm với bộ trình tự đọc ngược (B) ........82 Hình 3.13. Phân bố contig giữa tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm sau kết nối ..................................................................................83 Hình 3.14. Số lượng SNP ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm ....84 Hình 3.15. Tỉ lệ định vị trình tự ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm lên hệ gene tham chiếu bằng dDocent ...........................88
xii Hình 3.16. Tỉ lệ định vị trình tự ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm lên hệ gene tham chiếu bằng Stacks ..............................88
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ưa sống ở vùng nước biển ấm, từ 18-30oC, độ mặn trong khoảng từ 25-30‰ [11]. Tu hài chủ yếu lọc ăn mùn bã hữu cơ, tảo khuê và sinh vật phù du [10]. Ở Việt Nam, tu hài phân bố trong tự nhiên cũng như được nuôi nhiều ở vùng biển của tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng và tỉnh Khánh Hòa. Ước tính tổng diện tích mặt nước nuôi tu hài vào khoảng 1.000 ha, sản lượng nuôi đạt khoảng 2.621,6 tấn, thu nhập ước tính trên 200 tỷ đồng/năm [13]. Thịt tu hài có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm và khoáng chất, đặc biệt trong thịt tu hài có chứa nhiều axit amin không thay thế [5]. Những năm gần đây, nhu cầu tiêu thụ tu hài ngày càng tăng, hiệu quả kinh tế mang lại từ nuôi tu hài lớn, nên diện tích nuôi trồng tu hài thương phẩm đã tăng lên đáng kể, nhu cầu con giống chất lượng với số lượng lớn vì thế không ngừng tăng cao. Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản, ước tính mỗi năm thị trường nuôi tu hài thương phẩm cần khoảng 100 triệu con giống cấp I [13]. Trong khi đó, các chương trình chọn giống tiên tiến đối với nghề nuôi tu hài thương phẩm được ứng dụng ở nước ta còn hạn chế, việc sản xuất con giống chủ yếu vẫn theo phương pháp truyền thống, hệ lụy đưa đến là vừa không cung cấp đủ số lượng con giống đạt chuẩn vừa gây ra hiện tượng thoái hóa giống do giao phối cận huyết trong khâu sản xuất truyền thống. Biểu hiện của sự thoái hóa này là sự tăng trưởng chậm hơn, không đồng đều và dễ bị nhiễm bệnh của tu hài nuôi [8]. Theo Quyết định 1664/QĐ-Tg ngày 04/10/2021 về “Đề án phát triển nuôi trồng thủy sản trên biển đến năm 2030 và tầm nhìn đến năm 2045”, nghề nuôi biển nói chung và nuôi nhuyễn thể nói riêng, trong đó có tu hài là hướng tới phát triển sản xuất bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường và hệ sinh thái biển [2]. Để thực hiện được chiến lược này cần chú trọng khai thác và phát triển nguồn giống bản địa có ứng dụng các chương trình chọn giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống, tăng trưởng nhanh và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
2 Chọn giống với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử đang ngày càng được chú trọng và những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống nói chung và với nghề nuôi thủy sản nói riêng đã đạt được những thành tựu đáng tự hào [58]. Với sự ra đời và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới (NGS), nhiều hệ gene sinh vật nói chung, các loài thủy sản nói riêng đã được giải trình tự. Khai thác trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã (transcriptome), nhiều bộ chỉ thị phân tử đã được công bố đang là những công cụ đáng tin cậy và hiệu quả đối với nhà chọn tạo giống trong việc nhanh chóng tạo ra những giống mới cũng như cải thiện di truyền của các giống hiện có [69]. Trong số đó, chỉ thị đa hình nucleotide đơn (SNP) được xem là một trong những chỉ thị chính xác, hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay được áp dụng trong chọn tạo giống liên quan đến năng suất và chất lượng [89]. Với những thế mạnh vượt trội, chỉ thị SNP đang được sử dụng như một công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi nói chung và các loài thủy sản nói riêng [89]. Điều quan trọng là các SNP có thể xuất hiện ở vùng gen mã hóa, tác động trực tiếp đến tính trang quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định mối tương quan giữa SNP và tính trạng nào đó [26]. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhận dạng chính xác loài quan tâm và việc sử dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới có thể cung cấp bộ tư liệu trình tự hệ gene để từ đó phát triển được bộ chỉ thị phân tử nói chung, bộ chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tu hài nói riêng là rất cần thiết và có ý nghĩa cả về lý luận và thực tiễn đối với nghề nuôi tu hài. Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) theo hướng tăng trưởng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá được thành phần loài tu hài, tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài của huyện Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh. - Xây dựng được mã vạch DNA phục vụ nhận dạng chính xác tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844).
3 - Giải trình tự hệ gene tu hài và phát triển được bộ chỉ thị SNP để phục vụ xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử của tu hài (Lutraria rhynchaena). - Phát triển được một số chỉ thị SNP liên quan đến tăng trưởng ở tu hài góp phần phục vụ công tác chọn tạo giống. 3. Nội dung nghiên cứu - Điều tra, đánh giá thành phần loài, hiện trạng và tiềm năng nghề nuôi tu hài của huyện Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh. - Nghiên cứu xây dựng DNA barcoding cho tu hài (Lutraria rhynchaena). - Nghiên cứu giải trình tự hệ gene tu hài và phát triển bộ chỉ thị SNP cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena). - Nghiên cứu phát triển một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học - Đề tài luận án đã cung cấp được một số dữ liệu quan trọng về thành phần loài tu hài tự nhiên phân bố tại Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài ở huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. - Kết quả xây dựng mã vạch DNA của tu hài là cơ sở khoa học quan trọng để nhận dạng chính xác loài tu hài phục vụ trực tiếp cho đề tài luận án về lấy mẫu nghiên cứu giải trình tự hệ gene. - Dữ liệu trình tự hệ gene của tu hài trong kết quả của đề tài luận án là có giá trị đối với khoa học nghiên cứu hệ gene, là cơ sở để khai thác và phát triển bộ chỉ thị phân tử cho các nhà nghiên cứu chọn tạo giống tu hài. - Một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tu hài được phát hiện là có giá trị khoa học ứng dụng đối với công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Mã vạch DNA cung cấp công cụ phân tử có thể nhận dạng chính xác tu hài phục vụ nghiên cứu và truy suất nguồn gốc. - Với bộ dữ liệu hệ gene lần đầu tiên cung cấp được hệ gene tham chiếu tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844).
4 - Một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng được phát triển có ý nghĩa phục vụ công tác chọn tạo giống tu hài theo hướng tăng trưởng nhờ chỉ thị phân tử. 5. Đối tượng, phạm vi giới hạn của luận án - Đối tượng nghiên cứu: Tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) tại Vân Đồn, Quảng Ninh. - Phạm vi giới hạn của luận án: + Nghiên cứu thành phần loài, hiện trạng và đánh giá tiềm năng của nghề nuôi tu hài tại vùng biển Vân Đồn, Quảng Ninh. + Nghiên cứu xây dựng DNA mã vạch loài tu hài vòi trắng sử dụng trình tự vùng gene COI và 16S rRNA của các loài tu hài đã được công bố trên ngân hàng gene. + Giải trình tự toàn bộ hệ gene của tu hài vòi trắng thu tại Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh và của tu hài tăng trưởng nhanh, tăng trưởng chậm bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới, NGS. + Sàng lọc và phát hiện bộ chỉ thị SNP cho xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử; một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 6. Những đóng góp mới của luận án - Luận án đã đánh giá được thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng của nghề nuôi tu hài tại Vân Đồn, Quảng Ninh. - Xây dựng được mã vạch DNA của tu hài dựa trên các trình tự gene 16S rRNA và COI, cung cấp công cụ để nhận dạng và phân loại chính xác loài tu hài. - Giải trình tự hệ gene bằng kỹ thuật NGS và công bố hệ gene tu hài (Lutraria rhynchaena) trên GenBank đã góp phần cung cấp dữ liệu hệ gene tham chiếu, phục vụ nghiên cứu khai thác dữ liệu hệ gene tu hài. - Qua sàng lọc dữ liệu hệ gen, đã phát hiện được 11 SNP liên quan đến tăng trưởng phục vụ cho công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng.
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu chung về tu hài 1.1.1. Vị trí phân loại học Ngành: động vật thân mềm (Mollusca Linnaeus, 1758 Lớp: hai mảnh vỏ (Bivalvia Linnaeus, 1758) Bộ: ngao (biện mang) Veneroida Bieler R., 2010 Họ: vọp Mactridae Lamarck, 1799 Giống: Lutralia Lamarck, 1799 Loài: Lutralia rhynchaena, Jonas 1844 (Tên đồng danh L. philippinarum Reeve, L. philippinarum Deshayes), Loài Lutralia rhynchaena (Jonas 1844), có tên tiếng Việt là tu hài vòi trắng và tên tiếng Anh là Snout Otter Clam hay Otter Clam. Hình 1.1. Tu hài (Lutralia rhynchaena, Jonas 1844) thu tại Vân Đồn, Quảng Ninh 1.1.2. Phân bố tự nhiên Trên thế giới, tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển phía Tây và Nam nước Úc, một số nước châu Á như: Trung Quốc, Thái Lan, Philippine và vùng Bắc Mỹ [10]. Tu hài được coi là nguồn thực phẩm đặc sản của châu Á cung cấp cho các thị trường lớn bao gồm Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông và Nhật. Ở Việt Nam, tu hài phân bố chủ yếu ở vùng biển phía Bắc quanh các đảo nhỏ tương đối xa bờ, nơi có nguồn nước trong và sạch, độ mặn cao và ổn định từ 25 ‰
6 đến 30 ‰, có nền đáy là cát, cát sỏi nhỏ, cát sỏi có pha rất ít bùn, cát pha mảnh vỏ san hô hoặc vỏ động vật thân mềm ở vùng biển thuộc Vịnh Lan Hạ, đảo Cát Bà - TP. Hải Phòng đến huyện đảo Vân Đồn - Quảng Ninh, nơi có độ sâu của thủy triều từ 10-15 m [11]. Ở vùng biển Quảng Ninh tập trung chủ yếu ở Vịnh Hạ Long, Vịnh Bái Tử Long và phía Bắc đảo Cát Bà. Ở Hải Phòng, tu hài tập chung phân bố ở phía Đông của đảo Cát Bà, đến hòn Đá Mài và phân bố từ vùng đảo Cây Khế Đông đến đảo Cống Tây, khu vực này phân bố rộng hơn 100 ha với trữ lượng lớn từ 70-100 tấn/năm [11]. Hình 1.2. Bản đồ thu mẫu và mật độ tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn, Quảng Ninh 1.1.3. Một số đặc điểm cấu tạo tu hài Tu hài có kích thước khi trưởng thành từ 7- 12cm, hình bầu dục, có màu vàng nâu. Cơ thể được bảo vệ bởi hai tấm vỏ đều nhau, hai vỏ khi khép thường