Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:137

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa C. roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don ) LU N ÁN TI N S SINH HỌC Thái Nguyên - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 LU N ÁN TI N S SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm 2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí khoa học công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Bùi Thị Hà
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã chỉ bảo, động viên và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và công tác. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 02 năm 2018 TÁC GIẢ Bùi Thị Hà
iii MỤC LỤC Lời cam đoan…………………………………………………................. i Lời cảm ơn………………………………………………………..…....... ii Mục lục………………………………………………………..………… iii Danh mục những chữ viết tắt trong luận án…………………………….. vi Danh mục bảng trong luận án…………………………………………… ix Danh mục hình trong luận án…………………………………………… xi MỞ ĐẦU…………………………………………………...…………… 1 1.Đặt vấn đề……………………………………………………………. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………….. 2 3. Nôi dung nghiên cứu………………………………………………..... 2 4. Những đóng góp mới của luận án………………………………...….. 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án…………………….. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………..... 4 1.1.Alkaloid ………………………………………………..………….. 4 1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật........................................................... 4 1.1.2. Alkaloid ở cây dừa cạn…………………………………………... 6 1.2. Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của enzyme DAT ở cây dừa cạn.. 10 1.2.1. Quá trình sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn…………...…….. 10 1.2.2. Hoạt động của enzyme DAT và gen DAT................................... 16 1.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.................... 18 1.3.1. Nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn bằng phương pháp
iv nuôi cấy mô tế bào thực vật……………………...................................... 18 1.3.2. Nâng cao hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật chuyển gen………. 21 Chƣơng 2. V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu .………………………………………………. 27 2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………………. 27 2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector………………………………. 27 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu………………………... 27 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 27 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án……………………. 28 2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….. 29 2.3.1. Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 29 2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 33 2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá..................... 37 2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn...................................... 38 2.3.5. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua A.tumefaciens............................................................................................. 43 2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen......................................... 45 2.3.7. Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 49 2.3.8. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 49 Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LU N………………………….... 50 3.1. Đặc điểm của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn.......................... 50 3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen
v CrDAT………………………………………………………………………….. 50 3.1.2. So sánh trình tự nucleotite của gen CrDAT............................. 52 3.2. Thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá 56 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT……. 56 3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen........ 61 3.2.3. Thảo luận kết quả thiết kế và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 67 3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn................................................................................................ 70 3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn…………………………………… 70 3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen gus………………... 76 3.3.3. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn ..................................... 82 3.4. Kết quả chuyển gen CrDAT và tạo cây dừa cạn chuyển gen...................... 87 3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyên gen.. 87 3.4.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ gen của các cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T0................................. 89 3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1................. 92 3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cường biểu hiện gen CrDAT ở cây dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 96 K T LU N VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………... 100 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIỆN QUAN Đ N LU N ÁN…. 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 102 PHỤ LỤC……………………………………………………………... 119
vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VI T TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AS Acetosyringone A. Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A. Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes BAP Benzylaminopurine 35S Promoter CaMV 35S bp base pair Cặp bazơ nitơ cs cộng sự Môi trường đồng nuôi CCM Cocultivation medium cấy DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary DNA DNA bổ sung Cetyltrimethyl ammonium CTAB Bromide Cathanthus roseus Deacetyl Gen CrDAT CrDAT vindoline 4-O-acetyltransferase DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli Ethylene diamine tetraacetic EDTA acid Enzyme-linked immunosorbent Phản ứng ELISA ELISA assay GM Germination Medium Môi trường tái sinh gus β-Glucuronidase IAA Indole Acetic acid Isopropyl β-D-1- IPTG thiogalactopyranoside
vii Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige và Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang Phản ứng chuỗi PCR Polymerase chain reaction polymerase RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase Đoạn DNA được chuyển T-DNA Transfer DNA vào thực vật Các thế hệ cây chuyển T0, T1 gen Cây chuyển gen tái sinh T0 từ chồi trong ống nghiệm Hạt của cây chuyển gen T1 T0 nảy mầm thành cây
viii T1 TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type Cây không chuyển gen X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galacto-pyranoside WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu......................................... 30 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR............................................................ 31 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng........ 32 Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn................................... 32 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng BamHI…………………… 33 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI/ NcoI………………. 35 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII........................... 36 Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen 52 CrDAT............................................................................................................... Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 và protein mang mã số AAC99311 trên Ngân 55 hàng Gen................................................................................................ Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc 63 lá................................................................................................................... Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ đoạn 71 thân mang mắt chồi bên…………………………………………………….. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự kết hợp BAP 1,0mg l với IBA đến sự phát sinh 72 chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên…………. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của 74 chồi từ nách lá mầm……………………………………………………........ Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg l và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm……………………………..…............. 75
x Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen gus 77 tạm thời khi lây nhiễm qua nách lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên........ Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus. 78 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm 80 thời gen gus ................................................................................................... Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến chọn lọc mẫu chuyển gen....... 81 Bảng 3.12. Kết quả chuyển gen gus vào dừa cạn........................................... 83 Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào mẫu dừa cạn hoa hồng tím.. 89
xi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus………………………….. 7 Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp các terpenoid indole 11 alkaloid (TIA)……........................................................................................ Hình 1.3. Công thức cấu tạo của viblastine và vincristine............................ 15 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………….... 29 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT …………….... 34 Hình 2.3.Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây dừa cạn qua nách lá mầm... 43 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT………... 50 Hình 3.2. Trình tự nucleotide của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn mẫu 53 TN1, TN2 và trình tự mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen quốc tế.. Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn 54 TN1, TN2 và của protein mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen. .... Hình 3.4. Kết quả cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp 57 enzyme giới hạn NcoI và NotI……………………....................................... Hình 3.5. Kết quả cắt mở vòng vector pRTRA7 3………………………… 58 Hình 3.6. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pRTRA7 3-CrDAT………………... 59 Hình 3.7. Kết quả tạo vector chuyển gen pBI121-CrDAT............................. 60 Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả 61 điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR......................................................... Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc 62 lá chuyển gen.......................................................................................................... Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen
xii CrDAT trong các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng…………………..... 64 Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các dòng thuốc lá chuyển gen 65 CrDAT................................................................................................. Hình 3.12. Kết quả phân tích Western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen 67 CrDAT................................................................................................. Hình 3.13. Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt dừa cạn 70 Hình 3.14. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm… 73 Hình 3.15. Sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ nách 74 lá mầm dưới ảnh hưởng của sự kết hợp BAP với IBA…….......................... Hình 3.16. Kết quả biểu hiện tạm thời gen gus.............................................. 77 Hình 3.17. Kết quả biểu hiện gen gus ở cây dừa cạn chuyển gen.................. 84 Hình 3.18. Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi 85 khuẩn A. tumefaciens..................................................................................... Hình 3.19. Hình ảnh biến nạp và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen............... 88 Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ 90 các cây dừa cạn chuyển gen........................................................................... Hình 3.21. Kết quả phân tích Southern blot DNA tổng số các cây dừa cạn 91 chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin.................... Hình 3.22. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen 93 và cây đối chứng không chuyển gen.............................................................. Hình 3.23. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT của 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1và cây đối chứng không chuyển 94 gen.......................................................................................................................
xiii Hình 3.24. Các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen.......................................................................................... 95 Hình 3.25. Hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở 96 thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen……………………………..
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều căn bệnh nguy hiểm như ung thư, AIDS, tiểu đường, thoái hóa khớp, viêm gan B, C. Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người, đến năm 2014 đã có hơn 90 triệu người mắc ung thư và hàng năm có hơn 8 triệu người chết vì ung thư [41]. Bệnh ung thư đang gia tăng ở trẻ em. Tại Mỹ, năm 2016 có hơn 10 nghìn trẻ mắc ung thư từ sơ sinh đến 14 tuổi và có khoảng hơn một nghìn trẻ sẽ chết vì căn bệnh này [43]. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển thuốc chữa các bệnh ung thư là vấn đề cấp bách hiện nay. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những loại cây dược liệu quý. Cây dừa cạn có khả năng sản xuất các indole alkaloid có dược tính quan trọng và ứng dụng trong sản xuất các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trong điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp và một số bệnh ung thư khác. Trong dân gian, dừa cạn được sử dụng trị cao huyết áp, bệnh đái tháo đường, điều hòa kinh nguyệt, chữa tiêu hóa kém và chữa lị, lợi tiểu khá mạnh, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, tẩy giun, chữa sốt cao [12]. Trong tất cả các alkaloid thực vật, terpenoid indole alkaloid (TIA) là một nhóm quan trọng chứa hơn 3000 loại hợp chất có cấu trúc đa dạng và được tìm thấy ở 8 họ thực vật [119]. Trong đó, các loài cây có nguồn gốc từ họ mã tiền (Loganiaceae), họ trúc đào (Apocynaceae) và họ cà phê (Rubiaceae) chứa hàm lượng alkaloid cao [39]. Dừa cạn có chứa 2 loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư [105]. Vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế bào và do vậy ngăn cản sự tăng số lượng tế bào. Ngoài ra, một số TIA khác như ajmalicine và serpentine được sử dụng để điều trị rối loạn tuần hoàn [105]. Quá trình chuyển hóa tổng hợp
2 các TIA ở cây dừa cạn là một quá trình phức tạp, trải qua nhiều phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme, các chất điều hòa và các chất vận chuyển [118]. Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn tự nhiên rất thấp [76], vì vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp alkaloid là rất quan trọng. Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn. Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme DAT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng vinblastine và vincristine trong dừa cạn được nâng cao. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa C. roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu thu thập thông tin về gen CrDAT, thiết kế cặp mồi PCR nhân bản đoạn gen CrDAT, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của đoạn gen CrDAT. 3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen CrDAT và đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá. 3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumafaciens ở cây dừa cạn. 3.4. Nghiên cứu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn, phân tích cây chuyển gen và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển CrDAT ở cây dừa cạn.
3 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện gen CrDAT ở cây thuốc lá và cây dừa cạn, cụ thể là: 1) Đã phân lập được gen CrDAT từ mRNA của cây dừa cạn, gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid. 2) Xây dựng được quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 (T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 lần đến 15,17 lần so với đối chứng không chuyển gen. 3) Protein tái tổ hợp rCrDAT được biểu hiện trên cây thuốc lá và trên cây dừa cạn chuyển gen, kết quả biểu hiện mạnh gen CrDAT được kiểm chứng bằng Western blot và ELISA. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn màu hoa hồng tím và màu hoa trắng thu thập tại Thái Nguyên. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid của cây dừa cạn. Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cùng với 2 trình tự gen công bố trên Ngân hàng gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học. Về mặt thực tiễn Các trình tự gen CrDAT được phân lập, cấu trúc vector chuyển gen, các dòng cây chuyển gen góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid trong cây dược liệu nói chung và cây dừa cạn nói riêng. Kết quả nghiên cứu đã mở ra triển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme vào việc nâng cao hàm lượng dược chất trong cây dược liệu.
4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ALKALOID 1.1.1. Vai trò của alkaloid thực vật Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi có trong động vật, có dược tính mạnh. Ngoài carbon, hydro và nitơ, alkaloid cũng có thể chứa oxy, lưu huỳnh và các yếu tố khác như clo, brom, và phospho [118]. Alkaloid được sản xuất bởi một lượng lớn các sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Trong lĩnh vực y học, alkaloid cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và đặc biệt bao gồm cả thuốc chống sốt rét (quinine), chữa trị bệnh hen suyễn (ephedrine), chống ung thư (homoharringtonine), thuốc an thần (galantamine) [54], giãn mạch (vincamine), chống loạn nhịp (quinidine), giảm đau (morphine), kháng khuẩn (chelerythrine) [37],[38], chữa bệnh Alzhemimer [86] và thuốc chữa huyết áp (piperine) [85]. Ranh giới giữa alkaloid và các hợp chất tự nhiên có chứa nitơ khác không rõ ràng. Các hợp chất như amino acid, protein, nucleic acid, amin và các loại thuốc kháng sinh thường không được gọi là alkaloid. Các hợp chất tự nhiên có chứa nitơ ở vị trí exocyclic (mescaline, serotonin, dopamine …) được phân loại là hợp chất amin, không gọi là alkaloid [84]. Các nghiên cứu về alkaloid bắt đầu vào thế kỷ XIX. Năm 1804 - 1805, ở Pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế được dạng muối, đồng thời chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ cây canhkina (thuộc họ cà phê) người ta đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino”. Sau đó hai nhà hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và cinchonin. Năm 1918, người ta đã phát hiện ra alkaloid của họ mã tiền là strycnin và bruxin và
5 cũng là năm phát hiện cafein trong chè, cà phê, sau đó là nicotin trong thuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện, cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 loại alkaloid khác nhau, trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học. Hiện nay, số loại alkaloid đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [74]. So với các thành phần khác của các hợp chất tự nhiên, alkaloid được đặc trưng bởi sự đa dạng về cấu trúc và không có sự phân loại thống nhất. Phương pháp phân loại alkaloid đầu tiên trong lịch sử dựa vào nguồn gốc tự nhiên là phổ biến. Việc phân loại không dựa vào cấu trúc hóa học của alkaloid, cho nên phương pháp trên được coi là lỗi thời [118]. Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Khi còn ít thông tin về quá trình sinh tổng hợp alkaloid, các loại alkaloid được gộp lại thành nhóm theo tên của các hợp chất đã biết, hay gọi tên dựa theo nhóm động vật, thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid. Ví dụ các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid. Khi có thông tin và hiểu biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể, việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và nổi bật nhất trong quá trình tổng hợp. Trong giới thực vật bậc cao, người ta đã xác định được một số cây dược liệu chứa alkaloid như: cây ba chạc, bách bộ, bình vôi, cà độc dược, cà phê, canhkina, cau, lá ngón, chè, cỏ nhọ nồi, dừa cạn, đại, hoàng liên, hoàng liên gai, hồ tiêu, khổ sâm, kim tiền thảo, ma hoàng, mộc hoa trắng, mộc hương, ớt, ô đầu phụ tử, sen, táo nhân, thuốc lá, thuốc phiện, tỏi độc, trinh nữ hoàng cung, vối. Điểm chung của các loài cây dược liệu này là alkaloid có hàm lượng rất thấp và khó tách chiết, nhưng lại có giá trị rất lớn đối với y học và ngành dược phẩm [83]. Trong cơ thể thực vật, alkaloid là những chất chuyển hóa thứ cấp, là sản phẩm cuối cùng trong quá trình chuyển hóa ở thực vật. Một số các alkaloid thực